微生物与传统发酵技术的应用

周应章（舟山市教研室　316000）

生物技术也叫生物工程，是应用自然科学及工程学的原理，以微生物、动物、植物作为反应器，将物料进行加工，以提供产品为社会服务的技术。而以微生物技术为基础、基因工程为核心的现代发酵工程、酶工程、细胞工程以及蛋白质工程得到了长足的发展，它们共同组成了具有划时代和战略价值的现代生物技术。

一、微生物的类群

1675年，荷兰学者列文虎克用自己制造的显微镜，观察了雨水、井水、河水等，发现其中许多微小的生物在活动，并将这些形体微小，结构简单，通常要用光学显微镜和电子显微镜才能看清的生物，统称为微生物（microorganism简称microbe）。

微生物所包含的类群十分庞杂，在目前已经知道的大约10万种微生物中，既包括没有细胞结构的病毒等，又包括原核生物界、真菌界以及原生生物界的生物。

例1、与下列几种微生物有关的叙述中正确的是（    ）

①酵母菌   ②乳酸菌   ③硝化细菌  ④蓝藻   ⑤烟草花叶病毒

A．从结构和成分看，①具有核膜包围的典型细胞核，⑤的遗传物质中不含胸腺嘧啶

B．从同化作用类型看，②是厌氧型，③④是需氧型

C．从异化作用类型看，①②异养型，③④是自养型

D．从生态系统中的成分看，①②③是分解者，④是生产者

解析：从结构上看，⑤是病毒不具细胞结构；②③属于细菌类，是原核生物；①属于真菌，是真核生物。从代谢类型看，①②营腐生生活，⑤营寄生生活，都是异养生物，③④是自养生物；①③④都是需氧型生物，②是厌氧型生物；病毒自身不具有直接的代谢功能，只能利用寄主细菌的代谢活动来合成核酸和蛋白质。从生态系统成分看，①②是分解者，③④是生产者。烟草花叶病毒的遗传物质是RNA，所以不含胸腺嘧啶。

答案：A

二、微生物的营养

微生物在生命活动的过程中，需要不断地从外界吸收营养物质，通过新陈代谢获取能量并合成自身的组成物质，以维持正常的生长和繁殖。微生物的种类繁多，对营养物质的需要也各不相同。在生产实际和科学研究中，常常要人工培养某种微生物，因此，必须了解微生物所需要的营养物质。

1、培养基的成分

①目的要明确：根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配制量；②营养要协调：培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜；③pH要适宜：细菌培养基pH中性或偏碱性，霉菌培养基呈酸性。

3、培养基的类型及其应用

（2）若除去成分②，加入（CH2O），该培养基可用于培养　　　　。

（3）表中营养成分共有　　　　类。

（4）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是　　　　。

（5）右表中各成分重量确定的原则是　　　　。

（6）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是　　　　。

解析：对于一个培养基，它能培养何种微生物，要看它的化学成分。当然这只适用于合成培养基，如果是一个天然培养基就不能从培养基的成分上区分它是培养何种微生物的。分析化学成分要从营养物质的类型出发。表中的营养物质有水、无机盐、氮源三类，缺乏碳源和特殊营养物质。对特殊营养物质，有的微生物是不需要的，但没有微生物是不需要碳源的。该培养基中没有碳源，说明培养的微生物是从空气中获得碳源的，即可培养的微生物就是自养型微生物了。该培养基若加入（CH2O），培养基中就有了碳源，但除去成分②，却使培养基中没有了氮源，这时就只能用于培养固氮微生物了。对于菌种鉴定，往往用的是固体培养基，而表中没有凝固剂，需要加入常见的凝固剂——琼脂。

答案：（1）自养型微生物　　（2）固氮微生物　　（3）3（水、无机盐、氮源）　　（4）调整pH　　（5）依微生物的生长需要确定　　（6）琼脂（或凝固剂）

三、微生物的培养

1、培养基配制

人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养物质――培养基。其中，配制成的液体状态的基称为液体培养基，配制成的固体状态的基质称为固体培养基。在液体培养基中加入最常用的凝固剂琼脂后，制成琼脂固体培养基，它是实验室中最常用的培养基之一。微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。

制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的制作步骤：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。顺序不能颠倒，并且在制作过程中特别是倒平板时彻底做到“无菌”。

2、消毒与灭菌

微生物培养过程中的无菌操作包括消毒和灭菌两大类，分别又有各种不同的方法。对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒；将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。

日常生活中经常用到煮沸消毒法，即在100℃煮沸5～6min可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。对于一些不耐高温的液体（如牛奶），则使用巴氏消毒法。此外，人们也常使用化学药剂进行消毒，如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等。

将微生物的接种工具，如接种环、接种针或其他金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌（灼烧灭菌）。将灭菌物品放入干热灭菌箱内，在160～170℃加热1～2h可达到灭菌的目的（干热灭菌）。将灭菌物品放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内，在压力为100kPa，温度为121℃的条件下，维持15～30min，可达到良好的灭菌效果（高压蒸汽灭菌）。

3．纯化培养

微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。

稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释的菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。

将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37℃恒温箱中，培养12h和24h后，分别观察并记录结果。

例3、根据已学知识，回答下列微生物培养过程中有关的问题：

（1）鉴定培养基的制作是否合格的方法是：将制备好的培养基放在　　　　　中保温1～2天看有无　　　　　，如果没有　　　　　说明制作合格，反之则不合格。

（2）细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌　　　　　　。

A．接种针、手、培养基          B．高压锅、手、接种针

C．培养基、手、接种针          D．接种针、手、高压锅

（3）平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续　　　　　的操作，将聚集的菌种逐步     　  分散到培养基的表面。稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度    　　 ，然后将不同稀释度的菌液分别  　　  到琼脂固体培养基的表面，进行培养。

（4）19世纪中期，关系到法国经济命脉的酿造业曾一度遭受毁灭性的打击。在生产过程中，出现了葡萄酒变酸、变味的怪事。根据你所掌握的知识分析导致生产失败的根源是　　　　　　。

解析：微生物培养过程包括培养基的配制、消毒灭菌、接种培养等。（1）培养基灭菌是否彻底，可通过“空载”培养是否会长出菌落来鉴定。（2）高压蒸汽气灭菌锅是灭菌的一个设备，通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环。（3）无论是平板划线法还是稀释涂布平板法，都要求使微生物成单个菌体，最后得到由一个菌体形成的菌落。（4）获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，而葡萄酒生产过程中在起作用的微生物是酵母菌，葡萄酒变酸、变味说明有其他微生物在起作用。

答案：（1）恒温箱　　菌落生长　　菌落生长　　（2）C　　（3）划线　　单个　　稀释　　涂布　　（4）发酵物中混入了杂菌

四、传统发酵技术的应用

发酵工程又称微生物工程，是利用微生物的某些生物功能，为人类生产有用的生物产品，或者直接利用微生物参与和控制某些工业生产过程的一种新技术。是现代生物技术的重要组成部分，也是基因工程的基础。发酵工程以其生产条件温和，原料来源丰富且价格低廉，产物专一，废弃物对环境的污染小和容易处理等特点，而在医药工业、食品工业、农业、冶金工业、环境保护等许多领域得到了广泛的应用，逐步形成了规模庞大的发酵工业。

1．果酒及果醋的制作

①果酒制作的原理：酵母菌是兼性厌氧微生物，在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸（反应式：C6H12O6＋6O2→6CO2＋6H2O），大量繁殖。在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵（反应式：C6H12O6→2CO2＋2C2H5OH）。

②果醋制作的原理：醋酸菌是一种好氧细菌，只有当氧气充足时，才能进行旺盛的生理活动。当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸（C2H5OH＋O2→CH3COOH＋H2O）。

③制作果酒和果醋的实验流程示意图：

挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵→醋酸发酵

　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　↓

　　　　　　　　　　　　　　　果酒　　　　果醋

2．泡菜的腌制

①乳酸菌发酵：泡菜的制作离不开乳酸菌。乳酸菌是厌氧细菌，在无氧的情况下，将葡萄糖分解成乳酸。

②泡菜的腌制和亚的测定的实验流程示意图：

原料加工→修整、洗涤、晾晒、

　　　　　　切分成条状或片状　 →加入调味料装坛→发酵→成品

加盐→盐水冷却→泡菜盐水

例4、在啤酒生产过程中，发酵是重要环节。生产过程大致如下：将经过灭菌的麦芽汁充氧，接入啤酒酵母菌菌种后输入发酵罐。初期，酵母菌迅速繁殖，糖度下降，产生白色泡沫，溶解氧逐渐耗尽。随后，酵母菌繁殖速度迅速下降，糖度加速降低，酒精浓度逐渐上升，泡沫不断增多。当糖浓度下降一定程度后，结束发酵。最后分别输出有形物质和鲜啤酒。根据上述过程，回答以下问题：

（1）该过程表明啤酒酵母菌异化作用的特点是　　　　。

（2）酒精主要是啤酒酵母菌进行          产生的代谢产物。

（3）经测定酵母菌消耗的糖中，98.5％形成了酒精和其它发酵产物，其余1.5％则是用于　　　　。

（4）请写出由麦芽糖→葡萄糖→酒精的反应方程式　　　　。

（5）如果酵母菌消耗的糖（设为麦芽糖，其分子量为342）有98.5％（质量分数）形成了酒精（分子量为46.0）和其他发酵产物。设有500t麦芽汁，其中麦芽糖的质量分数为 8.00％，发酵后最多能生产酒糟浓度为3.20％（质量分数）的啤酒多少吨？

解析：本题主要考核发酵工程在食品工业上的应用，是一道生化综合题。从题干给出的啤酒生产过程分析，在初期，发酵罐中富含氧气，酵母菌经过出芽生殖迅速繁殖，糖度下降，这说明酵母菌在进行有氧呼吸。随后，溶解氧逐渐耗尽，发酵罐内糖度加速降低，酒精浓度逐渐上升，这说明酵母菌在进行无氧呼吸。因此，酵母菌的异化作用类型是既能进行有氧呼吸又能进行无氧呼吸。酵母菌在代谢过程中，分解糖类的目的是获得自身生长繁殖所需的能量。

酶

酶

答案：（1）既能进行有氧呼吸有能进行无氧　　（2）酵母菌自身的生长和繁殖　　（3）无氧呼吸　　（4）C12H22O11+H2O→2C6H12O6    C6H12O6→2C2H5OH+2CO2+能量　　（5）500t×8.00%×98.5%×＝662 t