木瓜蛋白酶对猪肉脯嫩化效果的研究

李培红;王怀欣;郇延军

【摘 要】本文首先利用单因素试验得到了木瓜蛋白酶添加于猪肉脯中的用量、作用温度及作用时间的大概范围,再利用正交试验得到了木瓜蛋白酶嫩化猪肉脯的最适作用条件:木瓜蛋白酶用量360U/g、作用温度70℃、作用时间为20min.然后利用扫描电镜,对未处理猪肉和木瓜蛋白酶嫩化后的猪肉微观结构进行了观察,结果发现,木瓜蛋白酶处理过的猪肉的肌肉纤维结构具有明显的断裂痕迹,说明木瓜蛋白酶对猪肉脯确实具有嫩化作用.最后验证了木瓜蛋白酶嫩化后的猪肉脯在嫩度、水分含量、水分活度、成品率、感官指标上的改善情况,结果表明,木瓜蛋白酶处理后的猪肉脯在嫩度和感官得分上均优于未处理样品,并且木瓜蛋白酶处理对产品贮藏不会产生不利影响.

【期刊名称】《肉类研究》

【年(卷),期】2011(025)001

【总页数】6页(P40-45)

【关键词】猪肉脯;嫩化;木瓜蛋白酶;扫描电镜

【作 者】李培红;王怀欣;郇延军

【作者单位】江南大学食品学院,江苏无锡,214122;郑州中岳电力有限公司,河南登封,452477;江南大学食品学院,江苏无锡,214122

【正文语种】中 文

【中图分类】TS201.1

猪肉脯是指以新鲜的猪瘦肉为原料，经切片、腌制、烘干、烤制等数十道工序精制而成的一种高档肉制品[1]，具有味道鲜实，咸中微甜，芳香浓郁，余味无穷等特点[2]，深受我国以及世界各地消费者的青睐[3]。传统猪肉脯的加工都有一个脱水烘干的过程，这个过程容易造成猪肉纤维结构收缩，导致肉中液体流失和硬度增加，从而造成肉的嫩度下降[4]，表现在产品上主要是口感坚韧，弹性不够、切片性能差、硬度大，易损伤牙齿，不适宜老人和孩子的食用，影响其市场销售[5]。传统提高猪肉脯嫩度的方法，主要是适当提高产品水分含量，但是高含水量的食品，水分活度也相应较高[6]。水分活度的升高容易导致微生物在产品中生长繁殖，造成产品的霉变、，使产品难以长期储存[7]。

对肉及肉制品的评价，一般主要有以下5个品质指标，即肉色、嫩度、风味、系水力和多汁性，其中，嫩度是肉品食用品质的首要指标。肉的嫩度是指肉在食用时口感的老嫩，反映了肉的质地。对肉嫩度的主观评定主要根据其柔软性、易碎性和可咽性来判定[8]。肌原纤维中的肌球蛋白、肌动蛋白及肌动球蛋白均可影响肉品的嫩度，特别是肌球蛋白的pH、离子强度和某些外源性酶类，如胰蛋白酶和木瓜蛋白酶等对肌动球蛋白的裂解，都可改变肉品的嫩度[9]。结缔组织中胶原蛋白的溶解性和分子之间的交联程度对肉的嫩度也有很大影响[8]。

肉类嫩化理论及其工艺一直不断为各国学者探索和研究，新工艺也不断被提出。从已达效果来看，采用蛋白酶嫩化的工艺较为先进。蛋白酶嫩化所用时间短，条件温和，方法简便，专业性强，并且成品无有害成分残留[10]。木瓜蛋白酶因其稳定性好，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等均具有强的水解能力[11，12]，所以是最常用的植物蛋白酶。木瓜蛋白酶对肌肉的作用组织主要是肌动球蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白，木瓜蛋白酶能将肌动球蛋白分解为肌球蛋白和肌动蛋白，肌动蛋白易溶于水，使肉的保水性增强，嫩度提高[13-15]。胶原蛋白和弹性蛋白是结缔组织的主要成分，木瓜蛋白酶对这两种蛋白质的作用能使结缔组织降解成无定形的小块，导致肉的嫩化[16]。Chunghee.K.Kang和Eldone.Rice研究了菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、胶原酶、胰酶应用于肉中的嫩化效果，结果发现木瓜蛋白酶对水溶性、盐溶性和不溶性肌肉组织片段都有较好的水解效果[17]。

因此本文主要研究了木瓜蛋白酶嫩化猪肉脯的最佳工艺条件，并利用扫描电镜对木瓜蛋白酶嫩化后的猪肉脯进行了微观结构的观察，以期为木瓜蛋白酶嫩化猪肉脯的大规模应用，提供理论依据和指导。

1 材料与方法

1.1 原辅料及试剂

新鲜猪后腿肉（无锡市乐购超市选购），木瓜蛋白酶（6000U/g)(沃凯：国药集团化学试剂有限公司）、葡萄糖、氯化钠、蔗糖、亚钠均为分析纯，其他辅料如味精、多味五香粉等购于无锡市场。

1.2 仪器设备

101-2-BS型电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）、TA-XT plus型质构分析仪（英国Stable Micro Systems公司）、HH-S型电热恒温水浴锅（郑州长城科工贸有限公司）、FA-1104电子天平（上海天平仪器厂）、QUANTA-200扫描电镜（FEI公司）、CPD-030临界点干燥仪（BAL-TEC公司）、SCD-005离子溅射仪（BAL-TEC公司）。

其它仪器如温度计、注射器、LG保鲜冰箱等为实验室常规仪器。

1.3 实验方法

1.3.1 工艺流程

原料选择（猪后腿肉）→预处理（修整、去除可见脂肪、结缔组织）→冷冻（便于切片，冷冻至肉中心温度-2～-3℃为佳）→切片（厚度约2mm）→解冻→试验处理→腌制（肉∶蔗糖∶葡萄糖∶盐质量比为50∶2∶4∶1）→摊筛→烘干（烘箱中85℃作用1小时，65℃作用4小时，每半小时翻一次）→烤熟（220℃作用3min）→压平切割→包装→指标测定。

1.3.1.1 操作要点：

Ⅰ.原料选择、预处理：选择猪后腿肉，清洗去血污，修整，去除可见脂肪、结缔组织。

Ⅱ.冷冻：冷冻主要是便于切片。冷冻温度在-20℃左右，冷冻2小时，冷冻后猪肉的中心温度控制在-2～-3℃为佳。

Ⅲ.切片、解冻：将肉顺着肌肉纤维方向切成2 mm左右厚的薄片，然后放入流动的清水中解冻。

Ⅳ.试验处理：按具体试验操作对肉片进行处理。

Ⅴ.腌制：腌制剂中肉∶蔗糖∶葡萄糖∶盐质量比为50∶2∶4∶1，五香粉适量均匀添加。按配方配制腌制剂，然后拌入肉片，搅拌均匀，但不可过度剧烈搅拌，以免破坏肉片，6℃条件下腌制2小时。

Ⅵ.摊筛：先在筛网上涂一层熟植物油，再将腌制好的肉片摊在筛上，摊筛应均匀一致，肉片之间不得留有空隙，也不要重叠，使肉片相互粘接成平整的平板状。

Ⅶ.烘干：将筛盘送入烘箱，烘干条件为：85℃烘干一小时，然后65℃连续烘干4小时，中间每隔半个小时翻一次。待肉片基本脱水，形成干坯后，从烘箱中移出，从筛盘上小心取下，自然冷却备用。

Ⅷ.烤制：将烘干的半成品肉片送入烤箱中进行烤制。烤制温度为220℃，时间为3min，烤至肉质出油，成红棕色即可。

Ⅸ.压平切割、包装：熟化结束后，立即取出，手工压平，然后按指标测定要求进行切片，然后将切片后肉脯放入包装袋封口保存，用于指标测试。

Ⅹ. 指标测定：根据具体试验要求，进行感官评定、剪切力测定、成品率、水分含量、水分活度和微生物测定。

1.3.2 剪切力测定

本试验嫩度的测定均选用切割测试得出的剪切力为指标，剪切力越小，嫩度越好。剪切力的具体含义为，切割试验中切刀切断猪肉脯的力的曲线与切断时间围成的面积。

预处理：用剪刀将室温保存的猪肉脯剪成3×2cm的长方形。

利用质构仪做剪切力试验，选用A/CKB探头，设置参数如下：测试模式：压缩；测试前速度：1mm/sec；测试速度：2mm/sec；测试后速度：10mm/sec；剪切率为90%；感应力：10g。试验平行测定5次。

1.3.3 感官评定

严格按照相关标准，采用双盲法[18]，对不同试验处理后产品进行感官品评，采用九点标度法[19]：满分9分。9：极好；8：良好；7：好；6：次好；5：一般；4：一般以下；3：差；2：很差；1：极差。对每一项进行评分，然后按照每一项所占权重进行加和，最后换算成9分制进行数据分析。

猪肉脯成品感官评分标准见表1[20]。

表1 猪肉脯成品感官评分标准Table 1 Sensory index of dried meat slice

每一项所占权重：咀嚼度：40%，硬度：40%，

形态：10%，色泽：5%，滋气味：5%。

1.3.4 成品率计算

1.3.5 水分活度测定

水分活度：用水分活度仪测定。

1.3.6 水分含量测定

水分含量测定参考GB/T 5009.3-2003。

1.3.7 木瓜蛋白酶嫩化效果研究

1.3.7.1 木瓜蛋白酶用量对嫩化效果的影响

取切片后的猪肉，分成8组，每组100g，分别均匀注射含有不同酶活力单位的木瓜蛋白酶溶液10 ml，木瓜蛋白酶酶活单位/猪肉用量(U/g)梯度为：0、120、240、360、480、600、720、840。先在烘箱中60℃作用20min。然后按1.3.1工艺流程制成肉脯并测其剪切力，初步确定木瓜蛋白酶用量。平行测定5次。

1.3.7.2 木瓜蛋白酶作用温度对嫩化效果的影响

利用1.3.7.1初步得到的木瓜蛋白酶的最适用量，分别在35℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃下对猪肉脯作用20min，其它操作同1.3.7.1，初步决定木瓜蛋白酶的作用温度。

1.3.7.3 木瓜蛋白酶作用时间对嫩化效果的影响

利用1.3.7.1和1.3.7.2得到的初步结果，分别对猪肉片作用1min、5min、10min、20min、30min，其它操作同1.3.7.1，初步决定木瓜蛋白酶的作用时间。

1.3.8 木瓜蛋白酶作用参数的优化

根据单因子试验结果，选取木瓜蛋白酶用量(A)、作用温度(B)和作用时间(C)为考察因子，选用L9(34)正交表进行正交试验，以确定木瓜蛋白酶的最优作用条件。因素水平如表2。

1.3.9 木瓜蛋白酶最优参数的验证

对木瓜蛋白酶正交试验结果进行分析得到的木瓜蛋白酶的最佳处理条件与直接通过正交试验结果选择的最优处理条件不一致，因此有必要对此正交试验结果进行验证。

将未进行任何处理和利用木瓜蛋白酶(360U/g、70℃、20min)处理后两种猪肉片按1.3.1工艺流程制成肉脯后，测定两种样品的剪切力、水分含量、水分活度、成品率、感官得分，验证木瓜蛋白酶最优参数下的嫩化效果。平行测定5次。

表2 木瓜蛋白酶作用条件优化的因素水平表Table 2 Level and factors of Papain

1.3.10 猪肉超微结构的电镜观察

取置于4℃保存的1.3.9中两种肉样→3%戊二醛(glutaraldehyde)固定→0.1 M磷酸缓冲液漂洗数次→乙醇梯度脱水30%、50%、70%→室温90%、100%→醋酸异戊酯过渡→临界点干燥→离子溅射→扫描电镜观察(放大5000倍)。

2 结果与分析

2.1 木瓜蛋白酶用量对嫩化效果的影响

木瓜蛋白酶用量对猪肉脯嫩化效果的影响见图1。

图1 木瓜蛋白酶用量对猪肉脯嫩化效果影响Figure 1 The effect of papain quantity on tenderizing

从图1可知：木瓜蛋白酶对猪肉脯具有显著的嫩化效果，当木瓜蛋白酶用量从0增加到360U/g时，猪肉脯剪切力随木瓜蛋白酶用量的增加而下降，当木瓜蛋白酶用量在360U/g到600U/g之间时，猪肉脯的剪切力基本不变，当木瓜蛋白酶用量超过600U/g时，当猪肉脯的剪切力又逐渐上升。因此选取木瓜蛋白酶最适用量为360U/g。

木瓜蛋白酶用量过大造成剪切力上升的原因，可能是肌动球蛋白的过度裂解和结缔组织过分降解造成的。肌动球蛋白是肌原纤维的主要成分，肌动球蛋白的过度裂解溶解和结缔组织的过分降解可能会造成肌肉的超微网状结构遭到过度破坏，导致肌肉结构过于松散，猪肉脯在烘干过程中，松散的肌肉网状结构过度收缩，液体流出，保水性差，造成肉的硬度上升，剪切力上升，嫩度下降。

2.2 木瓜蛋白酶作用温度对嫩化效果的影响

木瓜蛋白酶作用温度对猪肉脯嫩化效果的影响见图2。

图2 木瓜蛋白酶作用温度对猪肉脯嫩化效果的影响Figure 2 The effect of papain working temperature on tenderizing

从图2可知，当木瓜蛋白酶作用温度从35℃升高到65℃时，随着温度的升高，剪切力逐渐越低，当作用温度超过65℃时，剪切力又逐渐上升。剪切力上升的原因可能是，温度过高导致木瓜蛋白酶部分失活，致使猪肉嫩化效果变差，所以成品肉脯剪切力上升。因此选取木瓜蛋白酶最适作用温度为65℃。

2.3 木瓜蛋白酶作用时间对嫩化效果的影响

木瓜蛋白酶作用时间对猪肉脯嫩化效果的影响见图3。

图3 木瓜蛋白酶作用时间对猪肉脯嫩化效果的影响Figure 3 The effect of papain working time on tenderizing

从图3可知，当木瓜蛋白酶的作用时间从0到30min递增时，随着作用时间的延长，猪肉脯的剪切力不断下降，但是当作用时间超过20min时，剪切力逐渐趋于平缓，这可能是因为一定数量的猪肉能够提供的木瓜蛋白酶的作用位点是有限的，因此木瓜蛋白酶的嫩化效果才不随作用时间的延长而无限提高。因此选取木瓜蛋白酶最适作用时间为20min。

2.4 木瓜蛋白酶作用条件的优化

木瓜蛋白酶正交试验设计及结果见表3，木瓜蛋白酶正交设计各因素方差分析见表4。

表3 木瓜蛋白酶正交试验设计及结果Table 3 Orthogonal experiment design and results of papain注：剪切力为5次试验的平均值。

表4 木瓜蛋白酶正交设计各因素方差分析表(完全随机模型)Table 4 Variance analysis of orthogonal factors(completely random model)注：⋆表示在0.05水平下差异显著，⋆⋆表示在0.01水平下差异极显著，-表示差异不显著。

方差分析结果表明，A因素(木瓜蛋白酶用量)在0.01水平下差异极显著，B因素(木瓜蛋白酶作用温度)在0.05水平下差异显著，C因素(木瓜蛋白酶作用时间)在0.01和0.05水平下差异均不显著。又由表3中的R值可知：因素主次顺序为A＞B＞C，同时由k1j、k2j、k3j值可确定各因素的最优水平为A2B3C2，即木瓜蛋白酶用量为360U/g，作用温度为70℃，作用时间为20min时，嫩化效果最好。

2.5 木瓜蛋白酶嫩化最佳参数的验证

验证试验结果表明，按照正交分析得到的木瓜蛋白酶嫩化的最佳工艺条件对肉片进行处理后制成的肉脯的剪切力低于直接通过正交试验结果选择的最优处理条件处理过的肉脯，因此可以说明通过正交分析所选择的木瓜蛋白酶嫩化猪肉脯的最佳工艺条件是有效的，可用于实践。

2.6 扫描电镜观察

图4、图5为扫描电镜观察到的放大5000倍的未进行任何处理和经木瓜蛋白酶处理后的猪肉片的超微结构。

图4 未处理肉样超微结构Figure4 Microstructure of the control

图5 木瓜蛋白酶嫩化肉样超微结构Figure 5 Microstructure of pork treated by papain

比较图4和图5可以发现，未进行任何处理的猪肉，其肌肉纤维结构致密，表面平整，无空洞、裂隙；经木瓜蛋白酶嫩化后的猪肉，肌肉纤维结构断裂明显，纤维结构之间有明显缝隙、空洞，肌肉纤维结构变得疏松细碎，所以木瓜蛋白酶处理后，猪肉嫩度提高。电镜观察到的现象进一步验证了木瓜蛋白酶嫩化猪肉脯的理论。从电镜图片也可推测，当进一步嫩化时，猪肉纤维间的空洞和缝隙还会进一步增大，由肌原纤维断裂导致的猪肉脯的嫩化作用小于烘干过程中纤维收缩，持水下降造成的肌肉硬度的提升时，可能会表现为前面试验结果中出现的猪肉脯嫩度减小，剪切力上升。

2.7 木瓜蛋白酶作用综合效果的验证

分别测定木瓜蛋白酶嫩化后的猪肉脯和未经任何处理的猪肉脯的剪切力、水分含量、水分活度、成品率和感官得分5项指标，结果见表5。

表5 不同处理猪肉脯各指标的比较Table 5 Comparison of indexes with different treating注：同一行中不同字母表示差异显著(p≤0.05)；结果为5次测定的平均值±标准差。

从表5可知，木瓜蛋白酶嫩化处理后，猪肉脯的剪切力显著降低，说明木瓜蛋白酶对猪肉脯确实具有显著的嫩化效果。经木瓜蛋白酶处理后，猪肉脯的水分含量、水分活度和成品率均没有显著改变，因为水分活度对产品保质期具有显著影响，说明木瓜蛋白酶处理对产品保质期不会有影响。观察表5还可发现，经木瓜蛋白酶处理后，产品的感官得分显著上升，这对产品来说具有很好的经济效益。综上所述，木瓜蛋白酶应用于猪肉脯中，对产品各项指标的改善均具有积极的意义。

3 结论

（1）木瓜蛋白酶嫩化猪肉脯正交试验得出，木瓜蛋白酶用量为360U/g，作用温度为70℃，作用时间为20min时，对猪肉脯的嫩化效果最好。

（2）扫描电镜观察木瓜蛋白酶嫩化后的猪肉和未经嫩化后的猪肉的纤维结构发现，未处理样品肌肉纤维结构致密，表面平整，无空洞、裂隙；经木瓜蛋白酶嫩化后的猪肉，肌肉纤维结构断裂明显，纤维结构之间有明显缝隙、空洞，肌肉纤维结构变得疏松细碎。

（3）木瓜蛋白酶作用综合效果验证试验得出，木瓜蛋白酶处理对产品嫩度、感官均具有好的影响，对产品水分含量、水分活度、成品率没有显著影响，水分活度不变说明木瓜蛋白酶处理对产品保藏期没有不利影响。

参考文献

[1] 杜亚军.燕麦膳食纤维肉脯的研制[J].肉类工业,2003(11):15-17

[2] 李星科,李开雄,王令建等.猪肉脯制作工艺的改进[J].肉类工业,2005(12):6-9

[3] 杨云香.高纤维肉脯的研制[J].山西食品工业,2004(1):23-25

[4] 周光宏.肉品学[M].北京:中国农业科技出版社,1999.147-276

[5] 胡铁军,戴运达,马成林等.半干牛肉制品新工艺对产品嫩度影响的研究[J].肉类工业,2000(5):32-36

[6] 于东,安辛欣,张秋勤等.胶原蛋白粉制取及其对肉类品质的影响研究[J].中国食物与营养,2007(11):30-33

[7] 王平.保湿剂对鸭肉干品质改良的研究[J].肉类工业,2009(6):43-46

[8] 周光宏.肉品学[M].北京:中国农业科技出版社,1999.147-276

[9] 刘寿春,钟赛意,葛长荣.肉品嫩化理论及嫩化方法的研究进展[J].肉品卫生,2005(7):25-28

[10] 李黎.酶制剂在肉品加工中的应用[J].农村实用工程技术,2001(6):26-27

[11] Sangeetha K, Abraham T E Chemical modification of papain for use in alkaline medium [J].J Mol Cataly B:Enzyme,2006,38(3):171-177

[12] Lee W C,Chen T C.Functional characteristics of egg white solids obtained from papain treated albumen[J].J Food Engin,2002,51(4):263-266

[13] Mohammad Koohmaraic.Biochemical Factors Regulating the Toughening and Tenderization Processes of Meat[J].Meat Science,1996(43):193-201

[14] Hill F.The solubility of intramuscular collagen in meatanimals of various ages [J].J Food Sci,1966(31):161

[15] Chunghee K,Kang,Eldone,et al.Degradation of various meat fractions by tendering enzymes [J].J Food Sci,1970(35):563

[16] 刘登勇.食品添加剂在肉类嫩化中的应用[J].肉类工业,2003(3):26-30

[17] 谢超,刘鹭.几种肉类蛋白酶嫩化剂的比较[J].肉类工业,2003(2):29-31

[18] Harry T Lawless Hidegarde Heymann著,王栋等译.食品感官评价原理与技术[M].北京:中国轻工业出版社,2001

[19] 周明超,张春晖,郭伟.磷酸盐对西式蒸煮火腿质构影响研究[J].食品研究与开发,2006,27(9):143-146

[20] 杨敏,张建华.猪肉脯的研制[J].农产品加工,2009(2):13-15