种子检验实验指导

种子检验实验指导

（种科、农学专业适用）

种子科学与工程教研室

2015.4

实验一 种子净度分析

一、实验目的与要求

学习净种子、其他植物种子和杂质的划分标准，掌握种子净度检验程序与方法。

二、实验材料与用品

1．实验材料 水稻、玉米、小麦、蔬菜、牧草或其他当地常见作物种子。

2．实验用品 净度分析台、风选净度仪、分样器、不同孔径的套筛、电动筛选器、吹风机、双目显微镜、手持(台式)放大镜、瓷盘、感量为1.0，0.1，0.01，0.001g和0.0001g的不同天平、直尺、镊子、标签、称量纸、记载本、铅笔等。

三、实验的方法步骤

1．送验样品的称重和重型混杂物的检查

⑴将送验样品倒在天平上称重，得出送验样品重量M。

⑵重型混杂物是指在大小或重量方面明显大于被检作物种子的混杂物。如果送验样品中有重型混杂物，应先挑出来并称重，再分为其他植物种子和杂质。做法是将送验样品倒在光滑的瓷盘中，挑出重型混杂物，在天平上称重，得到重型混杂物的重量m，再将重型混杂物分成其他植物种子和杂质分别称重，得到m1和m2。

2．试验样品的分取

(l)将除去重型混杂物的送验样品混匀，从中分取试验样品l份，或半试样2份，试样或半试样的重量参见表3-1。如水稻种子1份全试样是40g，两份半试样分别为20g。分样可使用分样器或采用四分法。

⑵用天平称出试样或半试样的重量，按规定留取小数位数[参见表3-1]。

3．试样的分析与分离 将(半)试样倒在净度分析台或平整光滑的实验台桌面上，根据标准将(半)试样分离成净种子、其他植物种子和杂质三部分。试样的分离也可借助放大镜、不同孔径的套筛、吹风机等器具，在不损伤发芽率的基础上进行。借助不同孔径的套筛的分离方法为：选用筛孔适当的两层套筛，要求小孔筛的孔径小于所分析的种子，而大孔筛的孔径大于所分析的种子。使用时将小孔筛套在大孔筛的下面，再把筛底盒套在小孔筛的下面，倒入(半)试样，加盖，置于电动筛选机上或手工筛动2min。筛理后将各层筛及底盒中的分离物分别倒在净度分析台上进行分析鉴定，区分出净种子、其他植物种子、杂质，并分别放入小碟内。

4．各分拣成分的称重 将每份(半)试样的净种子、其他植物种子、杂质分别称重，称量的精确度与试样称重要求相同。其中，其他植物种子还应分种类计数。

5．结果计算

(l)检查分析过程中重量增失  不管是1份试样还是2份半试样，应将分析后的各种成分重量之和与(半)试样原始重量比较，核对分析期间物质的增失是否符合要求。若增失量超过原始重量的5%，则必须重新进行分析，填报重做的结果。

⑵以三种成分的重量之和为基数计算试样(半试样)中净种子、其他植物种子及杂质的百分率。

若为全试样，各种组分的百分率应计算到1位小数，若为半试样，则各种组分的百分率计算到2位小数。

⑶求出2份(半)试样间三种成分的各平均百分率及重复间相应百分率差值，并核对容许差距(表3-2)，若样间三种成分的重量百分率都在容许范围之内，则它们的平均数分别为P1、OS1和I1。

⑷含重型混杂物的结果计算

净种子： 

其它植物种子： 

杂质： 

上式中：M—送验样品的重量，g；

m—重型混杂物的重量，g；

m1—重型混杂物中的其它植物种子重量，g；

m2—重型混杂物中杂质的重量，g；

P1—除去重型混杂物后的净种子重量百分率，%；

OS1—除去重型混杂物后的其它植物种子重量百分率，%；

I1—除去重型混杂物后的杂质重量百分率，%。

⑸ 百分率的修约 若得到的百分率取两位小数，则应按“四舍六入五留双”的规则保留1位。各成分的百分率相加应为100.0%，如为99.9%或100.1%，则在最大的百分率上加上或减去不足或超过之数。如果此修约值大于0.1%，则应该检查计算上有无差错。

6．其他植物种子数目的测定

(l)将取出(半)试样后剩余的送验样品按要求取出相应的数量或全部倒在净度分析台或平整光滑的实验台桌上或样品盘内，逐粒进行观察，找出所有的其他植物种子或指定种的种子并计数出每个种的种子数，再加上(半)试样中相应的种子数。

⑵结果计算。可直接用检出的种子粒数来表示，也可折算为每单位试样重量(通常用每千克)内所含种子数来表示。

7．填写净度分析的结果报告单

净度分析的最后结果精确到1位小数，如果某种成分的百分率低于0.05%，则填为微量，如果某种成分结果为零，则须填报“—0.0—”。

最后应注意完成种子净度分析后，应将净种子留下供其他项目检验利用。

四、作业

1．每2人1组，按种子净度分析程序与方法进行一份供验种子样品的净度分析，并将本组净度分析结果与邻组同学进行容许差距分析，如果容许误差大于国家标准，则应分析其原因，重新核算或重新进行分析。

2．将供验样品净度的检验结果，填入种子净度分析记载表(表附-1)。

表附-1种子净度分析记载表

样品编号

作物名称

品种(组合)名称

送  验 样品重 (g)

重型混杂物重 (g)

重型混杂物中 其他植物种子重(g)

重型混杂物中杂质重(g)

类别

重复

试样重(g)

净种子

其他植物种子

杂质

各成分 重量之和

重量 (g)

百分数 (%)

重量 (g)

百分数 (%)

重量 (g)

百分数 (%)

全试样

半试样

1

2

平均

实际差 (%)

容许误差 (%)

其他植物种子名称及个数

杂质种类

净度分析结    果

净种子 (%)

其他植物种子 (%)

杂质 (%)

检测依据

说明：全试样或半试样只需选择其中一种方法进行检测。

实验二 种子发芽试验

一、实验目的与要求

通过本实验掌握水稻、小麦、玉米、油菜、大豆等种子的发芽条件，学习标准发芽试验和快速发芽试验的方法。

二、实验材料与用具

1．材料 水稻、小麦、大麦、玉米、油菜、大豆等作物种子。

2．用具 发芽箱、出糙机、透明塑料发芽盒、玻璃培养皿、发芽纸或滤纸、砂、镊子、标签、数种仪(板)等。

三、实验的方法步骤

(一)标准发芽试验

1．发芽床的选用 一般大粒种子(玉米、大豆等)用砂床(0.05～0.8mm的细砂)，中粒种子(水稻、小麦、大麦等)用砂床或纸床，小粒种子(油菜、芝麻等)用纸床。

2．发芽床的准备 取塑料发芽盒或发芽皿4套。将砂(石英砂或河砂)用0.8mm筛孔的钢丝网筛进行筛理，经洗涤后与玻璃培养皿等一起进行高温消毒(160℃，2h或120℃，4h)。然后在发芽皿中放入4层发芽纸(或滤纸)并加水湿透，或放入消毒砂(每100 g加水约20 ml)。

3．试样的数取 取经净度检验的净种子400粒(水稻种子需要预先在30℃温水中浸种24h)，每重复100粒，播于纸床或砂床中。播种时种子分布要均匀，彼此之间保留一定距离，用砂床时应将种子轻轻压入砂中，种子与砂相平，然后加盖。

4．贴标签 将发芽盒或发芽皿贴上标签，注明品种名称、重复号、处理温度、置床日期、测定人姓名等，并登记在发芽试验记载表上。

5．培养 将发芽盒或发芽皿放入规定温度和光照条件的发芽箱内发芽。可根据农作物种子的发芽技术规定选择恒温或变温处理，以后每日检查温度和水分。水分不足时要及时补充，并保持发芽箱内温度和水分与要求一致。

6．管理 发芽床上如有种子表面生霉，可取出用清水洗涤后再放回发芽床上；如已经霉烂，则应从发芽床上取出并登记。如霉烂种子达5%以上，应更换发芽床或进行种子消毒后重新试验。

7．幼苗鉴定 每株幼苗都必须按标准进行鉴定，鉴定要在幼苗主要构造发育到一定时期进行。每个种的试验持续时间详见表4-1。到达初次计数天数时，计数正常幼苗，并将发育良好的正常幼苗从发芽床中拣出；对可疑的或损伤、畸形或不均衡的幼苗，通常到末次计数。严重腐烂的幼苗应从发芽床中除去，并随时增加计数。末次计数时，按正常幼苗、不正常幼苗、新鲜不发芽种子或硬实和死种子分别计数和记载。

如果样品在规定时间内只有几粒种子开始发芽，则试验时间可延长7d，或延长规定时间的一半。根据试验情况，可增加计数的次数。反之，如果在规定时间结束前，样品已达最高发芽率，则该试验可提前结束。

8．结果计算 根据试验记录分别计算正常幼苗、不正常幼苗、新鲜不发芽种子或硬实、死种子百分率。如果一个试验的四次重复正常幼苗百分率在最大容许差距范围内，则其平均值表示试验样品的发芽率。其余成分的百分率按四次重复平均数计算。

种子发芽试验记载表见表附-2.

表附-2 种子发芽试验记载表

样品登记号

作物名称

品种(组合)名称

检测依据

重复 日期

Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

Ⅳ

结果 ％

发芽床           温度           ℃ 置床日期               实验持续时间 天 发芽前处理方法                        容许误差               实际误差               不正常幼苗种类

正

不

死

正

不

死

正

不

死

正

不

死

正常幼苗（正）

新鲜不发芽种子

硬实

不正常幼苗（不）

死种子（死）

检验员：     日期：        校核人：      日期：        审核人：         日期：

四、作业

四人一组，选择一种作物种子进行标准发芽试验和快速发芽试验，并比较两种方法测定的结果。

实验六 种子生活力的四唑染色测定

一、实验目的与要求

1．了解四唑染色快速测定种子生活力的原理。

2．掌握四唑染色快速测定主要作物种子生活力的方法和种子生活力有无的鉴定标准。

二、实验材料与用具

1．材料　小麦、玉米、水稻、大豆、棉花、蔬菜等作物种子。

2．器材　培养箱、镊子、解剖针、刀片、吸水纸等。

3．试剂　红四氮唑、磷酸缓冲液、乳酸苯酚透明液、过氧化氢等。

三、实验的方法步骤

1．小麦、玉米种子四唑染色测定 随机数取净种子100粒，2次重复，放在30℃水中3～4h或湿润的纸间12h，沿种胚纵切，各取半粒放入小培养皿或小烧杯中，倒入0.1%四唑盐溶液淹没种子，35℃染色0.5～1h，计算生活力。

2．水稻种子四唑染色测定 随机数取净种子100粒，2 次重复，去壳，放在30℃水中或湿润的纸间12h，沿种胚纵切，各取半粒放入小培养皿或小烧杯中，倒入0.1%四唑溶液淹没种子，35℃染色1～2h，计算生活力。

3．大豆种子四唑染色测定 机数取净种子100粒，2次重复，放在湿毛巾间12h，剥去种皮，放入小培养皿或小烧杯中，倒入1%四唑液淹没种子，35℃染色2～3h，计算生活力。

4．棉花种子四唑染色测定 随机数取净种子100粒，2次重复，放在湿润的纸间预湿，30℃12h，纵切一半种子，或剥去种皮，放入小培养皿或小烧杯中，倒入0.5%四唑液淹没种子，35℃染色2～3h，计算生活力。

5．高粱种子四唑染色测定 随机数取净种子100粒，2次重复，放在30℃水中3～4h或湿润的纸间12h，纵切种胚，放入小培养皿或小烧杯中，倒入0.1%四唑液淹没种子，35℃染色0.5～1h，计算生活力。

6．辣椒、茄子和番茄种子四唑染色测定 随机数取净种子100粒，2次重复，放在20℃-30℃水中3～4h或湿润的纸间12h，在种子中心刺破种皮和胚乳或纵切种子使胚露出或撕开胚乳使胚露出，倒入0.2%四唑液淹没种子，35℃染色0.5～1.5h，计算生活力。

7．黄瓜、西瓜和南瓜种子四唑染色测定 随机数取净种子100粒，2次重复，放在20℃-30℃水中6～8h或湿润的纸间24h，纵切种子、剥去种皮和内膜，倒入1%四唑溶液淹没种子，35℃染色1～2h，计算生活力。

四、作业

1．分析无生活力种子种胚不染色的可能原因。

实验四  蛋白质电泳鉴定玉米种子纯度

1、实验的目的与要求

    学习、掌握蛋白质电泳法鉴定玉米品种纯度的基本原理、操作步骤和电泳谱带鉴定标准。

二、实验的材料与用具

1．材料 玉米干种子

2．仪器设备 电泳仪、电泳槽、离心机、离心管、感量0.001g的电子天平或分析天平、样品钳或单粒种子粉碎器、存放试剂的广口瓶、移液管及移液管架瓶、吸耳球、滴瓶、微量进样器、注射器、研钵等。

3．试剂 试剂 :丙烯酰胺(Acr)，甲叉双丙烯酰胺(Bis),KOH，过硫酸胺(AP),冰乙酸，四甲基乙二胺(TEMED) ,甘氨酸，三氯乙酸，考马斯亮兰R250,无水乙醇，甲基绿。所有试剂为分析纯级。

三、溶液的配制

1号：90g丙烯酰胺(Acr)+3g甲叉双丙烯酰胺(Bis)加水溶解并定容至500ml

2号：60g脲加水溶解并定容至200ml

3号：48ml1mol/L的KOH+17.2ml乙酸加水定容至100ml 

4号：48 ml1mol/L的KOH+2.9ml乙酸加水定容至100ml

5号：四甲基乙二胺(TEMED)原液

6号：10%过硫酸胺

电极液：甘氨酸0.44g加水溶解+4.5ml乙酸再加水定容至1100ml

指示剂：0.1%甲基绿水溶液

染色剂：10%三氯乙酸200ml+1%考马斯亮兰乙醇溶液10ml

提取液：80g脲+80ml乙酸+加水定容至500ml

四、操作步骤

蛋白质提取:将每粒种子样品用单粒粉碎器磨碎后倒入1.5ml离心管中，加入适量提取液，静置0.5小时以上或5000rpm离心15分钟，上清液即可点样。

凝胶室的制作:将预先洗净晾干的玻璃板装入胶条中，配浓缩胶溶液封好底缝，并把胶条固定在电泳槽中，保持水平，拧紧螺栓。

灌分离胶:依次取1号22.5ml、2号5ml、3号3.75ml、6号1.6ml、5号0.2ml混合后倒入制好的胶室至距顶端2cm左右为止，约20-30分钟胶可聚合，吸去析出水分。

灌浓缩胶:依次取1号3ml、2号2ml、4号5ml、6号0.3ml、5号0.04ml混合后倒在分离胶上，并插入梳子，约10-20分钟，待浓缩胶聚合后轻轻拔出梳子，准备点样。

点样: 用微量进样器取每粒种子样品的上清液15-20μl注入浓缩胶上的凹穴内，每点完一粒样后要清洗进样器。

电泳:加样完毕后，小心倒入电极液，并在上槽加入3-4滴甲基绿指示剂，接通电源，稳压180V，约需2-2.5小时。

染色:将电泳后的凝胶放入染色液中，在30℃恒温条件下染色约需2-3小时。

五、观察鉴定

在白瓷盘上对比鉴定的种子和已知真实种子或父母本的蛋白谱带来鉴定品种，根据杂交种的数量计算出纯度，同时也可将异交种和自交粒数统计出来。

六、结果保存

结果保存的方式有多种，最简便的方式为湿法保存胶板和照相。

1．湿法保存 用7％乙酸溶液浸泡胶板，然后将胶板放人塑料袋中，用家用保鲜热合机密封，该保存条件在室温下可保存半年以上，缺点是不小心易碰破胶板。

在保存过程中如出现谱带变浅可将胶板取出重新放人染色液染色。

2．照相 凝胶板拍照，难度较大，要想得到较好效果的照片，必须采用大型翻拍机。

实验五  玉米品种鉴定 SSR标记法

一、实验目的与要求

    通过本实验，了解SSR标记法鉴定玉米的基本原理，掌握SSR标记法鉴定玉米品种的操作方法和鉴定标准。

二、实验材料与用具

    1.材料 玉米种子、幼苗、叶片、苞叶、果穗等组织或器官。

    2.仪器设备 PCR扩增仪、高压电泳仪（规格为3000V、400mA、400W，具有恒电压、恒电流和恒功率功能）、垂直电泳槽及配套的制胶附件、普通电泳仪、水平电泳槽及配套的制胶附件、高速冷冻离心机（最大离心力不小于15,000 rpm）、水平摇床、胶片观察灯、电子天平（感应为0.01 g、0.001 g)、微量移液器（规格分别为10 L、20 L、100 L、200 L、1000 L，连续可调）、磁力搅拌器、紫外分光光度计（波长260 nm 及280 nm）、微波炉、高压灭菌锅、酸度计、水浴锅或金属浴（控温精度±1℃）、冰箱（最低温度-20℃）、机、凝胶成像系统或紫外透射仪、DNA分析仪、基于毛细管电泳，有片段分析功能和数据分析软件，能够分辨1个核苷酸大小的差异。

    3.试剂 十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）、三氯甲烷、异丙醇、异戊醇、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2•2H2O）、三羟甲基氨基甲烷（Tris-base）、盐酸（37%）、氢氧化钠（NaOH）、氯化钠、10×Buffer缓冲液（含Mg2+ 25 mmol/L）四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP，每种10mmol/L）、Taq DNA聚合酶、矿物油、琼脂糖、DNA分子量标准、核酸染色剂、去离子甲酰胺（Formamide）、溴酚蓝（Brph Blue）、二甲苯青FF、甲叉双丙烯酰胺（bisacrylamide）、丙烯酰胺（acrylamide）、硼酸（Boric Acid）、尿素、亲和硅烷（Binding Silane）、剥离硅烷（Repel Silane）、无水乙醇、四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵（APS）、冰醋酸、乙酸铵、银、甲醛、DNA分析仪专用丙烯酰胺胶液、DNA分析仪专用分子量内标Liz标记、DNA分析仪专用电泳缓冲液。

三、溶液配制

    (一）DNA提取溶液的配制

    1.0.5mol/LEDTA溶液 186.1gNa2EDTA.2H2O溶于800mL水中，用固体NaOH调pH值至8.0，定容至1000 mL，高压灭菌。

    2.1mol/LTris-HCl溶液60.55gTris碱溶于适量水中，加HCl调pH至8.0，定容至500mL，高压灭菌。

    3.0.5mol/L HCl溶液 25mL浓盐酸(36-38%)，加水定容至500mL。

    4.CTAB提取液 81.7g氯化钠和20gCTAB溶于适量水中，然后加入1mol/LTris-HCl100mL，0.5mol/L EDTA 40mL，定容至1000mL，4℃贮存。

    5.SDS提取液 1mol/L Tris-HCl50mL，0.5mol/L EDTA50mL，5mol/LNaCl50mL，SDS7.5g，定容至500mL。

    6.TE缓冲液 1mol/L Tris-HCl 5mL，0.5mol/L EDTA1mL，加HCl调pH至8.0，定容至500mL。

    7.5mol/L NaCl溶液 146g固体NaCl溶于水中，加水定容至500mL。

（二）PCR扩增溶液的配制

    1.dNTP  用超纯水分别配制A、G、C、T终浓度100 mmol/L的储存液。各取20μL混合，用超纯水720μL定容至每种终浓度2.5mmol/L的工作液。

    2.SSR引物 用超纯水分别配制前引物和后引物终浓度均40μmol/L的储存液，等体积混合成20μmol/L的工作液。

注：干粉配制前应首先快速离心。

    3.6×加样缓冲液 去离子甲酰胺49mL，0.5mol/L的EDTA溶液（pH8.0）1mL，溴酚兰0.125g，二甲苯青0.125g。

（三）变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制

    1.40％PAGE胶 丙烯酰胺190g和甲叉双丙烯酰胺10g，定容至500mL。

    2.4.5% PAGE胶 尿素450g，10×TBE缓冲液100mL，40%PAGE胶112.5mL，定容至1000mL。

    3.Bind缓冲液 49.75mL无水乙醇和250μL冰醋酸，加水定容至50mL。

    4.亲和硅烷工作液 在1mLBind缓冲液中加入5μL Bind原液，混匀。

    5.剥离硅烷工作液 2％二甲基二氯硅烷。

    6.25%过硫酸铵溶液 0.25g过硫酸铵溶于1mL超纯水中。

    7.10×TBE缓冲液 Tris碱108g，硼酸55g，0.5mol/L EDTA溶液37mL，定容至1000mL。

    8.1×TBE缓冲液 10×TBE缓冲液500mL，加水定容至5000mL。

（四）银染溶液的配制

    1.固定液 100mL冰醋酸，加水定容至1000mL。

    2.染色液 2g银，加水定容至1000mL。

    3.显影液 1000mL蒸馏水中加入30g氢氧化钠和5mL甲醛。

注：除银染溶液的配制可使用符合GB/T6682规定的三级水外，试验中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T 6682规定的一级水。

四、操作程序

    (一）样品制备

送验样品可为种子、幼苗、叶片、苞叶、果穗等组织或器官。对玉米自交系和单交种，随机数取至少20个个体组成的混合样品进行分析，或直接对至少5个个体单独进行分析；对于其它杂交种类型，随机数取至少20个个体单独进行分析。

    （二）DNA提取

    1.CTAB提取法：幼苗或叶片约200-300mg，置于2.0mL离心管，加液氮充分研磨，或取种子充分磨碎，移入2.0mL离心管；每管加入700µL 65℃预热的CTAB提取液后，充分混合，65℃保温60 min，期间多次颠倒混匀；每管加入等体积的三氯甲烷/异戊醇混合液，充分混合后，静置10min；12,000rpm离心15min后，吸取上清液至一新离心管，再加入等体积预冷的异丙醇，颠倒离心管数次，在-20℃放置30min；4℃，12,000rpm离心10min，弃上清液；加入70%乙醇，旋转离心管数次，弃去乙醇；将离心管倒立于垫有滤纸的实验台上，室温干燥沉淀6h以上；加入100 µL超纯水或TE缓冲液，充分溶解后备用。

2.SDS提取法：剥取干种子的胚，放入1.5mL离心管中，加入100µl氯仿后研磨，加入300µlSDA提取液，混匀后于10,000rpm离心2min，吸上清液加入预先装有300µl异丙醇和300 µl NaCl溶液的1.5mL离心管中，待DNA成团后挑出，经70%乙醇洗涤后加入200µlTE缓冲液，待充分溶解后备用。

试剂盒提取法：使用经验证适合SSR指纹技术的商业试剂盒，按照试剂盒的使用说明操作。

注：以上为推荐的DNA提取方法，其它达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法均适用。

    （三）PCR扩增

    1.引物选择 首先选择表附-4中前20对引物进行检测，当样品间检测出的差异位点数小于2时，再选用表附-4中后20对引物进行检测；必要时，进一步选择特定标记进行检测。

    2.反应体系 各组分的终浓度如下：每种dNTP0.10mmol/L，正向、反向引物各0.24mol/L，Taq DNA聚合酶0.04U/l，1×PCR缓冲液（含Mg2+ 2.5mmol/L），DNA溶液2.5ng/l，其余以超纯水补足至所需体积。如果PCR过程中不采用热盖程序，则反应液上加盖15μL矿物油，以防止反应过程中水分蒸发。

    3.反应程序 94℃预变性5min，1个循环；94℃变性40s，60℃退火35s，72℃延伸45 s，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

    （四）PCR产物检测

    1.普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)

    （1）清洗玻璃板 用清水沾洗涤灵将玻璃板反复擦洗干净，双蒸水擦洗两遍，95%乙醇擦洗两遍，干燥。在长板上涂上0.5mL亲和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5mL剥离硅烷工作液。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。

    （2）组装电泳版 待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，并用水平仪调平。

    （3）灌胶 在100mL4.5%PAGE胶中加入TEMED和25%过硫酸铵各100l，迅速混匀后灌胶。待胶流动到下部，在上部轻轻的插入梳子，使其聚合至少1h以上。灌胶时应匀速以防止出现气泡。

    （4）预电泳 在正极槽（下槽）中加入1×TBE缓冲液600 mL，在负极槽（上槽）加入预热至65℃的1×TBE缓冲液600mL，拔出梳子。90W恒功率预电泳10-20min。

    （5）变性 在20lPCR产物中加入4l6×加样缓冲液,混匀后，在PCR仪上运行变性程序：95℃变性5min，4℃冷却10min以上。

    （6）电泳 用移液器吹吸加样槽，清除气泡和杂质，插入样品梳子。每一个加样孔点入5 l样品。80W恒功率电泳至上部的指示带（二甲苯青）到达胶板的中部。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，凝胶会紧贴在长板上。

注：预期扩增产物片段大小在150bp以下时电泳时间应适当缩短，扩增产物片段大小在300bp以上时电泳时间应适当延长。

    （7）银染

    ①固定：固定液中轻轻晃动3min；

    ②漂洗：双蒸水快速漂洗1次，不超过10s；

    ③染色：染色液中染色5min；

    ④漂洗：双蒸水快速漂洗，时间不超过10s；

    ⑤显影：显影液中轻轻晃动至带纹出现；

    ⑥定影：固定液中定影5min；

    ⑦漂洗：双蒸水漂洗1min。

    2.荧光标记毛细管电泳

    （1）样品制备 等体积混合不同荧光标记扩增产物，混匀后从混合液中吸取1L加入到DNA分析仪专用96孔板孔中。板中各孔分别加入0.1L分子量内标和8.9L去离子甲酰胺。将样品在PCR仪上95℃变性5min，取出，立即置于碎冰上，冷却10min以上。离心10s后置放到DNA分析仪上。

    （2）电泳检测 按照仪器操作手册，编辑样品表，执行运行程，保存数据。

    （五）数据记录与统计

    1.数据记录 对普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将每个扩增位点的等位变异与参照品种的等位变异片段大小进行比较，确定样品在该位点的等位变异；对荧光标记毛细管电泳，通过参照品种消除同型号不同批次间或不同型号DNA分析仪间可能存在的系统误差，使用片段分析软件读取样品在该位点的等位变异。

纯合位点的基因型数据记录为X/X，杂合位点的基因型数据记录为X/Y，其中X、Y分别为该位点上两个等位变异，小片段数据在前，大片段数据在后；缺失位点基因型数据记录为0/0。

示例1：样品在某个位点上仅出现一个等位变异，为150，在该位点的基因型记录为150/150；

示例2：样品在某个位点上有两个等位变异，分别为150、160，在该位点的基因型记录为150/160。

2.数据统计 当对送验样品混合DNA进行分析时，可直接进行品种间成对比较，如果样品某个引物位点出现可见的异质性且影响到差异位点判定时，可重新提取至少20个个体的DNA，并用该引物重新扩增，统计在该引物位点上不同个体的基因型（或等位变异）及所占比例。当对送检样品多个个体DNA进行分析时，应统计其在各引物位点的各种基因型（或等位变异）及所占比例。对单交种，应比较两个样品在各引物位点的基因型；对自交系，应比较两个样品在各引物位点的等位变异。

成对比较的数据统计记录表见表附-3。

    （六）判定规则

    1.结果判定 当样品间差异位点数≥2，判定为“不同”；当样品间差异位点数＝1，判定为“近似”；当样品间差异位点数＝0，判定为“极近似或相同”。

对利用附录C中40对引物仍未检测到≥2个差异位点数的样品，如果相关品种存在特定标记，必要时增加其特定标记进行检测。

    2.结果表述 比较位点数：      ，比较位点为：        ；差异位点数：       ，差异位点为：      ；判定为：         。

表附-3 数据统计记录表

样品1编号、名称及来源：

样品2编号、名称及来源：
编号	引物名称	指纹数据		是否存在差异	备注
		样品1	样品2
P01	bnlg439w1
P02	umc1335y5
P03	umc2007y4
P04	bnlg1940k7
P05	umc2105k3
P06	phi053k2
P07	phi072k4
P08	bnlg2291k4
P09	umc1705w1
P10	bnlg2305k4
P11	bnlg161k8
P12	bnlg1702k1
P13	umc1545y2
P14	umc1125y3
P15	bnlg240k1
P16	phi080k15
P17	phi065k9
P18	umc1492y13
P19	umc1432y6

表附-3（续）

编号	引物名称	指纹数据		是否存在差异	备注
		样品1	样品2
P20	umc1506k12
P21	umc1147y4
P22	bnlg1671y17
P23	phi96100y1
P24	umc1536k9
P25	bnlg1520K1
P26	umc14y3
P27	bnlg490y4
P28	umc1999y3
P29	umc2115k3
P30	umc1429y7
P31	bnlg249k2
P32	phi299852y2
P33	umc2160k3
P34	umc1936k4
P35	bnlg2235y5
P36	phi233376y1
P37	umc2084w2
P38	umc1231k4
P39	phi041y6
P40	umc2163w3
比较位点数：     ，差异位点数：      。

注1：是否存在差异栏可填写是、否、无法判定、缺失。当样品在某个引物位点出现可见的异质性且影响到差异位点判定时，可填写无法判定，或重新提取至少20个个体的DNA，并用该引物重新扩增，统计在该引物位点上不同个体的基因型（或等位变异）及所占比例后予以判定。

注2：如果采用了备案的其它特征标记进行鉴定，可在记录表中依次添加。

注3：当以两个自交系样品的组合作为待测样品时，指纹数据栏应填写两个自交系的指纹组合作为待测样品指纹。

表附-4 40对核心引物名单及序列

编号	引物名称	染色体位置	引物序列
P01	bnlg439w1	1.03	上游：AGTTGACATCGCCATCTTGGTGAC 下游：GAACAAGCCCTTAGCGGGTTGTC
P02	umc1335y5	1.06	上游：CCTCGTTACGGTTACGCTGCTG 下游：GATGACCCCGCTTACTTCGTTTATG
P03	umc2007y4	2.04	上游：TTACACAACGCAACACGAGGC 下游：GCTATAGGCCGTAGCTTGGTAGACAC
P04	bnlg1940k7	2.08	上游：CGTTTAAGAACGGTTGATTGCATTCC 下游：GCCTTTATTTCTCCCTTGCTTGCC
P05	umc2105k3	3.00	上游：GAAGGGCAATGAATAGAGCCATGAG 下游：ATGGACTCTGTGCGACTTGTACCG
P06	phi053k2	3.05	上游：CCCTGCCTCTCAGATTCAGAGATTG 下游：TAGGCTGGCTGGAAGTTTGTTGC
P07	phi072k4	4.01	上游：GCTCGTCTCCTCCAGGTCAGG  下游：CGTTGCCCATACATCATGCCTC
P08	bnlg2291k4	4.06	上游：GCACACCCGTAGTAGCTGAGACTTG 下游：CATAACCTTGCCTCCCAAACCC
P09	umc1705w1	5.03	上游：GGAGGTCGTCAGATGGAGTTCG 下游：CACGTACGGCAATGCAGACAAG
P10	bnlg2305k4	5.07	上游：CCCCTCTTCCTCAGCACCTTG 下游：CGTCTTGTCTCCGTCCGTGTG
P11	bnlg161k8	6.00	上游：TCTCAGCTCCTGCTTATTGCTTTCG 下游：GATGGATGGAGCATGAGCTTGC
P12	bnlg1702k1	6.05	上游：GATCCGCATTGTCAAATGACCAC 下游：AGGACACGCCATCGTCATCA
P13	umc1545y2	7.00	上游：AATGCCGTTATCATGCGATGC 下游：GCTTGCTGCTTCTTGAATTGCGT
P14	umc1125y3	7.04	上游：GGATGATGGCGAGGATGATGTC 下游：CCACCAACCCATACCCATACCAG
P15	bnlg240k1	8.06	上游：GCAGGTGTCGGGGATTTTCTC 下游：GGAACTGAAGAACAGAAGGCATTGATAC
P16	phi080k15	8.08	上游：TGAACCACCCGATGCAACTTG 下游：TTGATGGGCACGATCTCGTAGTC
P17	phi065k9	9.03	上游：CGCCTTCAAGAATATCCTTGTGCC 下游：GGACCCAGACCAGGTTCCACC
P18	umc1492y13	9.04	上游：GCGGAAGAGTAGTCGTAGGGCTAGTGTAG 下游：AACCAAGTTCTTCAGACGCTTCAGG
P19	umc1432y6	10.02	上游：GAGAAATCAAGAGGTGCGAGCATC 下游：GGCCATGATACAGCAAGAAATGATAAGC
P20	umc1506k12	10.05	上游：GAGGAATGATGTCCGCGAAGAAG 下游：TTCAGTCGAGCGCCCAACAC

表附-4（续）

编号	引物名称	染色体位置	引物序列
P21	umc1147y4	1.07	上游：AAGAACAGGACTACATGAGGTGCGATAC 下游：GTTTCCTATGGTACAGTTCTCCCTCGC
P22	bnlg1671y17	1.10	上游：CCCGACACCTGAGTTGACCTG 下游：CTGGAGGGTGAAACAAGAGCAATG
P23	phi96100y1	2.00	上游：TTTTGCACGAGCCATCGTATAACG 下游：CCATCTGCTGATCCGAATACCC
P24	umc1536k9	2.07	上游：TGATAGGTAGTTAGCATATCCCTGGTATCG 下游：GAGCATAGAAAAAGTTGAGGTTAATATGGAGC
P25	bnlg1520K1	2.09	上游：CACTCTCCCTCTAAAATATCAGACAACACC 下游：GCTTCTGCTGCTGTTTTGTTCTTG
P26	umc14y3	3.07	上游：GCTACCCGCAACCAAGAACTCTTC 下游：GCCTACTCTTGCCGTTTTACTCCTGT
P27	bnlg490y4	4.04	上游：GGTGTTGGAGTCGCTGGGAAAG 下游：TTCTCAGCCAGTGCCAGCTCTTATTA
P28	umc1999y3	4.09	上游：GGCCACGTTATTGCTCATTTGC 下游：GCAACAACAAATGGGATCTCCG
P29	umc2115k3	5.02	上游：GCACTGGCAACTGTACCCATCG 下游：GGGTTTCACCAACGGGGATAGG
P30	umc1429y7	5.03	上游：CTTCTCCTCGGCATCATCCAAAC 下游：GGTGGCCCTGTTAATCCTCATCTG
P31	bnlg249k2	6.01	上游：GGCAACGGCAATAATCCACAAG 下游：CATCGGCGTTGATTTCGTCAG
P32	phi299852y2	6.07	上游：AGCAAGCAGTAGGTGGAGGAAGG 下游：AGCTGTTGTGGCTCTTTGCCTGT
P33	umc2160k3	7.01	上游：TCATTCCCAGAGTGCCTTAACACTG 下游：CTGTGCTCGTGCTTCTCTCTGAGTATT
P34	umc1936k4	7.03	上游：GCTTGAGGCGGTTGAGGTATGAG 下游：TGCACAGAATAAACATAGGTAGGTCAGGTC
P35	bnlg2235y5	8.02	上游：CGCACGGCACGATAGAGGTG 下游：AACTGCTTGCCACTGGTACGGTCT
P36	phi233376y1	8.09	上游：CCGGCAGTCGATTACTCCACG 下游：CAGTAGCCCCTCAAGCAAAACATTC
P37	umc2084w2	9.01	上游：ACTGATCGCGACGAGTTAATTCAAAC 下游：TACCGAAGAACAACGTCATTTCAGC
P38	umc1231k4	9.05	上游：ACAGAGGAACGACGGGACCAAT 下游：GGCACTCAGCAAAGAGCCAAATTC
P39	phi041y6	10.00	上游：CAGCGCCGCAAACTTGGTT  下游：TGGACGCGAACCAGAAACAGAC
P40	umc2163w3	10.04	上游：CAAGCGGGAATCTGAATCTTTGTTC 下游：CTTCGTACCATCTTCCCTACTTCATTGC

五、作业

1．比较并分析实验小组间或重复间产生误差的原因。

2．分析SSR分析的关键技术，评价SSR技术的应用价值。

3．讨论单个SSR标记检测结果的可靠性。

实验六  种子水分测定

一、实验目的与要求

通过本实验，使学生掌握种子水分测定的基本原理和方法，了解电烘箱的的构造、原理和使用方法。

二、实验材料与用具

1．材料 水稻、棉花、大豆、小麦、玉米、花生等作物种子。

2．用具 恒温烘箱、感量0.001g天平、粉碎机、样品盒、干燥器、干燥剂、坩锅钳、角匙等。

三、实验的方法步骤

(一)高恒温烘干法

1．把恒温烘箱温度调节到140～145℃℃预热。

2．把样品盒预先烘干、冷却、称重，并记下盒号。

3．从送验样品中取15～25g种子，水稻、小麦、玉米进行磨碎(细度至少50%通过0.5mm筛孔的金属丝筛，而留在1.0mm筛子上不超过10%)，大豆粗磨，棉花和花生种子磨碎或切成薄片。

4．称取试样2份，每份4.5～5.0ｇ，放入样品盒。

5．将样品盒放入烘箱内，在5～10min内，当温度回升到130℃～133℃时，开始计算时间。

6．在130℃～133℃下烘1ｈ，打开箱门，盖好盒盖，放入干燥器内冷却30～45min后再称重。

     (二)结果计算

式中：M1—样品盒和盖的重量；

M2—样品盒和盖及样品的烘前重量；

M3—样品盒和盖及样品的烘后重量。

若用预先烘干法，可从第一次(预先烘干)和第二次按上述公式计算所得的水分结果换算样品的原始水分。即： 

式中：S1—第一次整粒种子烘后失去的水分；

S2—第二次磨碎种子烘后失去的水分。

测定数值填入表附-5

表附-5 种子水分测定记载表

作物

名称

烘干 步骤

测定 方法

盒 号

盒 重（g）

试样重（g）

（盒﹢样）重(g)

失重（g）

水分(%)

重复间差  异(%)

水分(%)

水分(%)

烘前

烘后

检 测 依 据

GB/T3543.6—1995

说明：1、环境条件：温度          ℃，相对湿度          %； 2、烘干步骤一栏用于填写高水分预先烘干法的两次烘干。

检验员：      日期：      校核人：      日期：      审核人：      日期：

实验七  电导率法测定种子活力

一、实验的目的与要求

通过本实验，使学生了解电导率法测定种子活力的原理，掌握电导率法测定种子活力的方法。

二、实验材料与用具

1．材料 不同活力的豌豆、大豆等种子

2．器具 电导仪、天平、滤纸、尼龙丝网或塑料丝网、烧杯、镊子等。

三、实验的方法步骤

1．从不同活力的大豆种子中数取试样50粒，2次重复。

2．将试样称重，精确到0.01g。

3．将试样放入干净的150ml三角瓶中，加入100ml无离子水，加盖防尘，于20℃条件下浸种24h，另用一杯无离子水作对照。

4．用滤纸或清洁丝网沥去种子。

5．用电导仪测定浸种液和对照液的电导率。

6．计算平均电导率,换算成单位重量样品的电导率。

四、作业

计算各试样的电导率，并分析不同种子批的活力差异。

实验八 加速老化法测定种子活力

1、实验目的与要求

    通过本实验，使学生掌握加速老化法测定种子活力的基本原理、适用范围、操作步骤和注意事项。

2、实验材料与用具

    1.实验材料 大豆种子

    2.用具 老化外箱、老化内箱、感量0.001g天平、去离子水或蒸馏水、带刻度的容量杯（刻度从0至100mL）、铝盒(供种子水分测定)、发芽试验设备。

3、实验步骤

    （一）预备试验．

    1.检查老化外箱 老化外箱的温度必须经过国家标准计量院的检定或类似的温度计。

    2.检查温度 温度要达到4l±0.3℃下才能进行测定。

    3.保证老化内箱的清洁度 为了防止菌类污染，使用过的老化内箱、盖和网架需经过热消毒或用15％次氯酸钠溶液洗净并烘干。

    （二）测定每一种子批的程序

    1.检查种子水分 如果不知道测定种子批的水分，应采用烘箱法测定种子批的水分。对于水分低于10％或高于14％的种子批，应在测定前将其水分调节至10％～14％。

    2.准备老化内箱 把40mL去离子水或蒸馏水放入老化内箱，然后放入网架，确信水不渗到网架和后加的种子上。从净种子中称取42g(至少含有200粒种子)种子，称重后放在网架上，摊成一层。每次测定应包括一个对照样品。保证每一内箱有盖(不要封口)。注意盖不应密封。

    3.使用老化外箱 内箱排成一排放在架上，同时放入外箱内。为了使温度均匀一致，外箱内的两个内箱之间间隔大约为2.5cm。记录内箱放人外箱的时间。准确监控老化外箱的温度，在41±0.3℃下保持72h。

    4.发芽试验 经72h老化时间后，从外箱取出内箱，记录这时的时间。取出一小时内用50粒四个重复进行标准发芽试验。在同一天内如果有许多批种子进行老化试验，样品应进行分类，在两个老化外箱的试验应间隔1h，以便有时间在老化后进行置床发芽。

    5.检查老化后对照样品的水分 在老化结束时进行标准发芽前，从内箱中取出对照样品的一个小样品(10～20粒)，马上称重，用烘箱法测定种子水分(以鲜重为基础)。记录对照样品种子水分，如果种子水分不在27％～30％之间，则试验结果不准确，应重作试验。

    6.结果计算与表示 用四次50粒重复的平均结果表示人工老化发芽结果，以百分率表示。

    7.结果说明解释 AA测定并不提供一个绝对的活力范围，只是通过一段时间的高温高湿逆境后进行发芽试验的结果。该结果与老化前同一种子批的发芽试验结果比较，如果AA结果类同于标准发芽试验结果为高活力，低于标准发芽试验结果为中至低活力。这样，可用该结果来排列种子批活力，来判定贮藏潜力或每一种子批的播种潜力。

实验七 蛋白质电泳法鉴定玉米杂交种纯度

一 供试材料：

沈玉21，先玉335,沈单16玉米杂交种种子。

二、仪器设备: 样品钳，夹芯式电泳槽，高速离心机，电泳仪，精度0.OOlg天平，冰箱，1.5ml离心管和离心管架，带盖瓷盘、放试剂的广口瓶、移液管及移液管架瓶、吸耳球、滴瓶、注射器、研钵等。

三、试剂 :丙烯酰胺(Acr)，甲叉双丙烯酰胺(Bis),KOH，过硫酸胺(AP),冰乙酸，四甲基乙二胺(TEMED) ,甘氨酸，三氯乙酸，考马斯亮兰R250,无水乙醇，甲基绿。所有试剂为分析纯级。

四、试剂的配制

1号：90g丙烯酰胺(Acr)+3g甲叉双丙烯酰胺(Bis)加水溶解并定容至500ml

2号：60g脲加水溶解并定容至200ml

3号：48ml1mol/L的KOH+17.2ml乙酸加水定容至100ml 

4号：48 ml1mol/L的KOH+2.9ml乙酸加水定容至100ml

5号：四甲基乙二胺(TEMED)原液

6号：10%过硫酸胺

电极液：甘氨酸0.44g加水溶解+4.5ml乙酸再加水定容至1100ml

指示剂：0.1%甲基绿水溶液

染色剂：10%三氯乙酸200ml+1%考马斯亮兰乙醇溶液10ml

提取液：80g脲+80ml水+乙酸加水定容至500ml

五、操作步骤

1.蛋白质提取:将每粒种子样品用单粒粉碎器磨碎后倒入1.5ml离心管中，加入适量提取液，稍静置后（0.5小时以上或5000rpm离心15分钟），上清液即可点样。

2.凝胶室的制作:将预先洗净晾干的玻璃板装入胶条中，并把胶条固定在电泳槽中，保持水平，拧紧螺栓，配少量浓缩胶溶液封好底缝。

3.灌分离胶:依次取1号22.5ml、2号5ml、3号3.75ml、6号1.6ml、5号0.2ml混合后倒入制好的胶室至距顶端2cm左右为止，约20-30分钟胶可聚合，吸去析出水分。

4.灌浓缩胶:依次取1号3ml、2号2ml、4号5ml、6号0.3ml、5号0.04ml混合后倒在分离胶上，并插入梳子，约10-20分钟，待浓缩胶聚合后轻轻拔出梳子，准备点样。

5.点样: 用微量进样器取每粒种子样品的上清液15-20μl注入浓缩胶上的凹穴内，每点完一粒样后要清洗进样器。

6.电泳:加样完毕后，小心倒入电极液，并在上槽加入3-4滴甲基绿指示剂，接通电源，稳压180V，约需2-2.5小时。

7．染色:将电泳后的凝胶放入染色液中，在30℃恒温条件下染色约需2-3小时。

8.鉴定:以标准谱带为对照，根据蛋白图谱的显著差异进行区分，鉴定并计算品种纯度。