LightShift Chemiluminescent EMSA



LightShift Chemiluminescent EMSA Kit

	Gel shift assay detection of DNA:protein interactions that does not require radioisotopes or digoxigenin. 5 / 5 Read 1 review  Write a review Share this product The Thermo Scientific LightShift Chemiluminescent EMSA Kit is an extraordinarily robust and sensitive system for performing electrophoretic mobility shift assays (EMSA) to identify and characterize protein-DNA binding interactions. The kit includes reagents for setting up and customizing DNA binding reactions, a control set of DNA and protein extract to test the kit system, stabilized streptavidin-HRP conjugate to probe for the biotinlabeled DNA target, and an exceptionally sensitive chemiluminescent substrate module for detection. Highlights: ∙Excellent for detecting low-abundance proteins in nuclear extracts ∙Sensitivity that surpasses radioactive and digoxigenin methods ∙Compatible with previously established binding conditions for popular DNA-protein interactions ∙Includes EBNA control system to help new users develop a working assay and understand the methods used to confirm binding interaction specificity Product Details: The principle for LightShift EMSA Detection is similar to a Western blot. Biotin end-labeled duplex DNA is incubated with a nuclear extract or purified factor and electrophoresed on a native gel. The DNA is then rapidly (30 minutes) transferred to a positive nylon membrane, UV crosslinked, probed with streptavidin-HRP conjugate and incubated with the substrate. The protocol from labeling to results can be accomplished in a single day.
Procedure summary for the Thermo Scientific LightShift EMSA Kit.

The interaction of proteins with DNA is central to the control of many cellular processes including DNA replication, recombination and repair, transcription, and viral assembly. One technique that is central to studying gene regulation and determining protein:DNA interactions is the electrophoretic mobility shift assay (EMSA).

The EMSA technique is based on the observation that protein:DNA complexes migrate more slowly than free DNA molecules when subjected to non-denaturing polyacrylamide or agarose gel electrophoresis. Because the rate of DNA migration is shifted or retarded upon protein binding, the assay is also referred to as a gel shift or gel retardation assay. Until conception of the EMSA protein:DNA interactions were studied primarily by nitrocellulose filter-binding assays.

All that is needed to perform the assay is purified DNA target that has been end-labeled with biotin, the protein extract to be tested, nylon membrane and basic electrophoresis equipment. DNA targets can be synthesized with 5' or 3' biotin labels or they can be labeled after synthesis using the Thermo Scientific Biotin 3' End DNA Labeling Kit (Product No. 818). Nuclear, cytosolic or whole cell protein extracts can be obtained by a variety of methods, including the Thermo Scientific NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent Kit (Product No. 78833).

EMSA results using the EBNA control system. Biotin-labeled 60 bp duplex bearing the EBNA-1 binding sequence was incubated with an extract in which the EBNA-1 protein was overexpressed. The binding buffer was supplemented with 50 ng/µl poly(dI•dC), 10% glycerol and 0.05% NP-40. Exposure time was 30 seconds with X-ray film.

 

Chemiluminescent EMSA of four different DNA:protein complexes. Biotin-labeled target duplexes ranged in size from 21-25 bp. The EBNA reactions were supplemented with 2.5% glycerol and 0.05% NP-40, and the AP1 reactions were supplemented with 10% glycerol. The source of the Oct-1, AP1 and NF-κB transcription factors was a HeLa nuclear extract. EBNA-1 extract is provided as a control in the kit. Unlabeled specific competitor sequences (where used) were present at a 200-fold molar excess over labeled target. X-ray film exposure times for each system ranged from 2 minutes for EBNA, Oct-1 and AP1, and 5 minutes for NF-κB.

 

More sensitive EMSA detection than other gel shift assay methods. Comparison of the LightShift EMSA Kit to a popular digoxigenin-based EMSA kit and a radioactive method. Serial dilutions of a labeled DNA duplex were electrophoresed on a 6% polyacrylamide gel and detected according to the manufacturer’s instructions. Comparable sensitivity (<50 attomoles) was achieved with the LightShift EMSA Kit and radioactivity (2,000 cpm 32-P/fmol), although a significantly longer exposure was required for the 32P-labeled DNA. Equivalent exposures using the two chemiluminescent kits showed that the sensitivity of the LightShift EMSA Kit was approximately eight-fold greater than that of the digoxigenin kit.

 

Better EMSA results in less time.Comparison of the LightShift EMSA Kit to a popular digoxigenin-based EMSA kit and a radioactive method. A 22-bp duplex containing the binding sequence for the transcription factor Oct-1 was labeled for use in either the LightShift EMSA Kit, a digoxigenin-based EMSA kit or with 32P using T4 polynucleotide kinase (40,000 cpm/reaction) for use in traditional radioactive EMSA. Binding reactions were equivalent in that 20 fmol duplex was incubated with 6.8 µg HeLa cell NE-PER Nuclear Extract (where indicated). The chemiluminescent kits were used according to the manufacturer’s instructions. For the radioactive EMSA, the gel was exposed directly to X-ray film using screens.

References:

1Guadix J. A. et al. (2011) Wt1 controls retinoic acid signalling in embryonic epicardium through transcriptional activation of Raldh2. Development. 138, 1093-7.

2Gau B.-H. et al. (2011) FUBP3 interacts with FGF9 3' microsatellite and positively regulates FGF9 translation. Nucleic Acids Res., gkq1295.

3Cai Q. et al. (2011) Replication and functional genomic analyses of the breast cancer susceptibility locus at 6q25.1 Generalize its importance in women of Chinese, Japanese, and European ancestry. Cancer Res. 71, 1344-55.

4Yoo C. Y. et al. (2010) The Arabidopsis GTL1 transcription factor regulates water use efficiency and drought tolerance by modulating stomatal density via transrepression of SDD1. Plant Cell. 22, 4128-41.

5Sultana H. et al. (2010) Anaplasma phagocytophilum induces actin phosphorylation to selectively regulate gene transcription in Ixodes scapularis ticks. J. Exp. Med. 207, 1727-43.

6Husain M. et al. (2010) Redox sensor SsrB Cys203 enhances Salmonella fitness against nitric oxide generated in the host immune response to oral infection. PNAS. 107, 14396-401.

Related Resources:

Tech Tip: Modify and label oligonucleotide 5´ phosphate groups

Tech Tip: Anneal complementary pairs of oligonucleotides

LightShift Chemiluminescent EMSA FAQ

Related Products:

Biotin 3´ End DNA Labeling Kit NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Reagent Kit Biodyne B Nylon Membrane for Chemiluminescent EMSA Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module LightShift Chemiluminescent RNA EMSA Kit

Ordering Information
Product #	Description	Pkg. Size	Instructions	MSDS	CofA	Price
20148	LightShift Chemiluminescent EMSA Kit  Sufficient components for 100 binding reactions and detection reagents for ~800 cm2 of membrane. Kit Contents:  LightShift EMSA Optimization and Control Kit (20148X, available separately) 10X Binding Buffer, 1mL Biotin-EBNA Control DNA, 50µL Unlabeled EBNA DNA, 50µL EBNA Extract, 125µL Poly (dI•dC), 125µL 50% Glycerol, 500µL 1% NP-40, 500µL 1 M KCl, 1mL 100 mM MgCl2, 500µL 200 mM EDTA pH 8.0, 500µL 5X Loading Buffer, 1mL  Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module (880, available separately) Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate, 1.5mL Luminol/Enhancer Solution, 80mL Stable Peroxide Solution, 80mL Blocking Buffer, 500mL 4X Wash Buffer, 500mL Substrate Equilibration Buffer, 500mL	Kit				Local contact
20148X	LightShift EMSA Optimization and Control Kit  Kit Contents:  10X Binding Buffer, 1mL Biotin-EBNA Control DNA, 50µL Unlabeled EBNA DNA, 50µL EBNA Extract, 125µL Poly (dI•dC), 125µL 50% Glycerol, 500µL 1% NP-40, 500µL 1 M KCl, 1mL 100 mM MgCl2, 500µL 200 mM EDTA pH 8.0, 500µL 5X Loading Buffer, 1mL	Kit				Local contact
20148E	LightShift Poly (dI-dC)  1µg/µL solution	125µL				Local contact

5 / 5

very sensitive, very safe

June 15, 2011

bwcakla

∙Top 10 contributor

Country United States

Performance 

5 / 5

Quality 

5 / 5

Design 

5 / 5

Ease of Use 

4 / 5

I was skeptical that the results with this product would be close to 32p detection, but I is. While the detection procedure is more hands on than with 32p, the total detection time is shorter. You can achieve attamole levels of detection in just a few minutes using the LightShift Substrate and standard grey backed x-ray film. Because standard pre-cast 1X TBE mini gels are fine, there's no need to cast large sequencing gels.

The instructions recommend not to use old western blotting transfer sponges - this is very true! Old sponges and old TBE buffers will cause high background during the detection. Rusty razor blades and scissors will do the same.

The optimized blocking buffer included in the kit is the key to low background. It's also available separately as of a year or so ago.

A great product!

Yes, I recommend this product.

Products related to my review

Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit

Nucleic Acid Detection Blocking Buffer