TUNE法检测细胞凋亡

1  原理

TUNEL（terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling, 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法）是通过检测细胞凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况来评价细胞凋亡的有效方法。细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30﹪的染色体DNA在Ca ² 和Mg² 依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体式DNA片段（核小体式剪切）。由于DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口即可产生一系列DNA的3’-OH末端。

增加细胞膜通透性 → 脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）和 荧光素（fluorescein）标记的dUTP进入细胞内 → 在TdT的辅助下dUTP与凋亡细胞中断裂DNA的 3’-OH末端结合 → 再用辣根过氧化酶(HRP)标记的抗荧光素抗体与dTUT上的荧光素（fluorescein）特异结合（荧光显微镜观察）→ 最后用辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）、过氧化氢与HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色 → 特异准确地定位正在凋亡的细胞 → 普通显微镜下观察和计数不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。

由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞爬片、涂片）的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。

2   器材与试剂

2.1 器材：

光学显微镜及其成像系统、染色缸、湿盒、各种规格的加样器及头、镊子、24孔或6孔板、盖玻片、载玻片、1.5ml eppendorf管、平皿、吸管、锡纸、摇床、计时表、荧光显微镜、光镜、MARKER笔、冰盒、恒温箱、加湿器、塑料缸、微波炉等。

2.2 试剂

2.2.1试剂盒内容：ROCHE（10人份）

（1）50μl酶浓缩液（TdT-enzyme solution）10×  蓝色   来源：小牛胸腺，大肠杆菌重组

（2）550μl标记溶液（label solution）      1×   紫色，核苷酸混合物  荧光素标记

（3）700μl转化剂-POD（converter-pod）  即用型  黄色，抗荧光素抗体，来源于绵羊的Fab片段，与horse-radish peroxidase偶联

注意：3个试剂用前-20度保存，解冻后就都不能反复冻融，溶解后只能在4度保存， 1和2在4度放1个月或3放6个月应该没问题（有放3近10个月做的效果还挺好）。

1和2绝不能一次配好分装，配好后，哪怕立即冻存下次也不能用了。只能一次融解，按1：9用多少配多少，配好后直到使用时要一直放在冰上，余放4度保存。

2.2.2 需准备试剂

2.2.2.1 一般试剂：双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70％）、中性树胶、盐酸酒精、苏木素染液等。

2.2.2.2 黏附细胞、细胞涂片

（1）PBS（pH7.4）

（2）封闭液：3%过氧化氢-甲醇（新鲜制备）: 20ml中含30%过氧化氢2ml，甲醇18ml（有用0.3%过氧化氢-甲醇的）

（3）固定液：4%多聚甲醛-PBS pH7.4 （新鲜制备）：100ml：4g 多聚甲醛溶于PBS 中，定容到100ml，存放在密闭容器中，65度水浴中溶解，4度保存（两周内使用）。

（4）渗透液:0.1%Triton X100-0.1%柠檬酸溶液（新鲜制备并4度预冷）:先配10×即1%的柠檬酸钠溶液，然后，配20ml渗透液：水17.98 ml  + 1%的柠檬酸钠溶液2ml + Triton X-100 20μl。注意：曲拉通比较黏稠，用加样器吸取后加入时，不要接触溶液，以免凝成砣样，使含量不足。加入后剧烈摇晃可溶。（有用0.2% Triton X100）

（5）DAB（新鲜制备）

2.2.2.3 石蜡包埋组织

（1）PBS（pH7.4）

（2）无核酸酶的Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl, pH 7.4-8）

（3）下列3项任选一项：

A：渗透液（同上）

B：无核酸酶的胃蛋白酶（0.25%-0.5% in HCL，pH2.0）或胰蛋白酶（0.01N HCL）

C：0.1M柠檬酸缓冲液，pH6.0，微波修复。

（4）DAB（新鲜制备）

2.2.2.4阳性对照

（1）DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5, 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）

2.2.2.5困难组织

（1）PBS（pH7.4）

（2）0.1M柠檬酸缓冲液，pH6.0，微波修复。

（3）0.1MTris-HCL，pH7.5，含3%BSA、20%正常牛血清

3 操作步骤

3.1 流程图

3.2 详细步骤：

3.2.1黏附细胞、细胞涂片等

3.2.1.1细胞准备及固定

（1）准备培养皿、载玻片或盖玻片 → 取对数生长期细胞 → 接种培养皿中载玻片或盖玻片（把细胞液滴在盖玻片上，不溢出四边，待细胞贴壁后再补加液体，200μ液体在37度孵箱内可留30小时，400μl液体3天没问题） →  药物等处理 →拿出无菌室，吸弃培养液，37度PBS洗3次（时间不用太长3-5min）或取出载玻片，放入玻璃切片缸内用PBS洗 → 去净PBS，加新鲜配制的4%多聚甲醛，室温（15-25度）固定60min（不能用甲醛代替，因市售甲醛中含甲醇）（有固定25min的）。

对于细胞涂片：载玻片准备：载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸（在载玻片表面铺上薄薄的一层，晾干，去离子水漂洗，在空气中干燥30-60min，干燥后4度保存备用（可保存7天）。适当方法诱导细胞凋亡，同时设未经诱导的对照组，各组离心收集约1×106个细胞，PBS洗一次，重悬，加到铺好的多聚赖氨酸载玻片上，自然干燥，使细胞很好的吸附到载玻片上。放入玻璃切片缸内，加新鲜配制的4%多聚甲醛，室温（15-25度）固定60min（不能用甲醛代替，因市售甲醛中含甲醇）。（有固定25min的）

3.2.1.2 封闭

取出载玻片放入另外玻璃切片缸内，PBS洗3次，摇床上5min → 取出切片，放在湿盒中（用滤纸小心吸去样本区域周围的多余液体，无明显水珠，湿而不干），滴加3%过氧化氢-甲醇室温作用10min（高浓度的过氧化氢可能会影响结合力，故可根据实验将其浓度下调，如0.3%）

3.2.1.3 渗透处理

载玻片放回玻璃切片缸内 → PBS洗3次，摇床上5min（期间冰箱4度预冷湿盒） →取出切片，放在湿盒中（用滤纸小心吸去样本区域周围的多余液体，无明显水珠，湿而不干），滴加渗透液，放入冰箱4度孵育2-5min

3.2.1.4 标记反应

载玻片放回玻璃切片缸内 → PBS洗2×5min（此PBS要预冷，洗在4度冰箱进行，期间用手摇晃）→ PBS洗的过程中准备标记反应混合物（方法：融解管1和管2，置于冰上，从管2中取100μl用作2次阴性对照，将管1中的50μl酶浓缩液加入管2，混匀，置于冰上知道使用，如果一次用不完，用多少配多少，在1.5的EP管中配）→取出切片，放在湿盒中（用滤纸小心吸去样本区域周围的多余液体，无明显水珠，湿而不干），滴加标记反应混合物50μl/片（可根据需要调整：片大小和细胞多少等。标记所加区域） → 37度，避光反应60min（也有过夜）（为防蒸发和保证液体分布均匀可用PE手套或保鲜膜或盖玻片覆盖，在湿盒内进行不盖也可），阴性对照只加50μl分出的管2溶液

3.2.1.5 荧光显微镜观察

在暗室内用PBS洗2次，每次3min，可用荧光显微镜观察

3.2.1.6  POD转换

载玻片放回玻璃切片缸内 → PBS洗3×5min → 取出切片，放在湿盒中（用滤纸小心吸去样本区域周围的多余液体，无明显水珠，湿而不干）滴加管3液体50μl/片（一定和加标记反应混合物区域一致） → 37度，避光反应30min（也有过夜）（为防蒸发和保证液体分布均匀可用PE手套或保鲜膜或盖玻片覆盖，在湿盒内进行不盖也可）

3.2.1.7 DAB显色、复染、分化、脱水、中性树胶封片、光镜观察

载玻片放回玻璃切片缸内 → PBS洗3×5min → DAB显色，光镜观察控制显色，底面出现适量黄色时水洗终止 → 复染、分化、脱水、中性树胶封片、光镜观察

4 其它 注意事项 

4.1   如果20×DAB 溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。

4.2  荧光素标记的dUTP液含甲次砷酸盐和二氯钴等致癌物，可通过吸入、口服等途径进入机体，注意防护。

4.3   结果分析时注意：

假阴性：个别形式的凋亡可能存在DNA未断裂或断裂不完全；空间阻碍效应（如细胞外基质成分等）阻碍TdT等与DNA断端的接触等。

假阳性：坏死后期DNA广泛断裂，增殖过旺盛或代谢过活跃的细胞可能也有DNA断裂。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断（未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体）

4.4 把握好细胞通透的时间，标准：保证酶和抗体进入胞内。

4.5 TUNEL反应液时间。一般是37度1h，也可以根据凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2h，但要结合最终的背景着色。

4.6 PBS的充分清洗，在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。