植物基因组DNA提取试剂盒的制备与 优化



哈尔滨学院本科毕业论文（设计）
题目：		植物基因组DNA提取试剂盒的制备与
		优化
	院（系）		理学院
	专 业		生物科学
	年 级		09—1班
	姓 名		赵建丰	学号	09051126
	指导教师		郑茂波	职称	副教授
2013年 6月 13日

承 诺 书

本人  赵建丰  ，哈尔滨学院    理    学院，

  生物科学 专业 09—1 班学生，学号：  ********   。

本人郑重承诺：本人撰写的毕业论文：

《  植物基因组DNA提取试剂盒的植制备与优化   》，

是个人的研究成果，数据来源真实可靠，无剽窃行为。

 承诺人 赵建丰          

2013年  6月  13日       

论文类型：理工类
评语：
指导教师（签字） 年 月 日
评语及评分
成绩： 答辩委员会（签字） 年 月 日
院（系）学位评定委员会意见： 签字： 年 月 日	学校学位评定委员会意见： 签字： 年 月 日

毕业论文（设计）评语及成绩

摘 要

DNA是最重要的遗传物质，因此, DNA 的提取方法和技术是生物化学及分子生物学最基本的技术,也是生物工程最常用的技术。提取的DNA 的纯度及结构完整性是进行基因工程各项研究所必需的条件。本文根据植物基因组DNA提取原理，设计了离心柱型植物基因组DNA提取试剂盒，经过大豆、小麦、棉花和水稻等不同植物材料基因组DNA提取结果的完整性和纯度的检测，证明该试剂盒合适多种植物基因组DNA的提取，并且有较好的效果，能在实验室中推广。

关键词：植物DNA提取；提取方法；试剂盒；DNA纯度

ABSTRACT

DNA is the most important genetic material, therefore, DNA extraction method and technology of Biochemistry and molecular biology of the most basic, is also the most commonly used technology of biological engineering. Purity and structural integrity of the extracted DNA was studied in the conditions necessary for the gene engineering. According to the genomic DNA extraction principle, design of centrifugal column type plant genomic DNA extraction kit, integrity and purity detection results after soybean, wheat, extraction of cotton and rice in different plant materials for genomic DNA extraction kit, prove the appropriate plant genome DNA variety, and has good effect, can be extended in the laboratory.

Key words: Plant DNA extraction; extraction method; kit; DNA purity

第一章 前 言

DNA是遗传信息的载体和基本遗传物质，它在遗传变异、代谢等方面起着重要作用，是分子生物学和基因工程研究的对象。自20世纪50年代Watson和Crick提出DNA双螺旋模型以来，分子生物学在广度和深度上都获得空前的发展，DNA作为分子生物学研究的基础，在生物领域尤其是遗传学方面的研究日渐深入，在此基础上产生的基因工程技术已在医药、农业、畜牧业等领域获得广泛应用，DNA的提取是分子生物学研究的基础技术，因此，提取的DNA得纯度及结构完整性是进行基因工程各项研究所必须的条件。而DNA提取试剂盒的出现，满足了快速、方便和大通量的提取需求。

1.1 DNA提取的基本原理与意义

简单地讲，核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。

经典的裂解液几乎都含有去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境 (如 Tris)，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏 (如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl) 等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 裂解的，该方法已经成为了 RNA 抽提的主流，却不是基因组 DNA 抽提的主流。

最常用的纯化方法，一是 PC 抽提 + 醇沉淀，二是介质法。第一种方法是利用 PC 对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，实现核酸与蛋白质的分离；再用醇将核酸沉淀下来，实现核酸与盐的分离。第二种方法则是利用某些固项介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的分离。高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方法的一个变体，省略了 PC 操作的麻烦。当然，也有不纯化的抽提方法，但是用途多局限于简单的 PCR。其它杂质 – 如多糖、多酚等 - 的去除，基本上都是在这两种方法的基础上，通过增加一些特别的试剂，或者增加一些额外的步骤来实现的。

1.2 DNA提取方法

DNA提取的方法分为介质法和非介质法，介质法包括试离心柱式提取法，磁珠法。非介质法包括SDS（十二烷基磺酸钠）法，CTAB铵（十六烷基三乙基溴化）法。

SDS（十二烷基磺酸钠）法：SDS是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与蛋白质之间  常借静电引力或配位键结合, SDS能够破坏这种价键。

CTAB铵（十六烷基三乙基溴化）法：CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。

离心柱式提取法：采用特殊硅基质材料制作的可特异结合DNA的离心吸附柱，根据一定的高盐缓冲系统可高效、专一地吸附DNA、RNA的原理（在高盐、低pH值情况下吸附DNA；低盐、高pH值情况下释放DNA）。去除植物细胞中的蛋白质、糖类等有机化合物采用漂洗液溶解、离心的方式，最后在低盐、高pH值下，用洗脱缓冲液将吸附在硅基质膜上的DNA洗脱下来，从而收集纯化DNA。

磁珠法：依据与硅胶膜离心柱相同的原理，运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。

1.3 硅胶膜对DNA选择性吸收的原理与影响因素

在水溶液中, DNA 分子呈酸性，带负电；silica 表面的硅-氧键水化形成硅烷醇基团(silanol group)也呈弱酸性，带负电，所以两者之间会产生静电排斥，不能相互结合。除非溶液中同时存在一定浓度的阳离子，后者可以通过形成阳离子桥（cation bridge）而中和DNA 和silica 表面的负电荷(即静 电屏蔽)并使二者结合。大量实验数据也证明，DNA 与silica 结合的确需要一定浓度的阳离子（包括Na+，K+, NH4+或Mg2+等），所需最低浓度与溶液的pH 和silica 的种类密切相关，但一般在0.1-1 M 之间。在同样条件下，常见单价阳离子促进DNA-silica 结合的能力从强到弱的次序为K+，Na，NH4。阳离子桥介导的DNA-silica 结合可用下图表示：

图1-1 阳离子桥介导的DNA-silica 结合图

但是，最新的研究发现，DNA 与silica 结合的主要方式并不是阳离子桥，而是DNA 磷酸基团与silica 表面硅烷醇基团之间形成的氢键。阳离子桥的作用只是降低分子间静电排斥，有利于两者接近并形成氢键而已。DNA 与silica 表面形成的氢键可以用下图表示：

图1-2 DNA 与silica 表面形成的氢键图

DNA 与silica 表面形成的氢键结合力比较微弱，但由于其数量巨大，还是能够使DNA 牢固地吸附在silica 表面。实验数据也表明，一旦DNA 与silica 表面结合，用同样浓度的盐溶液不能将其洗脱。结合的速度也比较迅速，85%的DNA 能在1 分钟内结合到silica 表面，在饱和情况下每平方米silica 表面的可结合800-1000 ug 的DNA，结合面积占总的表面积的 30%。与silica 结合的DNA 抵抗DNase 降解的能力比溶液中的DNA 强100 多倍。

影响因素：既然DNA 与silica 表面是通过盐桥和氢键结合，那末凡是影响盐桥和氢键形成的因素都会影响该结合。现将各种因素介绍如下：

silica 材料：DNA 通过其磷酸二酯键与silica 结合，各种DNA 的磷酸二酯键完全相同，所以DNA 来源对结合几乎没有影响；但silica 材料种类繁多，包括各种玻璃纤维，各种硅藻土和各种硅胶膜等等，其表面结构各不相同，吸附DNA 的能力千差万别。silica 表面有三类硅烷醇基团，第一种叫孤立硅烷醇基团，它不与其他分子形成氢键，第二种叫邻位硅烷醇基团（vivinal silanol group）；第三种叫对位硅烷醇基团（geminal silanol group）。它们的结构示意图如下：

图1-3 硅烷醇基团图

一般说来，邻位硅烷醇基团越多，越有利于DNA 与silica 的结合。天泽基因测试过多种silica 材料，发现它们的DNA 吸附率相差可以达到300 倍左右，饱和度能达到800-1000 ug/M2 的只有两三种产品。这些差异可能与silica表面各种硅烷醇基团比例不同有关，所以在设计实验和开发产品时，选用优质的silica 材料十分重要。

 盐浓度和盐种类：盐浓度是影响 DNA 与silica 结合的非常重要的因素之一，DNA 与silica 结合与盐浓度成正比。盐促进DNA 与silica 结合的本质是促进DNA 与silica 的去水化反应，该反应可以用下列反应式表示：DNA-水 + silica-水 中性DNA- silica 复合物 + 游离H2O由反应式可见DNA- silica 复合物和游离水都是反应产物。根据化学平衡原理，凡是降低该反应体系中游离水浓度的因素都能促使反应向右进行，即促进DNA- silica 的形成。众所周知，盐在溶液中要结合大量的游离水，所以上述反应体系中盐离子浓度越高，其去水化能力就越强，越能促使反应向右进行，最后形成的DNA- silica 复合物就越多。

但是，如果反应体系中同时有蛋白质存在，而实验目的只是想纯化DNA，则选择合适的盐十分重要，因为蛋白质在高Kosmotropic 盐（如硫酸铵）和高Chaotropic 盐（如异硫氰酸胍，高氯酸钠和碘化钠等）条件下的化学活性有很大不同。在高Kosmotropic 盐溶液中蛋白质容易盐析出来，容易沉淀在silica 表面（如果溶液中有silica的话）；在高Chaotropic 盐溶液中，蛋白质往往被变性但仍然在溶液中，所以不易沉积在silica 表面污染DNA。同时强力的Chaotropic 盐还能灭活RNase 和DNase 等核酸酶，保护核酸分子完整性；另外它们还能溶解琼脂糖凝胶，所以高浓度的异硫氰酸胍，高氯酸钠和碘化钠等盐溶液已经成为促进DNA- silica 结合的首选溶液。高氯酸钠浓度对DNA- silica 结合的影响可用下图表示：

图1-4 高氯酸钠浓度对DNA- silica 结合的影响图

醇：乙醇等有机溶剂可以通过降低水溶液的介电常数而促进DNA 或蛋白质的沉淀。在DNA 溶液中加入一定比例的醇可以促进DNA-silica 的结合。对于已经形成的DNA-silica 沉淀复合物，它们可以洗去残留的盐离子，但又不破坏DNA-silica 沉淀复合物，所以低盐/乙醇溶液已经成为洗涤DNA-silica 结合物的经典方法。

pH：pH 是跟盐同等重要的影响DNA-silica 结合的重要因素，因为它直接影响DNA 和silica 的带电性，而后者又是盐桥和氢键形成的基础。DNA 在广泛的pH 条件下（pH 3-9）呈酸性，silica 的Ka 在5-7 之间，pH 越高，silica表面的邻位硅烷醇基团就越多，越有利于DNA 吸附。如果pH 超过7，silica 表面电荷将发生较大改变，通过氢键吸附 DNA 的能力将开始降低。当pH 为9 时，其结合DNA 的能力还不到pH5 时的1/10。pH 对silica 的影响见下图：

图1-5 pH 对silica 的影响图

这种影响进而影响到DNA-silica 的结合，如下图所示。

图1-6 pH 对silica 的影对DNA-silica 的结合影响图

 DNA 分子结构：DNA-silica 结合强度跟氢键的多少相关，超螺旋DNA 因空间结构的，与silica 形成氢键的数目将少于同等长度的线性DNA，所以能力稍低于后者。同理，长片段DNA 与silica 的结合稍强于短片段DNA。但是当长度超过一定范围，孔径阻隔（对硅胶膜）和机械拉断（对玻璃奶）等因素的影响将大于结合强度的影响，使长片段DNA 的回收率和完整性反而不如小片段DNA。单链DNA 单位长度的负电荷少于双链，克服静电排斥需要的阳离子也相应较少，所以与silica 结合所需要的最低盐离子浓度也稍低于双链DNA。不过总的说来，DNA 分子结构对DNA-silica 结合的影响不大。

 其他因素：温度对 DNA-silica 结合影响较小，在37℃的吸附只是稍微高于在25℃的吸附。天泽基因的研究还发现，提取核酸的常用成份如SDS，CTAB，PEG 等都会对DNA-silica 结合产生不同程度的影响，所以，最佳的结合条件需要根据具体情况优化。值得一提的是TBE 缓冲液，由于很多DNA 电泳都是在TBE 缓冲液中完成，而TEB中的硼酸能跟silica 表面的邻位OH 基团形成复合物（硼酸的这一特性使之成为研究糖的必不可少的试剂），抑制了DNA-silica 结合，所以胶回收时最好不要使用TBE 缓冲液，否则回收率会比使用不含硼酸的缓冲液低50%以上。

用silica 吸附法提取DNA 的优点是简单、快捷、重复性好、可以同时处理多个样品，纯度能满足大多数分子生物学实验的要求。但它有以下缺点：

不能彻底去除质粒 DNA 中的内毒素，质粒中残留内毒素浓度较高（见下表），所以DNA-silica 吸附法提取的质粒如果不经过Endotoxin Erasol 等内毒素清除剂的处理不能直接用于转染等实验。

表1-1 质粒纯化与残留内毒素表

质粒纯化方法	质粒中残留内毒素 (X1000 EU/mg plasmid DNA)
2 次CsCl纯化	2.5
1 次CsCl 纯化	5.2
Anion Exchange 纯化	9.3
Silica 纯化+ Endotoxin Erasol 处理	10.7
Silica 纯化	1000-2000

文献报道，DNA-silica 吸附法纯化的DNA 中常含有抑制某些性内切酶的成分（可能是细小的silica 晶体），这些性内切酶包括EcoRI、SphI、BglI、NdeI。相同条件下，常用的BamHI, SacI 和NheI 不受抑制。

DNA-silica 吸附法纯化大片段DNA 时容易使DNA 发生机械断裂。硼酸能与 silica 表面的硅烷醇基团反应，降低其与DNA 的结合，所以用DNA-silica 吸附法

纯化TBE 琼脂糖凝胶中的DNA 片段时，回收效率比较低。

1.4 试剂盒的发展情况及优势

　　2011年以来，随着刺激内需效应的逐渐显现以及国际经济形势的好转，植物基因组DNA提取试剂盒下业进入新一轮景气周期从而带来植物基因组DNA提取试剂盒市场需求的膨胀，植物基因组DNA提取试剂盒行业的销售回升明显，供求关系得到改善，行业盈利能力稳步提升。同时，在国家“十二五”规划和产业结构调整的大方针下，植物基因组DNA提取试剂盒面临巨大的市场投资机遇，行业有望迎来新的发展契机。

　　DNA提取试剂盒具有简便、快捷、方便、效果稳定 重复性好等优点。

1.5本文的目的与意义

基于国内外的发展趋势，通过硅胶膜对DNA选择性吸收的原理，我们设计了植物基因组DNA提取试剂盒，从得率、纯度等方面进行实验，进而比较研究。

第二章 材料与方法

2.1材料

2.1.1植物材料  

大豆叶片、小麦叶片、棉花叶片、水稻叶片

2.1.2试剂与耗材

本实验所用的试剂与耗材见下表：

表2-1 试剂与耗材表

试剂与耗材	生产单位
植物叶片
Tris	QIAGEN公司
CTAB	Solarbio公司
NaCl	QIAGEN公司
Na2EDTA	Invitrogen公司
DIECA	宝生物工程〔大连）有限公司
PVP K-30	宝生物工程〔大连）有限公司
β-巯基乙醇	Invitrogen公司
Tris-HCl	Invitrogen公司
EDTA	英国NEB公司
无水乙醇	QIAGEN公司
乙酸铵	QIAGEN公司
双蒸水	宝生物工程〔大连）有限公司
GuSCN	宝生物工程〔大连）有限公司
Ethanol	北京普博欣生物科技有限公司

2.1.3设备与仪器

本实验所用的设备与仪器见下表：

表2-2 设备与仪器表

设备与仪器	生产单位
离心棒	Beckman公司
离心机	赛多利斯科学仪器（北京）有限公司
硅胶模离心柱	上海智城分析仪器有限公司
电泳仪	Firocell公司
电泳槽	Firocell公司
灌胶模具	Astell公司
天平	Beckman公司
高压灭菌锅	上海智城分析仪器有限公司

2.2方法

2.2.1试剂盒的组成

表2-3 试剂盒组成表

缓冲液	试剂
缓冲液1	裂解结合缓冲液
缓冲液2	提取缓冲液
缓冲液3	洗涤缓冲液
缓冲液4	DNA 结合液
缓冲液5	洗脱液
缓冲液6	TE

2.2.2试剂盒组成溶液的配制

（1）裂解结合缓冲液：

表2-4裂解结合缓冲液的配制表

试剂	用量
1.4M NaCl	81.816g
0.02 M Na2EDTA	7.45g
2% CTAB	20g
0.1% DIECA	1g
2% PVP K-30	20g
0.2%β-巯基乙醇	调至ph=8.0

（2）提取缓冲液( 1×)： 

表2-5 提取缓冲液的配制表　　　

试剂	用量	终浓度
Tris-HCl  （1mol/L  PH8.0）	50ml	0.1mol/L
EDTA （0.5mol/L PH8.0）	5ml	0.005mol/L
PVP 40	10g	2%
DIECA（二乙基二硫氢基甲酸）	0.5g	0.1%
裂解缓冲液	500ml
Tris-HCl  （1mol/L  PH8.0）	50ml	0.1mol/L
NaCl	40.95g	1.45mol/L
EDTA （0.5mol/L PH8.0）	5ml	0.005mol/L
CTAB	10g	2%
PVP 40	10g	2%
DIECA（二乙基二硫氢基甲酸）	0.5g	0.1%

（3）洗涤缓冲液(70%乙醇，内含10mmol/L乙酸铵)：　

表2-6 洗涤缓冲液的配制表

试剂	用量
无水乙醇	70mL
乙酸铵	0.077g
双蒸水	定容到100ml

（4）DNA 结合液：　  

表2-7 DNA结合液的配制表 

试剂	用量
GuSCN	3.5M
Tris-HCL	100mM
EDTA	10mM
Ethanol	50%

（5）洗脱液：　

表2-8 洗脱液的配制表

试剂	用量
(NH4)2SO4	2.0M
Tris-HCl	100mM
EDTA pH 8.0	10 mM
磷酸二氢钾(KH2PO4)	0.27g
磷酸氢二钠(Na2HPO4)	1.42g
氯化钠(NaCl)	8g
氯化钾(KCl)	0.2g
NaCl	137mM
KCl	2.7mM
Na2HPO4	10mM
KH2PO4	2mM

（6）TE (Tris-EDTA)：

表2-9 TE的配制表

试剂	用量
Tris-HCl	10mM
EDTA PH=8.0	1mM

配制量：500ml 

配制方法：量取下列溶液于500ml烧杯中 

1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 5ml 

0.5M EDTA PH=8.0 1ml 

向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合；将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存.

（7）常用电泳缓冲液：

Tris-硼酸（TBE）

Tris-乙酸（TAE）

Tris-磷酸（TPE）

表2-10缓冲液表

缓冲液	浓贮存液
Tris—乙酸（TAE）	50ⅹ：242gTris碱57.1ml冰乙酸100ml 0.5mol/L EDTA(ph=8.0)
Tris—硼酸（TBE）	5ⅹ:54gTris碱27.5硼酸20ml 0.5mol/L EDTA(ph=8.0)

2.3提取步骤

取样品20mg，加入液氮，研磨充分。

将研磨的粉末收集到离心管中，加入裂解结合缓冲液，涡旋振荡1min，室温下静置10min，使其裂解充分。

加入130μL提取缓冲液，混匀，涡旋震荡1min。

12,000 rpm（~13,400×g）离心5min，上清液向新的离心管中移入。

加入1.5倍体积的洗涤缓冲液，充分混匀。

将上步所得溶液和沉淀全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若一次不能加完溶液，可分多次转入12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

取500μL洗涤缓冲液注入吸附柱，12,000rpm离心1min，将收集管中的废液倒掉，收集管中重新放入吸附柱。

重复上一步骤。

12,000rpm离心2min，将收集管中的废液倒掉；室温下静置吸附柱5~10min。

选取一个新的离心管，把吸附柱放入其中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50~100μL  DNA 结合液或灭菌水，室温下静置5~10min，12,000rpm离心1min，收集DNA溶液。-20℃保存DNA。

2.4检测方法

（1）琼脂糖凝胶电泳检测

各取5μL基因组DNA提取液，点样于1%琼脂糖凝胶中，于电压125V条件下，进行电泳。室温环境下电泳30min后取出凝胶，用凝胶成像系统检测电泳结果，并拍照。

（2）分光光度计检测

各取1μL样品基因组DNA提取液品稀释至10μL，使用7500紫外可见分光光度计分别测定260nm和280nm处的紫外吸收值，并计算260nm/280nm的比值，来判断提取DNA的纯度。

第三章　结果与分析

（１）琼脂糖凝胶电泳检测

各基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果见图3-1。各种植物提取的基因组DNA主带均很清，表明提取基因组DNA的完整性很好。

图3-1各植物基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图

M：Marker DL15000；1-2：小麦叶片DNA；3-4：水稻叶片DNA；

5-6：大豆叶片DNA；7-8：棉花叶片DNA

（２）分光光度计检测

使用紫外分光光度计测量样品提取的基因组DNA溶液，在260nm和280nm处的吸收值，既OD260和OD280，平行测量3次并计算其平均值，计算出的OD260与OD280的比值。见表： 

 表3-1 OD260/OD280比值表

提取法	OD260/OD280值
大豆叶片	1.84
小麦叶片	1.83
棉花叶片 水稻叶片	1.85 1.86

结果显示，大豆叶片、小麦叶片、棉花叶片和水稻叶片提取的基因组DNA的OD260/OD280均在1.8~2.0之间，检测结果证明提取的基因组DNA均有很好的纯度。

结 论

该试剂盒提供了从植物组织和植物培养细胞中快速简单地提取基因组DNA的方法。该方法采用简便的硅胶柱结合纯化方式和独特的溶液处理系统，能快速地去除多糖类、酚类、酶抑制物等杂质，纯化的DNA可直接用于PCR、酶切和杂交等实验。提取过程不需要用到有害的酚氯仿等有机物提取，也不需要用到耗时的异丙醇和乙醇沉淀，纯化的基因组DNA几乎不含有RNA或蛋白质的污染。操作者可获得高纯度的基因组DNA。所以，植物DNA提取的试剂盒的方法简便、安全，可靠、效果好。

参考文献

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[ 9] 蔡胜和, 杨焕明. 方兴未艾的古代DNA 的研究[ J] . 遗传,2000, 22 ( 1) : 41􀀁46.

致 谢

毕业论文暂告收尾，这也意味着我在哈尔滨学院的四年学习生活即将结束。回首既往，自己的一生最宝贵的时光能与这样的校园中之中，能在众多学富五车，才华横溢的老师们的熏陶下度过，实在荣幸至极，在这四年的时间里，我在学习上和思想上都受益匪浅。这除了自己的努力外，与各位老师、同学和身边的朋友的关心、支持和鼓励是分不开的。

论文的写作是枯燥艰辛而又富有挑战的。老师的谆谆诱导、同学的出谋划策及家长的支持鼓励，是我坚持完成论文的动力源泉。在此，我要特别感谢我的指导教师郑茂波老师。从论文的选题、文献的采集、框架的设计、结构的布局到最终的论文定稿，从内容到格式，从标题到标点，老师都耐心的一一指导。没有郑老师的辛勤栽培、孜孜教诲，就没有我论文的顺利完成。

感谢生物科学09—1班的同学们，与他们的交流使我受益颇多。最后要感谢我的家人以及我的朋友对我的理解、支持、鼓励和帮助，正是因为有了他们，我所做的一切才更有意义；也正是因为有了他们，我才有了追求进步的勇气和信心，时间的仓促及自身专业水平的不足，整篇论文肯定存在尚未发现的缺点和错误，恳请阅读此篇论文的老师、同学，多予指正，不胜感激！