利血平致大鼠脾虚模型木糖排泄率与肠粘膜ATP含量的研究

量的研究1

郭文峰1，高小玲1，李茹柳1，陈蔚文1，2，*

1 广州中医药大学脾胃研究所，广州（510405）

2 上海市高校中医内科学E-研究院，上海中医药大学，上海（201203）

E-mail：piwei@gzhtcm.edu.cn

摘要：[目的]观察利血平所致脾虚大鼠的病理改变情况，为在该模型上观察益气健脾方药的作用提供参考。[方法]模型组以利血平注射造模15d，停药后再观察30d，实验周期共45d；另设正常组观察45d。观察大鼠一般状态、体重、尿D-木糖排泄率、小肠粘膜ATP含量、胃肠粘膜病理组织学、脏器系数等指标。[结果]模型大鼠体重和尿D-木糖排泄率下降（与正常组比较P<0.01），持续至45d；小肠粘膜ATP含量比正常组略为降低；尿D-木糖排泄率改变与小肠粘膜ATP含量改变呈正相关；胃肠粘膜病理组织学检查未见明显改变；肝和胸腺脏器指数降低。[结论]利血平所致脾虚大鼠病变状态可持续较长时间，与益气健脾方药缓慢起效的特点相符；有肠道消化吸收功能降低的改变，并伴随肠粘膜ATP含量的降低。该动物模型可用于观察益气健脾方药改善消化吸收功能等作用。

关键词：脾虚证；动物模型，病理改变

利血平致动物脾虚模型是脾虚实验研究的常用模型[1]。尿D-木糖排泄率降低是脾虚患者的临床表现之一，虚损程度越重，排泄率越低[2]。脾虚失运则营养物质吸收功能低下，同时可能与能量代谢异常有关。本实验在利血平致脾虚大鼠模型上，观察大鼠一般状态、胃肠病理组织学、脏器系数、尿D-木糖排泄率、小肠粘膜ATP（三磷酸腺苷）含量等改变，为在该模型上观察益气健脾方药的作用提供参考。

1 实验材料

1.1 动物

SD大鼠，雄性，广州中医药大学动物中心提供，SPF级，体重220～240g，许可证号：SCXK(粤)2003-0001，粤鉴证字2006A041。

1.2 试剂

利血平注射液：广东邦民制药有限公司出品，批号050614；0.9%氯化钠注射液（生理盐水）：西南药业股份有限公司出品，批号06070067；D-木糖：上海伯奥生物科技有限公司出品，批号050107；对溴苯胺：中国医药（集团）上海化学试剂公司出品，批号20010814；硫脲：广州化学试剂厂出品，批号20011003-2；ATP试剂盒：美国Promega 公司出品，Cat：FF2000，Lot#：224431。冰乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、中性甲醛、无水乙醇、二甲苯、丙酮等试剂均为分析纯。

试剂配制：对溴苯胺溶液：对溴苯胺2g溶于100mL以硫脲饱和过的冰乙酸上清液，当天配用，避光保存；Tris-HCl：0.02mol/L，以1%HCl调pH值为7.75。

1本课题得到国家自然科学基金项目（编号30600798）；广州中医药大学中医药科研创新基金课题（编号05C007）；上海市教育委员会E-研究院建设计划项目（编号E03008）的资助。

1.3 仪器

UV-mini 1420日本岛津紫外可见分光光度计。荧光照度计：Veritas9100-002型，Turner Biosystems Instrument Luminometer出品。

2 实验方法

2.1 造模方法

参照文献[3]改进，预试验结果提示大鼠体重300g左右开始造模效果较好，故饲养大鼠至300g±20g随机分组。正常组：1d-15d皮下注射生理盐水，16d-45d改为灌胃蒸馏水；模型组：1d-15d皮下注射利血平0.5mg/kg，16d-45d改为灌胃蒸馏水。实验周期共45d。

2.2 对溴苯胺法测定大鼠尿D-木糖排泄率

方法参照文献改进[4-5]，大鼠禁食不禁水12h，每只大鼠灌胃3% D-木糖溶液4mL，然后收集5h尿液（期间禁食不禁水）；每例取0.5mL尿液样本，双蒸水稀释10倍后，加入2%对溴苯胺溶液2.5mL；取浓度为1mg/mL的D-木糖溶液，依次倍比稀释制作标准曲线；样本管和标准管置70℃恒温水浴箱10min，然后室温放置70min，以分光光度计在波长520nm下检测。木糖排泄率（%）＝[（标准曲线所计算mg/mL浓度×尿总量mL数×尿液稀释倍数）/灌胃木糖mL数]×100%。

2.3 生物发光法测定小肠粘膜ATP含量

参照试剂盒和文献方法改进[6-8]，实验结束时处死大鼠，冰盘上迅速刮取小肠粘膜，称重后置-70℃冰箱保存。ATP提取：刮取的小肠粘膜加入1.5%三氯乙酸0.5mL，冰上快速匀浆，0.02mol/L Tris-HCl 0.5mL冲洗，一并转入离心管，412000rpm

℃离心10min，取上清。

制作ATP标准曲线：稀释ATP标准液（10-7mol/L），使标准品的浓度分别为10-7，10-8，10-9，10-10，10-11，10-12，10-13mol/L。

检测采用自动进样，设置2S延迟，10S整合时间。各样品稀释10倍后取0.1mL 加入96孔板；等体积进样。每个样品测2次取平均值。根据标准曲线求得浓度的对数值（n）计算，ATP含量（µmol/g）＝[10n(mol/L)×样品总体积（L）×103]/粘膜重量(g)。

2.4 脏器指数

实验结束处死大鼠，剖腹取脏器，称重心、肝、脾、肺、肾、胸腺，计算脏器指数，脏器指数=（脏器质量/体质量）×100。

2.5 病理组织学检查

胃和小肠以生理盐水冲洗，肉眼观察后置中性液固定，24h后包埋蜡块，常规切片，HE染色。

2.6 统计方法

采用SPSS11.0统计软件，大鼠组间体重、脏器系数、木糖排泄率、ATP含量比较用单因素方差分析；木糖排泄率与小肠粘膜ATP含量相关性分析采用Pearson分析。

3 实验结果

3.1 大鼠一般状态

模型组大鼠体重1-5d 体重与正常组比较，增长速度无明显差异；6d 开始体重逐渐下降；9d 起体重明显下降，大鼠扎堆，活动减少，双目懒睁，大便溏软，毛色不泽，食量下降；体重在16d 降至最低（与正常组比较P <0.01），以后体重逐渐上升，但45d 实验结束时与正常组比较仍P <0.01。实验过程各组体重变化见图1。

W e i g h t (g r a m )Time (d)

图1 两组大鼠体重变化情况

3.2 尿D-木糖排泄率

在15d （造模结束）、25d 、35d 、45d 分4次检测两组大鼠尿D-木糖排泄率。图2结果可见，15d 时模型组大鼠木糖排泄率明显降低（与正常组比较P <0.01），25d 、35d 、45d 木糖排泄率无明显变化（与正常组比较均P <0.01）。

图2 实验过程大鼠尿D-木糖排泄率变化情况

3.3 小肠粘膜ATP 含量

实验结束后（45d ）检测两组大鼠小肠粘膜ATP 含量。以ATP 标准品浓度的对数

表1 大鼠小肠粘膜ATP含量（

s x±）

组别n ATP含量（µmol/g）

正常对照组 6 3.098±0.763

模型对照组10 2.733±0.494

3.4 尿D-木糖排泄率与小肠粘膜ATP含量相关性分析

为了分析尿D-木糖排泄率与小肠粘膜ATP含量改变之间的相关性，对实验结束时（45d）两组共16例大鼠的尿木糖排泄率与小肠粘膜ATP含量一一对应进行相关性分析，相关系数r=0.551，P<0.05，表明两者呈正相关，即尿木糖排泄率降低则小肠粘膜ATP含量也降低，结果见图3。

图3 大鼠尿木糖排泄率与小肠粘膜ATP含量相关性分析

3.5 胃和小肠组织病理学检查

正常组胃和小肠结构清晰，黏膜完整，未见明显炎细胞浸润；模型组胃和小肠与正常组大致相似。见图4。

a.正常组胃（×100）

b.模型组胃（×100）

c.正常组小肠（×100）

d.模型组小肠（×100）

图4 大鼠胃和小肠病理组织学检查

3.6 大鼠脏器指数的变化

心、肝、脾、肺、肾、胸腺脏器指数见表2。模型组肝脏指数和胸腺指数降低，与正常组比较差异有统计学意义。

表2 两组大鼠脏器指数（s x ±）

组别

心 肝 脾 肺 肾 胸腺 正常

组

0.25±0.02 2.42±0.21 0.22±0.120.33±0.040.59±0.04 0.07±0.01 模型

组 0.25±0.02 2.10±0.12**0.17±0.030.35±0.030.55±0.04 0.05±0.01﹡

方差分析，与正常组比较，*P <0.05，**P <0.01

4 讨论

利血平能够耗竭儿茶酚胺，使动物出现脾虚患者常见的交感神经功能低下、副交感神经功能偏亢等症状。在利血平致大鼠脾虚模型上，可观察到小肠粘膜形态学改变[3]、尿木糖排泄率降低[9]、免疫功能下降[10]、血中胃泌素和胃动素含量下降[11]、壁细胞胃泌素受体结合位点数下降[12]等病理改变。

本研究首次在利血平所致大鼠脾虚模型上检测肠道能量代谢的指标小肠粘膜ATP

目前脾虚证实验研究的动物模型常采用大黄或利血平作为造模药物。大黄所致脾虚模型病变程度相对较轻，一般停给大黄后1周左右很多生理指标都已基本恢复正常，相对于临床脾虚病程及服药时间都较长的特点不尽相符。从本实验结果看，脾虚模型在停给利血平30天后，大鼠一般状态、体重、D-木糖排泄率等指标与正常组比较仍有明显差异，病变状态可持续较长时间，与益气健脾方药缓慢起效的特点相符。我们在该模型给四君子汤的实验结果也显示，需要经过30天左右的给药时间，才可观察到较明显的药效。本实验中HE染色病理组织学检查脾虚大鼠胃肠组织未见明显的病理改变，可能需要超微结构的观察才能进一步了解其组织结构的改变。脏器系数的观察可见模型大鼠肝和胸腺指数的降低，表明该模型可能会造成一定的脏器损害。

脾主运化与营养物质的消化吸收有密切联系，脾虚证是以运化功能失职为主要表现的证候，因此建立脾虚证动物模型应考虑与脾运化功能失职相关的指标。利血平所致的脾虚大鼠模性在一定程度上反映了类似的病理改变，可为益气健脾方药改善消化吸收功能的研究提供参考。

参考文献

1. 李仪奎. 中药药理实验方法学[M]. 上海：上海科学技术出版社，2006：16

2.

2. 陈淑芬. 脾虚证与血清胃泌素、D-木糖排泄率及T细胞亚群关系探讨[J]. 四川中医，1999，17（11）：

6-7.

3. 姚永莉，宋于刚，赵彤，等. 大鼠脾虚证模型的胃肠粘膜形态学研究[J]. 中国中西医结合脾胃杂志，2000；

8（1）：8-10.

4. 张爱郁，白德贞，张延英，等. 慢性腹泻161例尿D-木糖测定的临床研究[J]. 甘肃中医学院学报，1993，

10（4）：13-14.

5. 张翥，马继伟，李寅超. 溢尿停对实验性脾虚SD大鼠胃肠功能的影响[J]. 辽宁中医杂志，2004，31（8）：

703-704.

6. Salzman AL，Menconi MJ，Unno N，et al. Nitric oxide dilates tight junctions and depletes ATP in cultured

Caco-2BBe intestinal epithelial monolayers[J]. Am J Physiol，1995，268（2Pt1）：G361-73.

7. Webster JJ，Chang JC，Manley ER，et al. Buffer effects on ATP analysis by firefly luciferase[J]. Anal

Biochem，1980，106（1）：7-11.

8. 戴定威，吴圣楣，李敏. 生物发光法测定体外培养小肠上皮细胞内微量ATP[J]. 临床检验杂志，1997，

15（5）：279-280.

9. 彭成，雷载权. 四君子汤对消化、运动、吸收作用的实验研究[J]. 中药药理与临床，1995，（5）：6-8.

10. 陈松，李家邦，李立新. 脾虚证与益气健脾治疗对T、B淋巴细胞活性影响的实验观察[J]. 湖南中医学

院学报，2000，12（4）：9-10.

11. 魏彦明，宗瑞谦，杨孝朴. 实验性脾虚证大鼠血浆胃泌素和胃动素含量变化及四君子汤对其调整作用[J].

中国兽医学报，2001，21（3）：281-283.

12. 张根水，王汝俊. 脾虚大鼠壁细胞胃泌素受体研究及黄芪作用观察[J]. 中国中医基础医学杂志，2002，

8（6）：44-45.

http://www.paper.edu.cn Study on Urine’s Xylose Excretion Rate and ATP in Mucosa of Spleen Deficiency Rats Caused by Reserpine

Guo Wenfeng1，Gao Xiaoling1，Li Ruliu1，Chen Weiwen1,2

1. Piwei Institute, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou （510405）

2. E-Institute of Shanghai Municipal Education Commission，Shanghai University of Traditional

Chinese Medicine，Shanghai （201203）

Abstract

Objective：To observe the pathological changes and D-xylose excretion rate, ATP content in the mucosa membranes of small intestines of Rats with spleen deficiency caused by reserpine injection. Which can provide reference for study on formula and herbs of strengthening spleen. Methods：Spleen deficiency rats model was made by Reserpine injection 15 days, and then continue observing 30 days, comparing with normal group. General conditions, body weight, D-xylose excretion rate, ATP content and histopathological study in mucosa were measure. Results：Rats’ body weight and D-xylose excretion rate decreased after reserpine injection (P<0.01, vs. control group). The mucosal ATP content of model rats appreciably decreased, there was obviously positive correlation between change of urine’s D-xylose excretion rate and mucosa ATP content. No obviously change was detected in histopathologic examination. The organ coefficient of liver and thymus were lower than that of normal rats. Conclusion：Pathogenic state of spleen deficiency rat caused by reserpine injection can last a long period, which is suitable for the characteristic of Chinese herb and formula for strengthening spleen. The model rats have dysfunction of digesting and absorbing, associated with mucosal ATP contents decreasing. So it can be used for studying Chinese herb and formula for strengthening spleen. Keywords：spleen deficiency，animal model，pathological changes

作者简介：郭文峰（1975-），男，江西于都人，副教授，医学博士，主要从事中西医结合消化道药理与临床研究。

- 7 -