一种新的细胞计数方法 磺基罗丹明 染色法

一种新的细胞计数方法磺基罗丹明B 染色法

周思朗,屈艳妮,张　健,汪森明,张积仁3(南方医科大学珠江医院肿瘤中心,广东广州510282)

收稿日期:2005-01-18;　修回日期:2005-03-24

作者简介:周思朗(1972-),男,湖南益阳人,主治医师,博士生.

Email:zhou_silang@163.com

3Corres ponding author,Tel:(020)613199

[摘要]　目的:比较磺基罗丹明B (SRB )法与二苯基溴化四

氮盐(MTT )比色法细胞计数的灵敏性和稳定性。方法:取4种不同类型对数生长期的细胞,调整细胞的密度为1×106

/L,

并按比例稀释为0.039×105～10×105个细胞的梯度。(1)用

SRB 法与M TT 比色法测定各细胞梯度相应A 值,分别分析两

种方法测到的A 值与相应细胞梯度细胞数的相关性。(2)

SRB 法与M TT 比色法各随机取100个A 值,测量其在2、16、24h 及7d 后的A 值,比较这两种方法的稳定性。结果:S RB

法和MTT 比色法测定的A 值与不同细胞系的细胞数目均有极好的相关性。SRB 法测定的结果几乎不随时间而变化;而

MTT 法测定的结果受时间影响较大。结论:SRB 法与MTT 比

色法相比较更适于进行大规模的细胞计数。

[关键词]　磺基罗丹明B;MTT 比色法;细胞计数[中图分类号]　R392.11　　　[文献标识码]　B

　　磺基罗丹明B (sulf orhoda m ine B,SRB )法是继二苯基溴化四氮盐(MTT )比色法后新一代肿瘤药物敏感实验方法,美国肿瘤研究所已用SRB 法替代MTT 比色法进行肿瘤药物敏感实验

[1]

。SRB 法不仅具备有MTT 比色法操作简便、敏感的特

点,而且测量结果不受时间影响,应用于细胞计数理应有更加大的优势。为此,我们利用SRB 法对4种细胞进行了大规模计数,并探讨了其应用前景。

1　材料和方法

1.1　材料　人胃低分化腺癌细胞系FGC85、人胃癌细胞系SGC7901、人红白血病细胞系K562及人急性髓性白血病细胞

系HL60均由本室保存。RP M I 10培养基及新生小牛血清为

GI B CO 公司产品。96孔微量培养板为BECT ON D I CKI N S ON

公司产品。酶联免疫检测仪(E L3llS 型)购自B I O 2TEK 公司。

1.2　方法

1.2.1　细胞系细胞密度梯度配置　取以上对数生长期的4

种细胞系FGC85、SGC7901、K562及HL60,用含150mL /L 灭活新生小牛血清的RP M ll0完全培养液调整细胞密度为1×

109

/L,加于96孔板的第1列各孔中,每孔0.2mL,然后作倍比

稀释,第9列各孔细胞密度为0.039×108

/孔,每密度的细胞均设4个平行孔。

1.2.2　M TT 比色法和SRB 法测定各细胞梯度的吸光度(A )

值　(1)MTT 比色法测定:将96孔板各孔中加入20μL 的

MTT (5mg/mL ),继续培养4h 后,再加入20μL 二甲基亚砜(DM S O )溶解,于波长570n m 处,酶联免疫检测仪测定A 值。(2)SRB 法测定:96孔板细胞培养孔的贴壁细胞,每孔轻柔

加入50μL 经4℃预冷的500mL /L 三氯醋酸,使终浓度为

100mL /L,板置4℃1h,自来水洗5次除去三氯醋酸、培养

液、低分子量代谢物、血清蛋白,空气干燥,存放。悬浮细胞每孔轻柔加入50μL 经4℃预冷的800mL /L 三氯醋酸,静置

5m in 后,板置4℃1h,余同贴壁细胞。干燥后,加4g/L SRB 染色15～30m in,用醋酸洗涤5遍,干燥后,加入10mmol/L Tris 液100μL 溶解,于波长490n m 处,酶联免疫

检测仪测定A 值。(3)数据分析:两种方法测定的4种细胞系各种细胞数目梯度的A 值以4个孔的平均值表示,用Pear 2

s on 相关系数(r )分析MTT 比色法与SRB 法测得的A 值与细

胞实际数量间的相关性。

1.2.3　M TT 比色法与SRB 法稳定性的比较　随机选取2种

方法同时测定的一块96孔板,染色后按0h 、2h 、16h 、24h 及7d 测定其A 值,将2h 、16h 、24h 及7d 所得A 值与0h 测定的A 值相比较,观察不同时间点A 值的变化。

2　结果

2.1　两种方法测定的各细胞梯度A 值与细胞数目的相关性

　MTT 比色法与SRB 法测定不同细胞系各细胞数目梯度的A

值(表1)。两种方法测定的A 值与不同细胞系细胞数目均有极好的相关性,r 值均>0.9,P 值均<0.01。

2.2　SRB 法与M TT 比色法的稳定性比较　在0h 共测定A

值100个。2h 后用M TT 比色法测定的A 值同0h 测定的A 值比较有82%的数据小于或等于5%,24h 后测定降至45%,

7d 后测定则为0。SRB 法于2、16、24h 后测定的结果同0h

测定的A 值相比几乎100%的数据小于或等于5%。说明S RB 法的测定稳定性明显优于MTT 比色法。

3　讨论

SRB 是一种蛋白质结合染料,可与生物大分于中的碱性

氨基酸结合,其颜色的变化与活细胞中的蛋白成正比[2,

3]

;

MTT 比色法以代谢还原M TT 为基础,活细胞的线粒体中存在

脱氢酶,可将黄色的MTT 还原为不溶性的蓝紫色的甲(月替),死细胞此酶消失,M TT 不被还原[4,

5]

。所以虽然M TT

比色法和S RB 法的实验原理不尽相同,但都可以通过测定甲

(月替)与SRB 的颜色变化,间接测定培养液中活细胞数。

细胞系测定方法

细胞数(×108/L)

105 2.5 1.250.6250.3130.1560.0780.039

FGC85SRB 1.630.720.340.240.150.120.110.100.063 MTT 1.320.610.350.220.130.100.090.080.053 SGC7901SRB 1.570.600.320.230.140.110.100.100.063 MTT 1.210.560.310.220.120.090.080.070.043 K562SRB0.740.370.190.070.040.030.020.020.013 MTT0.730.350.170.070.040.030.020.020.013 HL60SRB0.810.380.200.090.050.030.030.020.023 MTT0.720.400.190.080.040.030.020.020.023 3测定的A值与不同细胞系细胞数目相关性P值<0.01.

　　目前,大多数实验室进行细胞培养的生长曲线的测定都采用M TT比色法。该法操作简便,敏感度高,可重复性较好,给细胞培养技术带来了很大的方便。但是M TT比色法有无法克服的弱点[6]:(1)甲(月替)的生成受作用时间的影响,样品较多时测定的A值随时间而变,增加了实验的误差。

(2)对悬浮细胞来说,经M TT染色、用DMS O溶解后,必须将每孔中的细胞吸出,离心去除上清,沉淀用DMS O溶解后再测定A值,操作繁琐。(3)实验中使用的试剂如DM S O等对实验人员有一定的毒副作用。

SRB法的优点:(1)用SRB法对两种贴壁细胞(FGC85与SGC7901)与两种悬浮细胞(K562与HL60)进行细胞计数,其测得的A值与细胞的实际数目有良好的相关性,说明,S RB 法与MTT比色法都是进行各种培养细胞计数比较准确的方法。(2)SRB法先用三氯醋酸固定后,再进行SRB染色作蛋白测定,最后SRB用Tris溶解后也可稳定一个较长的时期,稳定性相对M TT比色法要好。实验中我们发现,甚至7d后,用该法测得的A值仍无明显变化。(3)SRB法是将细胞固定后再染色,故适用于包括悬浮细胞与贴壁细胞所有培养细胞的测定。(4)SRB法不需要使用DM S O等对人体有毒害作用的试剂,较MTT比色法相对安全。所以,SRB法特别适用于大规模的细胞计数。

以A值与SRB的浓度作图时,在A值<2.0时线性关系最好。已知,对有限细胞系进行培养时,其最大的细胞密度大约为1×108/L,无限细胞系则为1×109/L左右。而本实验中我们采用的细胞梯度与绘制细胞生长曲线所需要测定的细胞密度是一致的。对细胞密度为0.039×108～10×108/L的各种细胞系,用SRB法于波长490n m处,测得的A值基本上都在0.01～1.63,恰好在线性关系最好的范围内。个别数值超出线性范围时,可通过适当稀释后重新读数。另外,具体操作中,再选用一个亚适波长以降低A值为更佳,不仅使操作更加方便,而且其准确性并无明显的降低[7]。

综上所述,SRB法克服了MTT比色法成色反应的时间依赖性,细胞固定后可以存放较长时间成批处理,提高了测量细胞生长曲线的效率,减少了误差,使进行大规模细胞培养实验过程更加便利。

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