转化子筛选方法

所谓转化子就是导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞表现新的遗传性状。将经转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体（transformant），即带有异源DNA分子的受体细胞。 

1.a互补

所谓基因内互补作用，在LacZ体系中,是指二个彼此互补的突变基因（突变体1缺失LacZ近操作基因区段LacI；突变体2带有完整的近操纵基因而无β-半乳糖苷酶活性），它们编码产生的无活性的多肽产物，但由于二个突变体之间通过α肽互补作用可呈现有功能的β-半乳糖苷酶活性, 进而可分解底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）而产生半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-氯-青定蓝, 使菌落呈现出蓝色反应。然而，当外源基因DNA片段插入载体中LacZ α肽区段的多克隆位点后, 就会阻断α序列的读码结构, 使其编码的α肽失去活性, 使重组子所在的细菌不能完成α-互补, 因此带有外源基因重组子的细菌形成白色菌落。根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，可以检测和筛选出携有外源基因重组子克隆。此法又称蓝白筛选法。

2.杂交筛选

1.原位杂交    

   该法是从基因组文库中筛选目的基因的首选方法。　将噬菌体感染形成的噬菌斑影印在纤维膜上变性 带有目的基因的放射性DNA或cDNA作探针进行杂交放射性自显影 杂交信号（黑点）对应的噬菌斑即为阳性克隆。

   菌落印迹原位杂交的优点是：适于高密度菌落的筛选,对于噬菌斑平板,它可以连续影印几张同样的纤维滤膜,获得数张同样的DNA印迹。因此，能够进行重复筛选，效率高，可靠性强，而且可以连续使用两种或数种探针筛选同一套重组体DNA，是一种最常规的检测手段。

2. 斑点杂交

1)重组体DNA或RNA抽提出来。

2)抽提纯化, 蛋白质、 杂DNA等减少, 所以能得到更为确切的结果, 既可用于定性,对拷贝数进行相对定量。

3. Southern blot杂交法

   原位杂交与斑点杂交都只能鉴定整个重组子中是否会有与探针互补的同源片段, 而Southern blot杂交能将同源片断定位于基因。

3.插入失活

  根据载体分子所提供的表型特征,选择重组体DNA分子的遗传选择法,可适用于大量群体的筛选,因此是一种比较简单而又十分有效的方法。在基因工程中使用的所有载体分子,都至少含有一个选择标记。质粒常有抗生素抗性基因,如氨苄青霉素抗性基因（Ampr）、四环素抗性基因（Tetr）、卡那霉素抗性基因（Kanr）根据载体分子所提供的选择性标记进行筛选,是获得重组体DNA分子必不可少的条件之一。 在实际操作中,最典型的方法是使用抗药性标记的插入失活作用,或是β-半乳糖苷酶基因的显色反应,将重组体DNA分子的转化子同非重组的载体转化子区别开来.而对于λ噬菌体的置换型载体来说,λ噬菌体头部外壳蛋白容纳DNA的能力是有一定限度的。其包装能力应控制在野生型λDNA长度的75%-105%之间（36-51kb），这样才能形成噬菌斑。因此，包装这一特性，保证了体外重组所形成的有活性的λ重组体分子，一般都应带有外源DNA的插入片段，噬菌斑的形成本身就是λ重组体的一种筛选特征。由于这些方法都是直接从平板上筛选，所以又称为平板筛选法。

抗药性标记插入失活筛选法：

1.以pBR322质粒为例

（1）pBR322质粒的一般特性。

     在pBR322质粒上有两个抗生素基因，Ampr基因内有一个PstⅠ性核酸内切酶的唯一识别位点，Tetr基因内有BamHⅠ和SalⅠ两种性核酸内切酶单一识别位点。

（2）筛选重组体的原理。

     在Ampr和Tetr这两个基因内的任一插入作用，都会导致Ampr基因或Tetr基因出现功能性失活，于是，所形成的重组质粒都将具有AmpsTetr或Amprtets的表型。 当外源DNA片段插入pBR322质粒DNA的BamHⅠ或SalⅠ位点时，抗四环素基因失活（Tetr  Tets ），重组体转化子必定具有AmprTets表型。因此，将转化菌先涂布在含有Amp的琼脂平板上，并将存活的Ampr菌落原位影印到另一个含有Tet的琼脂平板上，凡是在Amp平板上生长，而不在Tet平板上生长的菌落，就必定是已经插入了外源DNA片段的重组质粒转化子克隆.

同样,在pBR322质粒的Ampr基因序列中,利用PstⅠ性核酸内切酶识别位点,插入外源DNA片段,也能应用插入失活作用检测重组质粒,当然,所挑选的菌落就应该是具有AmpsTetr的表型。

4.小量提取质粒酶检测

通常采用碱裂解法提取小量质粒酶。在pH 12.0-12.6碱性环境中，蛋白质和染色体DNA发生变性，染色体氢键断裂双螺旋结构解开，而质粒DNA随大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离。将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。