人工生物膜的制备及其清洗消毒特性的研究

【论著】

人工生物膜的制备及其清洗消毒特性的研究

邱侠,沈瑾,邢书霞,李涛,张流波

(中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所,北京　100021)

提要　目的　研究人工生物膜的制备方法,建立管腔生物膜生成模型,观察其清洗消毒效果评价技术。方法　采用持续灌流培养技术和活菌计数及扫描电镜技术,对人工生物膜及其清洗消毒效果进行了观察。结果　经连续培养6d,灌流污染在聚四氟乙烯管内壁的铜绿假单胞菌形成了粘附稳定性较好的生物膜,膜中含细菌浓度达105

cfu /c m 2

,不易被水成片冲脱。扫描镜下观察可见,用水洗生物膜清除量较少,清洗液清洗去除生物膜量较多。用水

洗加邻苯二甲醛消毒清除生物膜效果不如用清洗液清洗加邻苯二甲醛的清除效果好。结论　铜绿假单胞菌在聚四氟乙烯管腔培养6d 可形成生物膜,并且可用于管腔生物膜清洗消毒效果评价;用清洗液清洗可有效去除管壁上生物膜。

关键词　绿脓假单胞菌;人工生物膜;清洗;消毒中图分类号:R187　　　　　文献标识码:A

STU DY O N THE PREPARAT I O N O F ART I F I C I AL B I O F I LM AN D I TS CL EAN I NG AN D D I S 2

I NFECT I O N PR O PERT Y

Q I U X ia,SHEN J in,X I N G Shu -xia,L I Tao,ZHAN G L iu -bo

(I nstitute for Envir on ment and Health -related Pr oduct Safety,Chinese Center for D isease Preventi on and Contr ol,Beijing 　100021,China )

Abstract 　O bjecti ve 　To study on the p reparati on method of artificial bi ofil m and establish the generati on model of tube -bi ofil m in order t o observe its cleaning and disinfecti on p r operty in laborat ory .M ethods 　Techniques such as continuous perfusi on culture,viable counting and scanning electr on m icr oscopy were used t o observe the cleaning and disinfecti on effects of artificial bi ofil m .Results 　After cultured for 6days,Pseudo m onas aerug inosa bi ofil m adhered t o tefl on tube -wall stably and the bacterial concentrati on was up t o 105cfu /c m 2

app r oxi m ately .This bi ofil m could not be washed by water easily .The SE M observati on indicated that:compared with water,the detergent was able t o re move more bi ofil m and extra 2cellular poly meric substances .After treated with "water +O rtho -phthaladehyde (OP A )

Key words 　Pseudo m onas aeruginosa;artificial biofil m ;cleaning;disinfection

〔作者简介〕　邱侠(1982-),女,广西人,硕士,实习研究员,主要从

事消毒研究工作。

〔通讯作者〕　张流波,E mail:zlbxj@263.com

　　肠镜、胃镜、支气管镜等各种纤维内镜,使用频率高,且难于清洗。这类医疗器械由于材质特殊,构造精密,管腔窦道多,不耐高温、易腐蚀,并经常暴露于胃肠分泌液、血液、唾液、粪便、胆汁等有机质中,极易携带病原微生物。这种管腔内污染微生物容易形成生物膜,给清洗消毒与灭菌处理带来困难,也给医院感染埋下隐患。

近20年来,生物膜在医院清洗消毒中的意义逐渐受到重视,生物膜是细菌生长过程中,为适应生存

环境而吸附于惰性或活性材料表面,形成的一种与浮游细菌相对应的生长方式,由细菌和自身分泌的

胞外基质组成〔1〕

。用超声清洗和机械清洗或刮除,对去除管腔内壁生物膜有较好的效果,水洗或化学方法去除则效果不理想。为研究生物膜去除方法,我们以人工培养生物膜的方法,对不同检测生物膜的方法及其清除方法的效果进行了观察。1　方法

111　生物膜制备方法

11111　选材　试验菌为铜绿假单胞菌(ATCC 15442),由中国科学院微生物所提供;选用内径2

112　管腔生物膜观察

11211　活菌计数法　用10m l无菌生理盐水缓慢冲洗3次生物膜管壁,以去除管壁上的浮游菌。用无菌棉拭往返擦拭管壁20次,将棉拭与聚四氟乙烯管片放入含10m l含量1000mg/L吐温80的磷酸盐缓冲液溶液的试管中,经充分振荡洗脱。将洗脱液经适当稀释,选取适当稀释度进行活菌计数培养。将接种好的平板置37℃恒温培养箱培养18h～24 h,计数琼脂平板上菌落数,推算出单位面积上的菌落数(cfu/c m2)。

11212　染色镜检法　用10m l无菌生理盐水冲洗生物膜管腔内外壁3次后,用甲醛溶液固定5m in,用结晶紫草酸铵溶液中染色3m in,用无菌蒸馏水将残留染料冲洗干净。干燥后,光学显微镜(OM)观察生物膜覆盖情况。

11213　扫描电镜观察法　用10m l无菌生理盐水冲洗生物膜管腔内外壁3次,去除浮游菌后,用25 g/L浓度的戊二醛固定,再依次用pH值714的磷酸缓冲液冲洗,系列酒精脱水,然后用丙酮脱水15 m in,经二氧化碳临界点干燥,离子溅射仪喷金,扫描电镜观察生物膜覆盖情况。

113　清洗消毒效果评价

将附着有成熟细菌生物膜的串接管从培养模型上取下,连接到装有500m l无菌生理盐水中,连接蠕动泵以10m l/m in流速向管腔内连续泵入生理盐水,以冲洗管壁上的浮游菌。冲洗完毕后,将生物膜管分段取下,连接到自动清洗机上,再接入一段长112m的延长管(灭菌的聚四氟乙烯管)。将延长管一端连接到清洗机上,另一端与附着有生物膜的管相连。运行设定程序:①温度20℃清洗(分别进行清洗液清洗和水清洗),即使用腔镜清洗液或单独使用自来水处理管腔,清洗5m in,漂洗4m in;②清洗+消毒(分别在清洗液洗后,再用邻苯二甲醛消毒和水清洗后再用邻苯二甲醛消毒),即经清洗处理5m in、后漂洗4m in、再用5500mg/L邻苯二甲醛液浸泡5m in。

清洗消毒效果评价方法分别按上述活菌计数法和扫描电镜法进行。

114　统计方法

各组试验数据,用Office2000Excel办公软件做曲线图,分析细菌量变化趋势。

2　结果

211　生物膜培养结果

活菌计数结果表明,在菌悬液灌流状态下培养24h,管壁上生物膜含菌数为103cfu/c m2;培养至4 d,管壁上生物膜含细菌数达到105cfu/c m2;培养至6d,管壁上生物膜内细菌数维持在105cfu/c m2;从第7天开始生物膜内细菌量开始下降(图1)

。

图1　不同培养时间管壁上生物膜细菌量变化情况

经结晶紫染色后,光学显微镜下进行比较观察发现,培养4d的管经水冲洗后,内壁上残留细菌生物膜呈斑纹状在内壁上铺开(图2);培养6d的管经水冲洗后,内壁细菌生物膜仍牢固成片附着于管壁,且密度较为均一(图3)。培养6d以后,光学显微镜下观察可见,管壁细菌生物膜质地均一附着于管壁上(图4)。

扫描电镜下观察可见,管壁上细菌生物膜呈现

不规则丘样突起,散在粘附于管壁,呈微菌落生长(图5);高倍电镜下观察发现,大量的细菌被胞外基质包裹,细菌和胞外基质相互粘连成不均一结构,可见杆状细菌轮廓(图6)。212　生物膜清洗消毒效果

光学显镜下观察结果证明,附着有生物膜的管腔经水洗后,仅有部分生物膜从表面剥离(图7-1)。水洗后,加邻苯二甲醛消毒处理的生物膜残留呈不均一状,较水洗组残留生物膜着色浅,提示残留细菌量较前者少(图7-2)。清洗液清洗后残留生物膜量较水洗组少,呈斑点状(图7-3)。清洗液清洗后,加邻苯二甲醛消毒处理,虽然仍有零星细菌生

物膜残留,但该方法去除生物膜效果最好(图7-4)。

电镜观察结果表明,水洗和清洗液清洗后,管壁上仍可见细菌生物膜残留,呈斑块状,二者生物膜残留量差异不大(图8-1,图8-2);高倍电镜下观察水洗和清洗液清洗组,可见两种清洗处理仍存在差异,清洗液处理(图8-4)比单用水洗处理(图8-3)残留生物膜细菌间粘丝样的胞外基质较少。水+OP A 处理后管壁残留生物膜呈现小斑块状(图8-5);清洗液+OP A 处理的管壁上生物膜只存在胞外基质斑点粘附图8-6),前者处理对生物膜清除效果不如后者

。

图2　水冲洗培养4d 生物膜　(OM 40×

)图3　水冲洗培养6d 生物膜　(OM 40×

)图4　水洗培养6d 以后的生物膜　(OM 40×

)图5　电镜下观察生物膜　(SE M 500×

)图6　高倍电镜观察生物膜　(SE M 5000×

)图7-1　水冲洗后生物膜　(OM 40×

)

图7-2　水+OP A 处理的生物膜　(OM 40×

)图7-3　清洗液清洗后生物膜　(OM 40×

)图7-4　清洗液+OP A 处理的生物膜　(OM 40×

)图8-1　电镜下水洗后生物膜　(SE M 500×

)图8-2　电镜下清洗液清洗后生物膜　(SE M 500×

)图8-3　高倍镜下水洗后生物膜　(SE M 2500×

)图8-4　高倍镜下清洗液清洗后生物膜　(SE M 2500×

)图8-5　电镜下水+OP A 处理的生物膜　(SE M 500×

)

(SE M1000×)

3　讨论

在自然界绝大多数的细菌都是以生物膜的形式存在,并且与人类的公共卫生和身体健康密切相关,是多种人类顽固性感染性疾病的根源。本研究参照文献报道建立的体外管腔生物膜培养模型〔3〕,选取铜绿假单胞菌作为培养菌,该菌是生物膜相关感染的主要致病菌之一。除了菌株外,培养时间对生物膜的成熟亦尤为重要,需摸索生物膜成熟的时间。本研究发现,培养6d后,经简单水冲洗,细菌生物膜仍牢固成片附着于Tefl on管壁上,且密度较为均一。因此,选择培养6d的生物膜用于清洗效果评价试验。

目前,有关清洗因子去除生物膜效果的研究报道尚不多,本课题探讨了用水清洗和清洗液清洗两种清洗方法对两种材质管壁上细菌生物膜的去除效果。试验结果显示,电镜、光学显微镜观察结果相似,用清洗液或者水清洗后,Tefl on管腔内壁仍可见残留的细菌生物膜,高倍电镜下观察可见,使用清洗液处理组管壁残留细菌间粘丝状胞外基质相对水处理组少,说明清洗中的酶对胞外基质分解起一定作用。大量研究证实〔4～6〕,生物膜一旦在管腔型器械中形成,则难以去除,并在反复使用、处理、使用的循环过程中逐渐累积,当生物膜积累到一定厚度,消毒及灭菌因子均难以杀灭包裹于其中的细菌。要提高管腔型器械再处理成功率,必须了解生物膜在管腔型器械中生长特性,以及各种清洗因子对生物膜的去除效力。

本试验选择邻苯二甲醛用于生物膜的消毒程序。高倍电镜下观察可见,清洗液+OP A处理后Tefl on管上残留细菌量较少,多数为胞外基质留下的小斑点,而水+OP A处理后可见较多的生物膜细菌。Nguyen-Khoa的研究也证实了这一现象〔8〕,研究者调查血透机常用复用硅胶管(进水管、碳酸盐管、透析管,使用时间为1～3年)的污染情况,电镜下观察到管壁附着的生物膜细菌总量约为103cfu/ c m2～106cfu/c m2,主要为铜绿假单胞菌、芽孢杆菌、酵母菌。试验结果表明,清洗液清洗与水洗处理后管壁残留生物膜量相似,但由于清洗液对细菌胞外基质去除起一定作用,更有利于后续消毒程序进一步去除生物膜。

临床使用后的内镜或复用导管等管腔型器械,尽早冲洗可能对有效的预防生物膜形成有一定作用。其原因是生物膜中细菌对抗菌素、消毒剂和灭菌剂产生的抵抗性,比浮游细菌强1000多倍〔8〕。由于一些较细长的管腔(如纤维内镜的气水管道)无法刷洗,只能用清洗液清洗,所以理想的清洗液,应该满足不需刷洗,即可清除表面所有污渍,包括生物膜〔3〕。有学者用电镜观察从临床使用中内镜更换下的管道发现,所有管道内壁均有细菌生物膜存在〔9〕。

本实验仅对清洗消毒因子作用于管腔生物膜效果进行了定性观察,还需进一步实验定量生物膜去除效果。并且,在体外营养肉汤环境中培养的管腔生物膜,与在临床实际管腔内壁生物膜特性会有不同,实际使用中,管腔内壁可粘附胃液、尿液,化学药剂(如钙、镁盐)等多种物质,在这些物质环境中生长的细菌生物膜的特性,值得进一步研究。

参考文献

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(收稿日期:2009-10-11)

文章编号:1001-7658(2010)03-0249-01　　　

【医院感染控制】

妇科手术患者术后眼结膜炎情况调查

杨小华,王秀娟

(绍兴市妇幼保健院,浙江绍兴　312000)

提要　目的　了解本医院妇科手术患者眼结膜炎感染情况,找出原因,以采取防控措施。方法　通过现场调查和临床检查方法,对本院发生的11例妇科手术后患者眼结膜炎事件进行了调查。结果　本医院在2008年11月14日～18日连续发生11例妇科手术病人眼结膜炎病例,经局部治疗,在5d 内均得到恢复。经分析手术过程各种相关环节,排除了微生物感染的可能性,而是与术中使用防粘连的一次性耗材“粘停宁”致敏有关。结论　本次发生的手术患者眼结膜炎不属于医院感染,而是与致敏性一次性耗材有关,医院应加强对进入身体无菌部位的一次性耗材的管理。

关键词　手术患者;眼结膜炎;致敏性中图分类号:R184　　　　　文献标识码:B

　　在2008年11月14日至18日期间,本医院连续出现11例妇科手术后患者眼结膜炎病例,主要表现为眼结膜充血、红肿、畏光、流泪、视物不清,伴或不伴发热及血白细胞升高,持续5日之内恢复。为了解本次手术后眼结膜炎发生原因,以便有效控制,医院院感科进行了专项调查。现将调查结果报告如下。

1　方法111　临床资料

11例患者均为住院妇科手术患者,其中3例为腹腔镜

下附件切除手术,3例为进腹子宫肌瘤剔除手术,2例为腹腔镜下子宫次全切除手术,1例为腹腔镜下卵巢囊肿剥出术,1例为进腹子宫全切除术加双附件切除术,1例为腹腔镜检查加进腹子宫次全切除术。11例手术患者麻醉方式均为全麻。病人在手术后5h 至3d 出现眼结膜充血、红肿、畏光、流泪、视物不清;3例有少量非脓性分泌物,4例有术后高热,伴血白细胞及中性比例升高,其余患者均有低热。

均给患者眼部局部红霉素眼膏及左氧氟沙星眼水治疗,持续1～5d 症状消退,体温、血象恢复正常。有7例病人在围手术期使用了不同种类抗菌药物,4例患者围手术期未使用抗菌药物。

112　调查方法

采用现场调查方法,由医院院感科对患者的基本情况、手术室的相关情况及术后病房的相关情况进行了调查,调查资料由医院院感管理委员会组织相关临床专家进行了分析讨论。讨论排除了眼结膜炎与手术方式、麻醉方式、麻醉用具、麻醉用药、手术室环境、手术器械、手术医生、护士及麻醉医生等所致感染的可能性。根据患者的症状与体征,结合细菌培养结果,排除了由微生物致结膜炎的可能性,主要考虑

为过敏性原因。

2　结果

调查结果表明,此次妇科11例手术患者眼结膜炎不属于医院感染范围,而是由致敏物质所致。高度考虑与手术中使用防粘连的一次性耗材“粘停宁”有关。依据有:①对患者眼分泌物培养均为阴性;②“粘停宁”为我院最近启用的一种医用可降解防术后粘连的壳聚糖制备而成,所有11例患者术中均使用了“粘停宁”;③“粘停宁”只局限用于妇科手术患者,11例眼结膜炎患者均为妇科手术后患者;④“粘停宁”说明书的禁忌症一栏中提示,医生应有使用任何天然生物材料具有过敏性危险的意识;⑤经资料调查发现其他医院也曾经发生过类似的情况;⑥停用“粘停宁”后,院感科监测未发现类似眼结膜炎的病例报告。

3　讨论

“粘停宁”属于一次性耗材,用于身体无菌部位,目前作为医疗器械被批准,从设备部门采购,而药品是由药监部门批准的,从药剂部门采购,医院采购药品必须经过医院药事管理委员会把关,二者的管理要求不一样,目前绝大多数医疗机构均是采取这样的管理模式。医院临床在实际应用中,进入身体无菌部位的一次性耗材与药品的要求类似,经过此次妇科手术后患者的眼结膜炎事件,我院改变了进入人体无菌部位的一次性耗材的管理模式,将其按照药品的管理模式执行,进购提请医院药事管理委员会讨论,并要求临床在使用过程中密切观察其不良反应,由设备科和院感科共同监督和监测,规范使用管理程序。

(收稿日期:2009-08-06)