03 生物化学实验--考马斯亮蓝G-250染料结合比色法测定蛋白质含量

【目的】 

1 ． 掌握考马斯亮蓝 G-250 染料结合比色法测定蛋白质含量的原理和方法。 

2 ．熟悉 标准曲线的绘制及分光光度计的使用。 

【原理】 

考马斯亮蓝 G-250 （ Coomassie brilliant blue G-250 ）为醇溶性蛋白质染料。在游离状态下呈红色，最大吸收峰在 465 nm 。在酸性环境中，蛋白质带正电荷（ –NH 3+ ）与考马斯亮蓝 G-250 阴离子结合为蓝色的染料 – 蛋白质复合物后，其最大吸收峰变为 595 nm 。蛋白质含量在 1 ～ 1000μg 范围内，蛋白质 – 染料复合物在 595 nm 处的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定。 

蛋白质 – 染料复合物具有很高的吸光值，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度。染料与蛋白质结合迅速，大约为 2min ，结合物的颜色在 1h 内稳定。所以本法操作简便、快速、灵敏度高以及稳定性好，是一种测定蛋白质含量的常用方法。 

【器材】 

1 ． 分光光度计 

2 ． 中号试管 

3 ．刻度吸量管 

4 ．微量移液器 

【试剂】 

1 ． 考马斯亮蓝 G-250 染色液 

准确称取考马斯亮蓝 G-250 100mg 溶于 50ml 95% 乙醇中，加蒸馏水 800ml ，再加 85% 磷酸（ W/V ， A?R ） 100ml ，混匀配制成原液。原液置棕色瓶中，于 4 ℃ 可保存 1 ～ 2 个月。临用前取原液 15ml ，用蒸馏水定容至 100ml ，粗滤纸过滤后使用。 

2 ． 标准蛋白质溶液 

牛血清白蛋白 1.0mg/ml 。 

【操作】 

1 ． 制备不同浓度的标准蛋白质溶液。 

取试管 5 支，编号，按下表操作： 

取试管 7 支，编号，按下表操作： 

【注意事项】 

1 ． 本法操作简便，灵敏，重复性好，显色迅速，约 2min 染料就与蛋白质充分结合，至少 1h 内呈色稳定。随着时间的延长，尤其是高浓度的蛋白质溶液在酸性条件下易发生沉淀。 

2 ． 不同蛋白质在同样的酸性条件下所带的正电荷量不同，故与染料的结合程度也不同，以致同一浓度的不同蛋白质显色度有差异。为此要求蛋白质标准品要纯，标准品与染料结合的色调和待测样品与染料结合的色调要相似。 

3 ． 作标准曲线所用的已知蛋白质和未知浓度蛋白质溶液一起准备，这对于测定蛋白质浓度是十分必要的；如果用同一个比色杯来测定蛋白质的浓度，则应该先测低浓度的蛋白样品，以免考马斯亮蓝 G–250 染色液吸附在比色杯上不能彻底冲洗干净而带来误差。 

4 ． 蛋白质与本试剂反应需充分混匀，但切勿剧烈振荡，以防产生泡沫，降低颜色深度 

5 ． 比色杯上染料的清洗：可先用甲醇、乙醇或者其它有机溶剂进行进行清洗，或者在 0.1M HCl 中浸泡过夜。 

6 ． 该方法适用于可溶性蛋白，对膜结合蛋白、细胞以及细胞器等，则需要用酸碱或者去污剂处理后方可测定。 

【思考题】 

1 ． 简述考马斯亮蓝 G-250 染料结合比色法测定蛋白质含量的原理。 

2 ． 简述标准曲线法测定蛋白质含量的优点。