保护酶测定方法

（1）酶液的提取：

根或胚轴（长约0.5cm）0.5g，加入预冷的提取液3mL和少许石英砂，充分冰浴研磨，然后转入离心管中，再用2mL提取液洗研钵，合并提取液并于4℃下4 000g离心5min，将上清液分装，液氮冷冻后于-85℃保存或直接进行酶活性分析。

酶提取系统配方：50mmol/L pH=7.0 Tris-HCl，内含20%甘油；1mmol/L EDTA；1mmol/L ASA（抗坏血酸）；1mmol/L DTT（二硫苏糖醇）；1mmol/L GSH（还原性谷胱甘肽）；5mmol/L MgCl2。

（2）过氧化物酶活性测定（POD）：

反应混合液为：50mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH7.0，内含0.1mmol/L EDTA，10mmol/L愈创木酚（邻甲氧基苯酚），5mmol/L H2O2。

测定时，反应混合液先在25℃水浴中预热。取反应混合液2.950mL，立即加入酶液50uL以启动反应，终体积为3mL，每隔30秒读出OD470的增加值。取0.5-3.5min时间段，即3min反应时间来计算酶活性。

POD活性（U·g-1·min-1）=

ΔA470：反应时间内吸光光度值的变化

Vt：提取液总体积

W：测定样品重量

Vs：测定用酶液体积

t：反应时间

以每分钟内A470变化0.01为1个POD活性单位（U）

5s读数一次，取50-110s时间段的数值

（3）过氧化氢酶活性测定（CAT）：

反应混合液为50mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH7.0，内含0.1mmol/L EDTA。

反应混合液和750mmol/L H2O2预先在25℃水浴中预热。取反应混合液2.900mL，加入酶液50uL，封口并于25℃下水浴中预热5min，到时加入750mmol/L H2O2 50uL（终浓度为12.5mmol/L）以启动反应，终体积为3mL，每隔30s读出OD240的减少值。取0.5-3.5min时间段，即3min反应时间来计算酶活性。

（4）超氧化物歧化酶活性测定（SOD）：

反应混合液为50mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH7.8，内含0.1mmol/L EDTA，0.1mmol/L NBT（氯化硝基四氮唑蓝），13.37mmol/L蛋氨酸（C5H11NO2S）。

测定时，反应混合液和0.1mmol/L核黄素溶液（用内含0.1mmol/L EDTA的pH为7.8的50mmol/L Tris-HCl缓冲液配制，避光保存）预先于25℃水浴中预热。取反应混合液2.85mL（最大光还原管为2.90mL，不加酶液），加入酶液50uL，再加入核黄素溶液100uL，终体积为3mL，25℃下距离120瓦（30瓦/管）日光灯7cm（光强约1500lux）进行光化还原反应40min，到时用黑布蒙住，在无灯光照射的室内快速测定OD560。

NBT光化还原抑制曲线按照下列方法进行，取反应液2.900mL、2.900mL、2.5mL、2.0mL、2.880mL、2.870mL、2.860mL、2.850mL、2.840mL、2.820mL、2.800mL、2.750mL、2.700mL，分别加入酶液0uL、0uL、5uL、10uL、20uL、30uL、40uL、50uL、60uL、80uL、100uL、150uL、200uL和核黄素溶液100uL，终体积为3mL，用上述方法测定并作出NBT光化还原抑制曲线。

（5）抗坏血酸专一性过氧化物酶活性测定（APX）：

反应混合液为50mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH7.0，内含0.1mmol/L EDTA，0.1mmol/L H2O2。

测定时，反应混合液和30mmol/L ASA，预先在25℃水浴中预热。取反应混合液2.900ml，加入酶液50ul，摇匀并调零，封口并于25℃下水浴中预热5min，到时加入30mmol/L ASA 50ul（终浓度为0.5mmol/L）以启动反应，终体积为3ml，每隔10S读出OD290的减少值。取0-60S时间段，即50S反应时间来计算酶活性。

（6）谷胱甘肽还原酶活性测定（GR）：

反应混合液为50mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH7.5，内含0.1mmol/L EDTA，5mmol/L MgCl2。

测定时，反应混合液、10mmol/L NADPH2和10mmol/L GSSG，预先在25℃水浴中预热。取反应混合液780ul，加入酶液150ul，10mmol/L NADPH2 20ul(终浓度为0.2mmol/L)及10mmol/L GSSG 50ul（终浓度为0.5mmol/L）以启动反应，终体积为1ml，每隔30S读出OD340的减少值。取0.5-3.5min时间段，即3min反应时间来计算酶活性。