4种小鼠肠上皮细胞分离培养方法的比较_孙秀梅

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．）Ｖｏｌ．４１Ｎｏ．５

Ｍａｙ　２

０１３网络出版时间：２０１３－０５－０２　１

０：５４网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．

ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３９０．Ｓ．２０１３０５０２．１０５４．０１３．ｈｔｍｌ４种小鼠肠上皮细胞分离培养方法的比较

　［收稿日期］　２０１２－０８－

１１　［基金项目］　国家自然科学基金项目（

３１００１０１９）；安徽省自然科学基金项目（１１０４０６０６Ｍ９１）　［作者简介］　孙秀梅（１９８７－），女，黑龙江富裕人，在读硕士，主要从事反刍动物营养转运研究。Ｅ－ｍａｉｌ：６０５９２３７２８＠ｑｑ．ｃｏｍ　［通信作者］　

王菊花（１９７５－），女，内蒙古锡盟人，副教授，博士，硕士生导师，主要从事动物营养生理研究。李培英（１９５３－）

，女，安徽省泗县人，教授，硕士生导师，主要从事兽医寄生虫与寄生虫病学研究。孙秀梅ａ，程　帆ｂ，刘　维ａ，孙　涛ａ，薛秀恒ｂ，李培英ａ，王菊花ａ

（安徽农业大学ａ动物科技学院，ｂ茶与食品科技学院，安徽合肥２３００３６

）［摘　要］　【目的】比较４种小鼠肠黏膜上皮细胞（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ，ＩＥＣｓ）分离方法的分离效果，建立小鼠ＩＥＣｓ的有效分离培养方法，获得小鼠ＩＥＣｓ原代细胞，为后续研究做准备。【方法】分别采用组织块培养法、嗜热菌蛋白酶消化法、胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化法以及胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ联合消化法共４种方法分离小鼠ＩＥＣｓ并培养，通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法对分离的ＩＥＣｓ进行细胞特异性鉴定，比较４种方法的分离效果。【结果】组织块培养法所获ＩＥＣｓ活力好，增殖能力强，但成纤维细胞污染较严重，细胞纯度低；胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ分离法获得的ＩＥＣｓ数量少且细胞增殖能力弱；嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶Ⅰ联合消化法所获得的小鼠ＩＥＣｓ纯度较高，原代培养时增殖能力稍弱于组织块培养法，但传代后增殖能力趋于稳定。通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法对分离的细胞进行鉴定，结果表明，分离的细胞多数为小鼠ＩＥＣｓ。【结论】嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶Ⅰ联合消化法均适合肠道上皮细胞的分离和培养。

［关键词］　小鼠；

小肠上皮细胞；原代培养；组织块分离培养法；酶学分离培养法［中图分类号］　Ｑ

８１３．１＋

１　［文献标志码］　Ａ［文章编号］　１６７１－９３８７（２０１３）０５－００２５－

０７Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｆｏｕｒ　ｐｒｉｍａｒｙ　

ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒ　ｍｏｕｓｅ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｅｐ

ｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓＳＵＮ　Ｘｉｕ－ｍｅｉ　ａ，ＣＨＥＮＧ　Ｆａｎｂ，ＬＩＵ　Ｗｅｉ　

ａ，ＳＵＮ　Ｔａｏａ

，ＸＵＥ　Ｘｉｕ－ｈｅｎｇｂ，ＬＩ　Ｐｅｉ－ｙｉｎｇａ，

ＷＡＮＧ　Ｊｕ－ｈｕａａ

（ａＣｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｂ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｔｅａ＆Ｆｏｏｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｎｈｕｉ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆ

ｅｉ，Ａｎｈｕｉ　２３００３６，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｆｏｕｒ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｍｏｕｓｅ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉ－ａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　ｃｈｏｏｓｅ　ａｎｄ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ｕｔｉｌｉｔｙ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｏｂｔａｉｎｉｎｇ　

ｍｏｕｓｅ　ＩＥＣｓａｎｄ　ｐｒｅｐａｒｉｎｇ　ｆｏｒ　ｆｕｔｕｒｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ．【Ｍｅｔｈｏｄ】Ｔｈｅ　ｆｏｕｒ　ｍｅｔｈｏｄｓ，ｔｉｓｓｕｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎｅｎｚｙｍｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ＸＩ　ａｎｄ　ｄｉｓｐａｓｅ　Ｉ，ａｎｄ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅＩ　ａｎｄ　ｄｉｓｐａｓｅⅥｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｓｅｐａｒｔｅ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｏｕｓｅ　ＩＥＣｓ．Ｔｈｅ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅｃｅｌｌ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　

ｏｆｔｈｅ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ＩＥＣｓ．【Ｒｅｓｕｌｔ】Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌ－ｔｕｒｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｈａｄ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｂｅｔｔｅｒ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ，ｂｕｔ　ｗｉｔｈ　ｓｅｒｉｏｕｓ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ｐｏｌｌｕｔｉｏｎａｎｄ　ｌｏｗｅｒ　ｐｕｒｉｔｙ．Ｔｈｅ　ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　Ｉ　ａｎｄ　ｎｅｕｔｒａｌ　ｐｒｏｔｅａｓｅⅥｍｅｔｈｏｄ　ｏｎｌｙ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ａ　ｆｅｗ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈ　ｌｏｗｅｒ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｒｍｏｌｙｓｉｎ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｊｏｉｎｔ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅＸＩ　ａｎｄ　ｎｅｕｔｒａｌ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｉ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈｅｒ　ｐｕｒｉｔｙ　

ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｂｉｌｉｔｙ

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｍｏｕｓｅ；ｍｏｕｓｅ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ；ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｕｌｔｕｒｅ；ｔｉｓｓｕｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ；ｅｎｚｙ－ｍｏｌｏｇｙ　ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ

　　肠黏膜上皮细胞（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ，ＩＥＣｓ）是消化道中消化、吸收营养物质的主要功能性细胞，体外培养ＩＥＣｓ已成为深入研究动物肠道功能、病理及细胞分化的重要途径［１－２］。自２０世纪７０年代以来，学者们便开始对鼠的肠上皮细胞进行体外培养和建系研究。１９７８年，Ｑｕａｒｏｎｉ等［３］建立了ＩＥＣ－６细胞株，它保持了肠上皮干细胞未分化的特性。ＩＥＣ－１８也是由Ｑｕａｒｏｎｉ等［３］最先从大鼠回肠隐窝细胞中分离出并成功建系的细胞系，其保持了增殖的隐窝细胞的许多特性［４］，在正常的培养条件下该细胞存活力高，保持了肠隐窝细胞的显型，并且能够分化成肠上皮细胞［５］。之后，研究者逐渐建立胎鼠永久小肠上皮细胞系［６－７］、大鼠ＩＥＣｓ原代培养方法［８］、人类结肠和小肠上皮细胞系［９－１０］及山羊ＩＥＣｓ的单克隆细胞株［１１］。冉新泽等［１２］进一步对大鼠小肠上皮细胞培养体系的影响因素进行了探讨，为开展相关研究提供了重要条件。综观以上研究可知，体外培养ＩＥＣｓ的关键步骤是选材和分离方法，材料一般是胚胎或新生动物［１３］，分离方法目前主要有组织块分离培养法［１１］、螯合剂分离培养法［１４］和酶学分离培养法［１５－１６］，究竟哪种方法更易分离得到形态完整且易贴壁生长的细胞，有待于进一步研究。本研究分析比较了４种小鼠肠上皮细胞原代分离培养方法对肠道上皮细胞贴壁生长的影响，旨在筛选出适宜的分离方法，为今后ＩＥＣｓ的体外培养提供方法支持。

１　材料与方法

１．１　材　料

１．１．１　试验动物　怀孕１６～１９日的ＫＭ雌鼠，８周龄，购自安徽医科大学实验动物中心。１．１．２　试　剂　ＤＭＥＭ－Ｆ１２培养液，Ｔｈｅｒｍｏ公司；胎牛血清（ＦＢＳ）和牛血清白蛋白（ＢＳＡ），杭州四季青公司；小肠细胞培养基：ＤＭＥＭ－Ｆ１２培养基中添加体积分数２％的ＦＢＳ、０．６５ｇ／Ｌ谷氨酰胺（Ｇｌｎ）、０．０１ｇ／Ｌ表皮生长因子（ＥＧＦ）、１００Ｕ／ｍＬ

青霉素、０．１ｇ／Ｌ链霉素、５ｇ／Ｌ胰岛素；青霉素（１００Ｕ／ｍＬ）和链霉素（０．１ｇ／Ｌ），上海生工生物工程有限公司；胶原酶Ⅺ型Ｃ７６５７、中性蛋白酶Ⅰ型Ｄ４８１８、嗜热菌蛋白酶、胰酶工作液和ＤＰＢＳ缓冲液，美国Ｓｉｇｍａ公司；分散液：ＤＭＥＭ－Ｆ１２中添加体积分数２．５％ＦＢＳ和体积分数２％山梨醇，０．２μｍ过滤除菌，４℃保存；细胞鉴定试剂：体积分数４％多聚甲醛，体积分数０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００，体积分数３％Ｈ２Ｏ２，１０ｇ／Ｌ　ＢＳＡ，ＤＡＰＩ（０．００５ｇ／Ｌ）。小鼠肠上皮细胞抗体：一抗为兔抗鼠细胞角蛋白１８（ＣＫ１８），康为世纪公司；免疫组化二抗为羊抗兔ＩｇＧ血清，北京中杉金桥公司。

１．２　方　法

１．２．１　培养皿的准备　取一次性细胞培养皿，加入质量分数０．２％明胶铺满整个皿底，置于３７℃作用３０ｍｉｎ后取出，吸弃明胶，用ＤＰＢＳ洗３次，吸弃ＤＰＢＳ后备用。

１．２．２　上皮细胞的前处理　无菌条件下取出１６～１９日龄胎鼠小肠，在显微镜下剔除肠系膜，将小肠移至培养皿中，用ＤＰＢＳ反复清洗，直到上清液清亮为止，再用含青霉素（３００Ｕ／ｍＬ）和链霉素（０．３ｇ／Ｌ）的无血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２清洗数次。将肠管剪成肉眼可见的碎片，用无血清的ＤＭＥＭ－Ｆ１２清洗后，１　２００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，弃去上清，取沉淀备用。１．２．３　组织块培养法　前处理后，继续剪碎样品成小于１ｍｍ３的碎片，转移至离心管中，加无血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２清洗，用移液管反复吹打，１　２００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ；用ＤＰＢＳ反复清洗沉淀组织块，直至上清液澄清；吸去上清液后，取适量沉淀均匀平铺于皿底，加少许ＦＢＳ，倒置培养皿，于３７℃、含体积分数５％ＣＯ２的培养箱中培养，８ｈ后加完全培养液，继续培养。

１．２．４　嗜热菌蛋白酶消化法　向前处理沉淀中加入适量嗜热菌蛋白酶，３７℃消化３０ｍｉｎ，期间每５ｍｉｎ振荡１次，１　２００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，弃去上清液，沉淀用适量完全培养液重悬，用孔径为２．８４

６

２西北农林科技大学学报（自然科学版）第４１卷

ｍｍ的尼龙网过滤；

取适量滤液接种于培养皿中，培养４８ｈ后换液。１．２．５　胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化法　向前处理沉淀中加入适量胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ，３７℃消化２０ｍｉｎ，用移液吹吸１５０次，

静置１ｍｉｎ，取上清液，重复此步２次；向上清液中加入１０ｍＬ分散液，混匀，１　２００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，弃去上清液，沉淀用分散液重悬，重复此步５～６次，直至上清液澄清且隐窝单位明显为止；最后用完全培养液重悬，接种于培养皿中，培养４８ｈ后换液。１．２．６　胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ联合消化法　操作步骤同１．２．５。１．２．７　小鼠肠上皮细胞的纯化与鉴定　用以上分

离培养法得到的分散细胞经相差贴壁法纯化后，进行免疫组化和免疫荧光鉴定。细胞免疫组化方法如下，

将培养在４孔板的细胞用体积分数４％多聚甲醛固定１５ｍｉｎ，ＤＰＢＳ冲洗后，用体积分数０．５％

Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００ＤＰＢＳ溶液透化２０ｍｉｎ，ＤＰＢＳ冲洗后用体积分数３％Ｈ２Ｏ２孵育５

～１０ｍｉｎ，ＤＰＢＳ冲洗；用山羊抗鼠血清室温封闭１０～１５ｍｉｎ，吸去封闭液，勿洗；加一抗（兔抗鼠ＣＫ１８）工作液，４℃孵育过夜，ＤＰＢＳ冲洗后加二抗（羊抗兔ＩｇＧ血清）工作液，３７℃孵育３０ｍｉｎ，加Ｓ－Ａ／ＨＲＰ，室温或３７℃孵育１０～１５ｍｉｎ，ＤＰＢＳ冲洗，ＤＡＢ显色液显色３０ｓ

后立即用ＤＰＢＳ冲洗，在显微镜下观察。试验同时设阴性对照，以ＤＰＢＳ代替一抗。结果判断：

以细胞膜出现棕黄色着色为阳性，按照Ｌａｃｏｓｔｅ等［１

７］

的分级标准进行分级。细胞免疫荧光步骤参照宋锐等［１８］的方法进行，具体操作简述如下：用体积分数

４％多聚甲醛固定细胞１５ｍｉｎ，ＰＢＳＴ（

含体积分数０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００的ＤＰＢＳ溶液）透化２０ｍｉｎ后，用含１０ｇ／Ｌ　

ＢＳＡ的ＰＢＳＴ孵育３０ｍｉｎ以阻断抗体的非特异性结合，滴加一抗（兔抗鼠ＣＫ１８，按说明书稀释抗体），４℃冰箱过夜；在避光条件下滴加二抗（羊抗兔ＩｇＧ血清），避光孵育１ｈ；ＤＰＢＳ冲洗后加入０．００１ｇ／Ｌ的ＤＡＰＩ染色１ｍｉｎ，ＤＰＢＳ冲洗后在荧光倒置显微镜下观察各种特异性基因的表达情况。

２　结果与分析

２．１　４种分离方法的分离结果

２．１．１　组织块培养法　将组织块剪碎后在显微镜

下能观察到肠绒毛结构（图１Ａ）。用组织块培养法分离小鼠ＩＥＣｓ时，培养２４ｈ左右９０％的组织块周围有细胞辐射，培养３～５ｄ组织块结构几乎消失，

从组织块辐射的细胞汇集成片；从细胞形态来观察，组织块周围有立体感，肠上皮细胞呈圆形且形态饱满，由一层膜状结构包围（图１Ｂ）；部分组织块周围几乎全为成纤维细胞（图１Ｃ）；培养至第１代时，从细胞形态来看，

贴壁细胞是成纤维细胞与肠上皮细胞夹杂生长的混合细胞（图１Ｄ）

。图１　组织块培养法分离小鼠ＩＥＣｓ（×１００

）Ａ．小鼠肠绒毛；Ｂ．组织块辐射的细胞；Ｃ．组织块周围的成纤维细胞；Ｄ．组织块培养法第１代ＩＥＣｓ

Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ＩＥＣｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｂｙ　

ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ（×１００）Ａ．Ｖｉｌｌｕｓ　ｏｆ　ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ　ｉｎ　ｍｏｕｓｅ；Ｂ．Ｃｅｌｌｓ　ｇｒｏｗ　ａｒｏｕｎｄ　ｔｉｓｓｕｅｓ；Ｃ．Ｌａｒｇ

ｅ　ａｍｏｕｎｔｓ　ｏｆ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ａｒｏｕｎｄ　ｔｉｓｓｕｅｓ；Ｄ．Ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ＩＥＣｓ　ｂｙ　

ｔｉｓｓｕｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ２．１．２　嗜热菌蛋白酶消化法　嗜热菌蛋白酶消化

法分离小鼠ＩＥＣｓ结果如图２所示。用嗜热菌蛋白酶消化小鼠肠组织，能获得肠隐窝单位和散细胞，其均能很好地贴壁（图２Ａ）；隐窝单位在２４ｈ内即能辐射出细胞，从形态上看，这些细胞均为ＩＥＣｓ，而贴壁的单个细胞是ＩＥＣｓ和成纤维细胞的混合细胞；

培养４ｄ隐窝单位基本消失，原来的隐窝周围辐射出

大量细胞（图２Ｂ）。分离细胞培养至第１代时，从形态看，ＩＥＣｓ占绝大部分，仅有少量成纤维细胞污染（图２Ｃ）。经过简单纯化后，用嗜热菌蛋白酶消化获得的小鼠ＩＥＣｓ能稳定传代。

７

２第５期孙秀梅，等：４种小鼠肠上皮细胞分离培养方法的比较

图２　嗜热菌蛋白酶消化法分离小鼠ＩＥＣｓ（×１００

）Ａ．分离的肠隐窝单位；Ｂ．分离的肠隐窝单位辐射的细胞；Ｃ．第１代ＩＥＣｓ

Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ＩＥＣｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｂｙ　

ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ　ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ（×１００）Ａ．Ｔｈｅ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｖｉｌｌｕｓ　ｃｒｙｐｔｓ；Ｂ．Ｃｅｌｌｓ　ｇｒｏｗ　ａｒｏｕｎｄ　ｔｈｅ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｖｉｌｌｕｓ　ｃｒｙｐｔｓ；Ｃ．Ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ｇ

ｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ＩＥＣｓ２．１．３　胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化法　用胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化小鼠小肠组织，能获得大量小肠隐窝单位（图３Ａ）。将隐窝单位以适当密度加培养液进行培养，

隐窝单位能很好地贴壁，２４ｈ内隐窝单位即能辐射出细胞；４８ｈ后，

从隐窝单位辐射出的细胞能汇集成片，隐窝单位逐渐消失，从形态上看，这些辐射出的细胞多为ＩＥＣｓ（图３Ｂ）。分离培养至第１代时，ＩＥＣｓ形态明显，

为多角形，有立体感（图３Ｃ）。用胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化法获得的小鼠ＩＥＣｓ能稳定传至第６代

。

图３　胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化法分离小鼠ＩＥＣｓ（×１００

）Ａ．分离的肠隐窝单位；Ｂ．分离的肠隐窝单位辐射的ＩＥＣｓ；Ｃ．第１代ＩＥＣｓ

Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ＩＥＣｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｂｙ　

ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ＸＩ　ａｎｄ　ｄｉｓｐａｓｅ　Ｉ（×１００）Ａ．Ｔｈｅ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｖｉｌｌｕｓ　ｃｒｙｐｔｓ；Ｂ．ＩＥＣｓ　ｇｒｏｗ　ａｒｏｕｎｄ　ｔｈｅ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｖｉｌｌｕｓ　ｃｒｙｐｔｓ；Ｃ．Ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ｇ

ｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ＩＥＣｓ２．１．４　胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ联合消化法　用

胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ联合消化小鼠肠组织，可获得数量较少的散在细胞，

无小肠隐窝单位。此法分离的细胞数量少，原代培养７２ｈ仍不能汇集成片

（图４Ａ）；传至第１代后细胞贴壁能力差，且从细胞形态看，贴壁细胞为ＩＥＣｓ和成纤维细胞的混合细胞（图４Ｂ）

。图４　胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ联合消化法分离小鼠ＩＥＣｓ（×１００

）Ａ．培养７２ｈ的原代ＩＥＣｓ；Ｂ．第１代ＩＥＣｓ

Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ＩＥＣｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｂｙ　

ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　Ｉ　ａｎｄ　ｄｉｓｐａｓｅⅥ（×１００）Ａ．Ｔｈｅ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ＩＥＣｓ；Ｂ．Ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ｇ

ｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ＩＥＣｓ８

２西北农林科技大学学报（自然科学版）第４１卷

２．２．１　小鼠ＩＥＣｓ免疫组化结果　对嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶Ⅰ联合消化法获得的小鼠ＩＥＣｓ进行免疫组化检测，结果表明，阳性细胞的细胞膜染为黄棕色（图５Ａ）；而未用一抗孵育的对照结果呈阴性（图５Ｂ）。因此，初步鉴定分离出的细胞为小肠ＩＥＣｓ细胞。２．２．２　小鼠ＩＥＣｓ免疫荧光鉴定　在荧光倒置显微镜下观察，小鼠ＩＥＣｓ状态正常（图６Ａ）。分离的细胞膜表达ＣＫ１８特异性抗原（图６Ｂ），进一步鉴定为ＩＥＣｓ。分离的细胞核经过ＤＡＰＩ染色后（图６Ｃ），计算１０个视野中阳性细胞率可达（８８．７±１６．４）％。未用一抗孵育的阴性对照细胞未被染色。因此，本试验分离的细胞多数为小鼠ＩＥＣｓ细胞

。

图５　小鼠ＩＥＣｓ免疫组化结果（×４００）

Ａ．细胞膜染色阳性；Ｂ．阴性对照

Ｆｉｇ．５　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ＩＥＣｓ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（×４００）

Ａ．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ；Ｂ．Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏ

ｌ

图６　小鼠ＩＥＣｓ免疫荧光染色结果（×４００）

Ａ．荧光倒置显微镜下ＩＥＣｓ；Ｂ．ＩＥＣｓ细胞ＣＫ１８特异性抗原的检测；Ｃ．ＩＥＣｓ细胞核ＤＡＰＩ染色定位

Ｆｉｇ．６　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ＩＥＣｓ　ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（×４００）

Ａ．ＩＥＣｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｂｙ　ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；Ｂ．Ｔｈｅ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ｏｆ　ＣＫ１８

ｏｆ　ＩＥＣｓ　ｍｅｍｂｒａｎｅ；Ｃ．Ｔｈｅ　ＩＥＣｓ　ｎｕｃｌｅｕｓ　ｓｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ＤＡＰＩ

２．３　４种分离方法分离效果的比较

综合比较本试验中４种方法的ＩＥＣｓ分离培养

效果可知，组织块培养法获得的细胞活性好，但成纤

维细胞污染较严重，今后可以从如何提高细胞纯度

进行深入研究；嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ和

中性蛋白酶Ⅰ联合消化法均能获得完整隐窝单位，

经过培养和简单纯化后，通过细胞免疫化学分析均

得到纯度较高的ＩＥＣｓ，但这２种分离方法所得细胞

连续传代后增殖能力均减弱；胶原酶Ⅰ和中性蛋白

酶Ⅵ联合消化法获得的ＩＥＣｓ数量少，且细胞活力

差。综上可知，嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ和

中性蛋白酶Ⅰ联合消化法分离效果较好，能够获得

纯度较高、活力较强的小鼠肠上皮细胞株。

３　讨　论

本试验小肠组织取自１６～１９日龄胎鼠，因为

此时胎鼠的小肠黏膜组织幼稚、结构疏松，易于消

化，且肠道内无内容物，可避免污染［１１］。本试验采

用组织块培养法和３种酶解法分离肠道上皮细胞，

其中组织块培养法是几种分离方法中最简单的方

９

２

第５期孙秀梅，等：４种小鼠肠上皮细胞分离培养方法的比较法，在分离细胞过程中未经过任何酶的处理，获得的ＩＥＣｓ原代细胞活力好、增殖能力较强，但成纤维细胞污染较严重，纯化过程较为复杂。一些研究者虽已用组织块培养法获得生长状况良好的小鼠［１９］和山羊［１１］ＩＥＣｓ，但均存在同样的缺点。目前对于肠上皮细胞的分离培养，国内外学者多采用酶消化分离法。Ｐｅｒｒａｕｌｔ等［２０］使用噬热菌蛋白酶分离人小肠上皮细胞，结果表明，这种方法分离的ＩＥＣｓ能稳定传代至２６代，可用于人小肠上皮细胞系的建立，并认为嗜热菌蛋白酶用于分离肠上皮细胞具有分离产量高、分离的细胞活力强等特点。张道杰等［１０］用嗜热菌蛋白酶消化分离４～６个月引产胎儿的小肠ＩＥＣｓ，消化２ｈ能分离出绒毛隐窝单位获得人ＩＥＣｓ，因此认为嗜热菌蛋白酶消化法能分离较多的健全绒毛隐窝单位，获得纯度较高的ＩＥＣｓ。本研究用嗜热菌蛋白酶消化小鼠肠组织，得到了大量的肠隐窝单位以及少量散在细胞，这些散在细胞从形态上可判定为ＩＥＣｓ和成纤维细胞的混合物，经过简单纯化后能获得大量ＩＥＣｓ。此法获得的ＩＥＣｓ原代产量高、纯度好、活力强，连续传代后相邻细胞之间的界限模糊，细胞体积变大，出现凋亡现象，增殖能力明显减弱，说明ＩＥＣｓ有一定寿命，这与Ｐｅｒｒａｕｌｔ等［２０］和张道杰等［１０］报道结果一致。

胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化法最初由Ｅｖａｎｓ等［８］用于分离哺乳期大鼠小肠上皮细胞，能获得完整的绒毛和隐窝单位，且上皮细胞仍保持极性。后来，国内外很多学者相继采用此方法分离获得肠完整绒毛和隐窝单位，从而获得了较纯的山羊［２１－２２］、大鼠［１２］和小鼠［２３－２５］ＩＥＣｓ。本试验用胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ消化小鼠肠组织，３７℃消化２０ｍｉｎ即可获得大量肠隐窝单位，经过贴壁生长后，由于都是从肠隐窝单位辐射出的细胞，因此ＩＥＣ纯度最高，几乎没有成纤维细胞污染，且所获得的ＩＥＣｓ与嗜热菌蛋白酶消化法一样，连续传代后细胞增殖能力减弱，证明此细胞并未发生癌变。

胶原酶是一种从细菌中提取的酶，胶原酶Ⅰ消化肠组织时的主要作用是使细胞间质的脯氨酸多肽水解，从而使细胞离散，而对上皮细胞影响不大。Ｅｖａｎｓ等［８］用胶原酶Ⅰ在３７℃下消化大鼠肠组织２ｈ，获得的ＩＥＣｓ中有大量间质细胞污染。戴定威等［１５］用胶原酶Ⅰ和中性酶Ⅰ／胶原酶Ⅺ２种消化法分离大鼠ＩＥＣｓ，结果发现，中性酶Ⅰ／胶原酶Ⅺ联合应用分离效果比较好，而胶原酶Ⅰ虽然消化良好，但消化时间长，提高酶浓度或是延长消化时间虽然能获得更多细胞，但同时也增加了细胞损伤的机会，并易混入肠组织其他杂细胞，导致ＩＥＣ纯度降低，而使用中性酶Ⅰ和胶原酶Ⅺ联合可缩短消化时间，取得更佳的分离效果。本试验采用胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ联合消化法消化肠组织，获得的ＩＥＣ细胞数量少、增殖能力差，这与Ｅｖａｎｓ等［８］和戴定威等［１５］的研究结果一致。

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Ｙｅ　Ｚ　Ｑ，Ｌｉｕ　Ｇ　Ｌ，Ｃｈｅｎ　Ｚ　Ｑ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｒｉｎｅ　ｉｎｔｅｓ－ｔｉｎａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｕａｚｈｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，３５（６）：８２８－８３０．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）

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１０１８．

Ｚｈａｎｇ　Ｄ　Ｊ，Ｊｉａｎｇ　Ｊ　Ｘ，Ｃｈｅｎ　Ｙ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｉｍａｒｙ

ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｒａｂｂｉｔ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｔｈｉｒｄ　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００４，２６（１１）：１０１６－

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Ｋａｎｇ　Ｗ，Ｗａｎｇ　Ｈ　Ｘ，Ｓｈａｏ　Ｔ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉ－

ｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｅｏｎａｔｅ　ｇｏａｔ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ

０

３西北农林科技大学学报（自然科学版）第４１卷

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，４３（１９）：１１－１４．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）［１２］　冉新泽，粟永萍，程天民，等．大鼠小肠上皮细胞培养体系的建立及其影响因素的探讨［Ｊ］．中国现代医学杂志，１９９７，７（５）：８－１１．

Ｒａｎ　Ｘ　Ｚ，Ｓｕ　Ｙ　Ｐ，Ｃｈｅｎｇ　Ｔ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍａｒｙ

ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｒａｔ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｌｉｎｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｄ　ｉｎｖｅｓ－

ｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｆａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎａ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｄｒｅｎ

Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９７，７（５）：８－１１．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）

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Ｄａｉ　Ｄ　Ｗ，Ｗｕ　Ｓ　Ｘ，Ｌｉ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｒａｔ　ｃｏｌｏｎｉｃ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ

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ｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００４，２８（１）：６１－６３．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）

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Ｓｏｎｇ　Ｒ，Ｃａｏ　Ｈ　Ｇ，Ｔａｏ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ　ｉｓｏｌａ－

ｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ｓｐｅｍａｔｏｇｏｎｉａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１０，３２（２）：２８９－２９０．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）［１９］　韩庆广，徐晓燕，赵国琦，等．小鼠小肠上皮细胞的分离培养研究［Ｊ］．动物生态学杂志，２００９，３０（１）：４８－５１．

Ｈａｎ　Ｑ　Ｇ，Ｘｕ　Ｘ　Ｙ，Ｚｈａｏ　Ｇ　Ｑ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｉｌ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ

ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ　ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ

Ａｎｉｍａｌ　Ｅｃｏｌｏｇｙ，２００９，３０（１）：４８－５１．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）

［２０］　Ｐｅｒｒａｕｌｔ　Ｎ，Ｂｅａｕｌｉｅｕ　Ｊ　Ｆ．Ｕｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ　ｔｈｅｒ－ｍｏｌｙｓｉｎ　ｔｏ　ｇｅｎｅｒａｔｅ　ｖｉａｂｌｅ　ｈｕｍａｎ　ｎｏｒｍａｌ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ［Ｊ］．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９６，２２４（２）：３５４－３６４．

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Ｗａｎｇ　Ｈ　Ｘ，Ｋｕａｎｇ　Ｗ，Ｚｈａｏ　Ｇ　Ｑ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ｇｏａｔ　ｉｎｔｅｓ－

ｔｉｎａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ａｎｄ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｏｆ　ＩＥＣ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｅｃｏｌｏｇｙ，２００７，２８（６）：９－１４．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）［２２］　Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ　Ｇ，Ｇｒｏｈｓ　Ｍ，Ｓｔａｎｇｅ　Ｅ　Ｆ，ｅｔ　ａｌ．Ｌｉｍｉｔｅｄ　ｈｅａｔ－ｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ　７２ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｃａｃｏ－２ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ［Ｊ］．Ｄｅ－

ｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｉ．Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏ－

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Ｊｉ　Ｈ　Ｙ，Ｃｈｅｎ　Ｑ　Ｋ，Ｚｅｎｇ　Ｈ．Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，２０１０，１６（９）：１４１７－１４１９．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）

［２４］　Ｈａｕｆｔ　Ｓ　Ｍ，Ｓｗｅｅｔｓｅｒ　Ｄ　Ａ，Ｒｏｔｗｅｉｎ　Ｐ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌ　ｔｈａｔ　ｉｓ　ｕｓｅｆｕｌ　ｆｏｒ　ａｎａｌｙｚｉｎｇ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｎｄ　ｇｅｏ－

ｇｒａｐｈｉｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ　ｄｕｒｉｎｇ　ｆｅｔａｌ　ｄｅｖｅｌｏｐ－

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