啤酒酵母生产性能的研究

生物技术专业  2004级  刘莉莉

摘要：在生产过程中，啤酒酵母繁殖几代之后往往容易发生优良性状衰退的现象。因此必须进行分离纯化。本实验通过对实验室保藏的啤酒酵母菌株的进行分离纯化，得到10株菌，通过进一步试验，对其发酵度、发酵速度、双乙酰还原能力、凝聚性、死灭温度等五项性能进行测定，从而筛选出发酵度高，发酵速度适中，双乙酰还原能力强，凝聚性好，死灭温度适中的1株优良啤酒酵母菌株。

关键词： 啤酒酵母；筛选；性能测定

        Research About Performance Of Beer Yeast 

            Technology of biology   Grade 2004   Liu lingli

Abstract: In the procession of production, after several generations of breeding, fine traits of brewer's yeast are often prone to recession. Therefore separation and purification for the beer yeast are needed. In the experiment, we did separation and purification of the beer yeast which is Preserved in our Laboratory and gained 10 good strains. In order to select better the strains, I did further experiment such as determinate their fermentation, the speed of fermentation, diacetyl reduction capacity, cohesion, heat death temperature and so on.Then we selected a good strain of beer yeast with high diacetyl reduction capability and cohesion, and moderate temperature heat death and Provide a good set of methods to determine the performance of beer yeast for the production of beer.  

Key words: Beer Yeast; Selection; Performance Measurement 

1、前言

1.1 啤酒酵母的概述：

啤酒酵母属单细胞生物,直径5-10UM，在分类学上属于微生物界，真菌门，子囊菌纲，内孢霉目，内孢霉科，酵母属啤酒酵母种[1]。

啤酒酵母是用于酿造啤酒的酵母。多为酿酒酵母的不同品种。啤酒酵母在麦芽汁琼脂培养基上菌落为乳白色，有光泽，平坦，边缘整齐。无性繁殖以芽殖为主[2]。能发酵葡萄糖、麦芽糖、半乳糖和蔗糖，不能发酵乳糖和蜜二糖。1883年E．C．Hansen开始分离培养酵母并将它用于酿造啤酒。丹麦Carlsberg酿造研究所的下面酵母是有名的。其它著名的啤酒酵母有德国的Saaz型下面酵母，英、日等国的上面酵母.

1.2 啤酒酵母的分类 

按细胞长轴与短轴的比例，可将啤酒酵母分为三组。第一组的细胞多为圆形、卵圆形或卵形（细胞长轴/短轴＜2，主要用于酒精发酵、酿造饮料酒和面包生产。第二组的细胞形状以卵形和长卵形为主，也有圆或短卵形细胞(细胞长轴/短轴≈2)。这类酵母主要用于酿造葡萄酒和果酒，也可用于啤酒、蒸馏酒和酵母生产。第三组的细胞为长圆形(细胞长轴/短轴＞2)。这类酵母比较耐高渗透压和高浓度盐，适合于用甘蔗糖蜜为原料生产酒精[3]。

根据啤酒酵母的发酵方式，将啤酒酵母分为上面酵母和下面酵母。上面酵母在发酵过程中处于发酵液的上面，而下面发酵酵母在发酵完毕后即沉于发酵罐的底部，由此而命名。在国外所采用的酵母通常都是上面酵母，而在中国国内所采用的酵母主要是下面酵母。由上面酵母发酵而成的酵母称为上面发酵啤酒，在发酵过程中，酵母随CO2浮到发酵液面上，发酵温度15-20℃。啤酒的香味突出。由下面酵母发酵而成的啤酒称为下面发酵啤酒，发酵完毕，酵母凝聚沉淀到发酵罐底部，发酵温度5-10℃，啤酒的香味柔和。

1.3 啤酒酵母的保藏

啤酒酵母的保藏是根据酵母的生理特点，对其进行低温、缺水、缺氧等处理，使其处于生长繁殖受抑制的休眠状态，从而达到保持啤酒酵母性状的目的。啤酒酵母保藏需专人负责，主要采取以下方法保藏：(1)液体石蜡保藏；(2)固体麦汁斜面保藏；(3)液氮保藏； (4)汉生罐保藏[4]。

1.4 啤酒酵母的主要生产性能：

目前，对啤酒酵母性能的研究主要有发酵度、发酵速度、凝聚性、耐高温、双乙酰还原能力等几方面的研究，其中对双乙酰的研究尤其多。双乙酰是啤酒发酵过程中的重要副产物之一,也是衡量啤酒质量的主要指标。如果在生产过程中控制不当,就会使双乙酰含量超过其阈值, 从而给啤酒带来令人不愉快的“馊饭味”, 致使啤酒风味改变。根据双乙酰的生成机理可知，通过抑制α - 乙酰乳酸的生成可以抑制双乙酰的生成,而缬氨酸是α - 氨基氮中的一种重要成分,所以α - 氨基氮的含量高低直接影响双乙酰生成的多少。通过研究，有以下几种方法可以用来降低麦芽汁中双乙酰的含量：1）从高浓度双乙酰含量的培养基中筛选分离抗双乙酰的啤酒酵母变异菌株。这样的菌株能增加对双乙酰的还原速率,因此,用它发酵的啤酒中双乙酰含量很低。2）加速α - 乙酰乳酸的分解速度。提高发酵温度α - 乙酰乳酸的非酶解和双乙酰的酶还原作用都与温度有关,温度愈高,反应愈快。通风搅拌发酵时通风搅拌能加速α - 乙酰乳酸的非酶分解, 虽然同时也加速了α - 乙酰乳酸的合成, 但总的来说对降低双乙酰的含量是有利的。3） 降低接种麦汁的pH值将接种麦汁的pH值降低至4.4左右, 并不影响发酵速度, 但在低pH值下, 双乙酰及其前驱物质的浓度均有所降低, 其原因: 一方面是α - 乙酰乳酸的生成量减少,另一方面从α - 乙酰乳酸变为双乙酰的速度加快了。通过对生产过程中生产工艺的控制可以在一定程度上降低双乙酰对啤酒风味的影响，然而在进行巴氏消毒是往往容易发生双乙酰的反弹。啤酒中双乙酰含量高及反弹主要是由α - 乙酰乳酸的存在造成的, 只要啤酒中含有α - 乙酰乳酸和溶解氧, 就会出现双乙酰含量高及反弹现象, 所以, 控制啤酒中双乙酰含量及反弹主要有以下两个途径。1）控制酒体中α - 乙酰乳酸及双乙酰的含量。若在发酵前期α - 乙酰乳酸不能彻底分解, 双乙酰还原不完全, 发酵后期α - 乙酰乳酸的分解以及双乙酰的还原更为困难,酒体中将出现双乙酰、α - 乙酰乳酸含量都高的现象。所以, 在固定发酵周期的情况下, 发酵过程中必须严格执行发酵工艺, 采取有效措施, 尽量缩短繁殖期; 主酵期, 控制好主酵期的降糖速度。减少酒体中双乙酰及α - 乙酰乳酸的含量, 以达到控制减少啤酒中的双乙酰含量及反弹幅度。2） 控制发酵后期滤酒、灌装过程中氧的溶入在有CO2 回收设备的厂家, 酒液转移时可采用CO2 背压, 这样可避免此阶段氧与酒液的直接接触。如果在灌装过程中没有采取激泡排氧措施, 使得瓶颈空气中氧含量高, 巴氏杀菌后,α - 乙酰乳酸就会加速分解,氧化脱羧形成大量的双乙酰。货架期保存后也会因α - 乙酰乳酸的氧化脱羧形成较多的双乙酰。所以, 采用激泡装置是去除瓶颈空气的一个有效措施[5].

1.5 啤酒酵母性能研究的意义：

酵母是主要令啤酒发酵的成分。在啤酒生产过程中，啤酒酵母利用发酵液中的葡萄糖、麦芽糖、半乳糖和蔗糖等糖类进行发酵，产生酒精、CO2等，经过后发酵后过滤即成为我们所喝的啤酒。经过啤酒酵母发酵而成的啤酒经常存在以下三方面的问题：首先是非生物稳定性不好。指在啤酒的保存过程中由非微生物因素产生的浑浊沉淀可能性。最常见的啤酒非生物浑浊是所谓蛋白质浑浊。其次是风味异常。酵母、原料﹑生产工艺、生产过程中的微生物管理等问题菌可引起啤酒的风味异常。主要表现为口味粗涩、苦味不正、有氧化味、双乙酰味、酵母味等。再次是喷涌现象的发生。这指的是啤酒在启盖後发生的不正常窜沫现象。严重时会窜出流失多半瓶啤酒。其主要原因为原料大麦在收获时受潮感染上霉菌等。要解决以上三个问题，除了严格发酵原料的质量、生产过程中的微生物管理、生产工艺等，选择一株生产性能良好的啤酒发酵酵母更为重要。

啤酒酵母在啤酒生产过程中起着非常重要的作用。而其性能的好坏也直接关系到了啤酒风味、稳定性等的好坏。在生产过程中，啤酒酵母由于受到周围物理环境、化学环境以及微生物环境等多方面的影响，在生产性能上往往容易发生一定程度的退化，如发酵度低、双乙酰还原能力差等，这些性能的退化直接导致了啤酒的风味，稳定性等的变化。因此，在啤酒生产过程中，需要定时对啤酒酵母的生产性能进行测定，从而从中筛选出生产性能优良的菌株投入到发酵生产中去，淘汰掉生产性能已经退化了的菌株。

2.实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1实验菌株：酵母泥

2.1.2实验试剂：

氢氧化钠 盐酸 无菌水 

硫酸钙缓冲液：取0.51g水合硫酸钙、6.80g醋酸钠、4.05g冰醋酸，溶解后定容至1.0L[6]

2.1.3培养基： 

a.麦芽汁培养基：

取1kg麦芽用水浸泡24h后，磨成汁，稀释至浓度为12Brix。

b.麦芽汁琼脂培养基：

稀释麦芽汁至浓度为12Brix。按2%的比例将琼脂加进上述麦芽汁中，调整至pH5.4,加热溶解，然后将此培养基分装试管中。高压灭菌，110℃，30分钟

c.酵母菌富集培养基：

葡萄糖5% 尿素0.1%  硫酸铵0.1%  磷酸二氢钾0.25%  磷酸氢二钠0.05%   7水合硫酸镁0.1%  7水合硫酸铁0.01%  酵母膏0.05%  孟加拉红0.003% pH4.5[7]

2.1.4实验器材：

电子天平  显微镜  高压蒸汽灭菌锅  恒温箱 无菌操作台  糖度计  离心机  震荡器  分光光度计  水浴锅

2.2实验方法

2.2.1菌种活化和培养

取0.5g生产用酵母泥加入含有150ml无菌酵母富集培养基的250ml三角瓶中培养1~1.5天后，对菌液进行稀释，在培养皿上进行平板培养，划线分离，重复此过程2~3次，使菌种充分活化。从中挑选出10支菌落形态良好的菌株。将这10支菌分别接入含有80ml麦芽汁培养基的100ml三角瓶中，以备后面实验使用[8]。

2.2.2 酵母菌的性能测定

2.2.2.1凝聚性的测定实验

  本实验对啤酒酵母凝聚性的测定是通过离心机来完成。通过对啤酒发酵液的离心，得到啤酒酵母沉降系数，通过与参数的对照，从而对啤酒酵母凝聚性的强弱进行测定。离心就是利用离心机转子的高速旋转而产生的强大的离心力，加快液体中颗粒的沉降速度，从而将样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开[9]。

凝聚性的测定

a.将上述选出的10株菌，分别接入含有300ml麦芽汁培养基的500ml三角瓶中,置于25℃生化培养箱中培养3～4天,取出摇匀，然后将培养液在2500r/min的转速下离心5分钟，分离，倒出上部清液，得到沉降的酵母泥测凝聚性。

b.取4～6g酵母泥放入盛有30mlpH为4.5的CaSO4缓冲液(内含醋酸钠和醋酸)的离心管中，摇匀，在2500r/min的转速下离心5分钟，去上清液，保留沉淀的酵母泥。

c.用30ml硫酸钙溶液洗涤酵母，在2500r/min的转速下离心5分钟，去上清液，保留底部酵母泥。

d.向15ml标准离心管中加入10ml硫酸钙缓冲液，加入上述酵母1g，用手震荡使其悬浮，在20℃的水溶液中保持20 分钟。

e.用震荡器振荡5分钟，使酵母悬浮，静置10分钟，测定沉淀酵母的体积。一般沉淀酵母体积为1.0ml以上者为强凝聚性，0.5ml以下者为凝聚性弱的菌种。

2.2.2.2 发酵度的测定

发酵度是指在生产过程中麦芽浸出物中被啤酒酵母消耗掉的部分占浸出物总量的比例。本实验通过对啤酒生产过程中糖度的变化情况来判断啤酒酵母的发酵情况。酵母菌属兼性厌氧异养型微生物，在有氧的条件下，它可以将培养基中的糖类等有机物转化成二氧化碳和水。在无氧的条件下，它们可以将培养基中的糖类等有机物转变成酒精。因此，通过测定培养基中糖类的减少情况，可以从一个侧面来反映酵母菌的性能的好坏。啤酒的发酵度W可以用下面公式来计算[10]。

W=

P——表示发酵前培养基中的糖度；

M——表示经啤酒酵母发酵后培养基中的糖度，

0.819——为换算常数。

对培养基中的糖度的测定，本实验采用波美比重计来测定。即利用比重计来测定培养基的比重，通过换算，从而得到培养基中的糖的含量，这是一种粗略的测糖方法，但操作方法简便，对本实验所预期的实验效果不产生影响。  

酵母菌发酵度测定

将筛选出的10株酵母菌培养液，分别取适量接种于10个装有300ml的麦芽汁培养基的500ml的小三角瓶中，并做好标记。记下培养基最初的糖度P。接种后将三角瓶置于25℃的恒温箱中每天摇动三角瓶数次，3～4 天, 直至不再产生泡沫为止再过滤。用糖度计测出清液剩余浓度为M.最终发酵度W为。

2.2.2.3死灭温度的测定

微生物的死灭温度是指该微生物在某温度下10分钟被杀死的温度。任何一种微生物都有其最适合的环境生长温度，温度过低或过高均不利于其生长。啤酒酵母菌对高温的抵抗力不高,一般在液态加热至50～60℃数分钟就会失去活性。微生物的死亡温度越高,则其耐热能力越强，生命力也越强[11]。

酵母菌死灭温度测定

a.分别从上述10株培育菌种接入装有5ml麦汁的试管中，在25℃的恒温下培养24小时。

b.分别将其在50℃、52℃、54 ℃、56℃、58℃、60℃下保温10分钟，立即用冷水冷至室温，然后移至25℃恒温箱培养。

c.每天观察试管酵母的发酵情况，观察一周，如在对应某温度下该管中酵母菌不繁殖，则此温度即为死亡温度。

d.为了求得较精确的啤酒酵母菌的死亡温度范围，在上述实验测定的间隔范围内，再以间隔时间为1℃用同样的方法实验[12]。

2.2.2.4发酵速度的测定  

发酵速度的快慢往往影响了啤酒生产过程中双乙酰的还原程度，能够对啤酒的风味产生影响。在啤酒生产过程中，当糖度降到3.5Bx以下时，啤酒酵母基本都已经沉降到发酵罐底，继而被排出发酵罐，发酵进入到后发酵过程。此后对糖度的测量则没有意义。因此本实验通过比较酵母发酵过程中糖度降到3.5Bx时所用的时间判断该酵母发酵速度的快慢。本实验糖度的测量用波美糖度计来进行测量。其原理同[2.2.2.2]。

发酵速度测定

a.取上述10株菌液分别接入装有350ml麦汁500ml的小三角瓶中,在25℃恒温培养24小后，置于10℃生化培养箱中培养。

b.每隔12小时测定其外观糖度,当其外观糖度降至3.5Bx或以下时，记下发酵时间（h）,以发酵时间来判断其发酵速度的快慢。

2.2.2.5 双乙酰还原能力的测定

通过上述四项指标的分析，从而得到凝聚性、发酵度、死灭温度及发酵速度四项指标综合起来较理想的两株即5号和10号进行培养，对其双乙酰还原能力进行测定[13]。

本实验中对双乙酰还原能力强弱的测定是借助于分光光度计来完成的。在比色分析中，有色物质溶液颜色的深度决定于入射光的强度、有色物质溶液的浓度及液层的厚度。当一束单色光照射溶液时，入射光强度愈强，溶液浓度愈大，液层厚度愈厚，溶液对光的吸收愈多，它们之间的关系，符合物质对光吸收的定量定律，即Lambert-Bear 定律。这就是分光光度法用于物质定量分析的理论依据。本实验的测试波长为335nm[14].

双乙酰还原能力的测定

a.分别将10瓶经过酵母发酵后的发酵液稀释10倍，取未接种的对照麦芽汁培养基同样稀释10倍，以备用。

b.分光光度计测量各发酵液的OD值。

3.实验结果与讨论

3.1 菌株的凝聚性测定

在中国国内啤酒生产用的酵母均为下面发酵酵母，当酵母菌发酵完成后啤酒酵母即凝聚沉淀到发酵罐底部，啤酒发酵开始进入后酵阶段。酵母的凝聚性成为其重要的生理特征之一。每一酵母菌种均有一定的凝聚性，凝聚性不同，酵母在酒液中的沉降速度不一样，发酵程度也有差异。凝聚性过强的酵母，沉降早、快，酒液中酵母细胞数少，发酵缓慢，发酵度低；凝聚性差的酵母，沉降晚、慢，酒中酵母数多，发酵较快，发酵度高，但回收量低、滤酒困难，会给生产带来不便。酵母的凝聚性除受本身基因控制外，酵母生活的环境对其也有很大影响。本实验通过对10支菌株发酵液的离心处理，测得其凝聚系数绘制柱形图如下图3-1：

测定啤酒酵母的凝聚力时，凝聚力在1.0以上的为凝聚性强的酵母，凝聚力在0.5以下的为凝聚力弱的酵母。从上表可以看出,此原始酵母的凝聚力相对较好,分离出的10株菌的凝聚力均在0.7以上，没有凝聚力在0.5以下的菌株。其中2、3、4、5、7、10号6株菌凝聚性超过了1.0，为凝聚性强的菌株。

3.2 菌株发酵度的测定

发酵度是指在生产过程中麦芽浸出物中被啤酒酵母消耗掉的部分占浸出物总量的比例。酵母的发酵度高则酵母对麦芽浸出物中有机物的利用程度高，发酵完全，啤酒风味、口感好。酵母的发酵度低则酵母对麦芽浸出物中糖类等有机物的利用程度低，发酵不完全，双乙酰还原难以达到标准，啤酒容易出现口味粗涩、苦味不正、有氧化味、双乙酰味等现象，影响啤酒的风味。本实验通过对发酵液中糖度的测定来测定其发酵度，绘制柱形图如下图3-2：

从图3-2可以看出，测定的10支菌株的发酵度均在50%以上，其中4、5、10号菌株的发酵度较高，超过了70%，为发酵度较好的菌株。

3.3 菌株死灭温度的测定

任何一种微生物都有其最适合的环境生长温度，当环境温度超过了其最适生长温度或低于其最适生长温度时，都会在一定程度上对其正常的生长繁殖造成影响。酵母菌对高温的耐性不强，当环境温度升

高到一定程度是即可导致其个体死亡。此温度就称为该微生物的死灭温度。微生物的死灭温度越高,则其耐热能力越强，生命力也越强。更适合于大生产。本实验通过对微生物进行相对高温处理，测得其死灭温度。制作表格如下表3.1[15]。

表3.1  不同菌株死灭温度的测定结果

3.4 菌株发酵速度的测定  

本实验通过测定啤酒酵母发酵液糖度降到3.5Bx时所用时间的长短来比较各菌株发酵速度的快慢。实验结果绘制柱形图如下图3-3。从图中可以看出，2号和7号菌株发酵速度较慢，在生产过程中会导致发酵时间过长，增加了生产成本，不利于投入大规模生产。而4号菌株发酵速度较快，只用2.5天糖读就降到了3.5Bx,这样将不利于啤酒风味物质的形成，影响啤酒的口感。而剩余7支菌的发酵速度适中，在3天左右。

综合对此10株酵母菌凝聚力、发酵度、死灭温度以及发酵速度的测定结果的分析，可见5号、10号两株菌凝聚力高，稳定性好、发酵度高、死灭温度适中，发酵速度适中，因此筛选此两株菌进行双乙酰的测定。

3.5  酵母菌双乙酰还原能力的测定

通过对上述四个实验结果的研究，得出5号、10号菌株性能优于其它8支菌。本实验通过对发酵液OD值的测定来评价此两株酵母菌的双乙酰还原能力。从此曲线可以看出5号菌株相对于10号菌株双乙酰值平均要低,双乙酰还原程度要高,还原能力强.

3.6 总结

从上述实验可以看出，通过对酵母泥的活化，分离，并对其凝聚性、发酵度、死灭温度及发酵速度进行测定，从而筛选出菌落形态良好，凝聚性较好，发酵度高，死灭温度适中，发酵速度快的菌株，然后再进行液体斜面储存，以作为生产用菌。本实验的实验结果表明，5号菌株是较为理想的啤酒酵母菌种。在工厂生产中，当生产用菌种生产性能退化时，即可采用本实验的方法对生产用菌进行分离纯化，并进行性能测定，从中筛选出少数仍保留有原优良性能的菌株，进行扩大化培养，以投入生产。在条件允许的情况下，对分离出的菌住进行小型发酵罐发酵，从而可以对其风味等因素进行测定，那么筛选出的菌株性状会更好。

参考文献:

[1]张纪忠主编.微生物分类学[M].上海:复旦大学出版社,1990. 384-39

[2]巴尼特A,佩恩RW，亚罗D,著.酵母菌的特征与鉴定手册[M].胡瑞卿译.青岛:青岛海洋出版社,1991.100～175 

[3]管敦仪.啤酒工业手册[M].北京:轻工业出版社,1982.55.

[4]周德庆.微生物学教程(第二版)[M].北京.高等教育出版社.2002.47-52 

[5]蔡定域.酿酒工业分析手册〔M].北京:轻工业出版社，1988.24-36

[6]Meaden P.G.et al.J.Inst.Brew. 1991，97(5):353一357

[7]肖亚新.啤酒厂酵母菌株筛选技术[J].中国酿造.1999年第4期.1994-2007

[8]熊宗贵主编.发酵工艺原理[M].北京.中国医药科技出版社.1995.-73

[9]谢建中.啤酒酵母分离纯化选育[J].中国酿造.2000年第二期.No.2 2000

[10]Laneashire W E,Carter AT Howard J Jet,Superattenuating Brewing

Yeast,Proe.21“EBCCongress,19:491-498.

[11]KIM K，LEE S Y，Appl Bioehem Bioteeh.1994,44:161-185.

[12]姚娟. 啤酒活性干酵母的制与应用[D].天津.天津工业大学.2004

[13]Tezuka H.et al.J.Am.Soe.Chem.，1992，50:130一133

[14]Moura F.et al.J.An.Soe.Chem.，1995，53:58一62

[15]杜连祥等.工业微生物学实验技术[M].上海.天津科学技术出版社，1992.32-48

致    谢

在实验和完成论文期间，真诚感谢本文的指导老师陈宇老师的悉心指导，同时，也十分感激微生物实验室莫湘涛等老师的耐心指导和热情帮助，再次由衷的感谢微生物实验室的全体成员。谢谢你们!