银纳米粒子的制备、表征及抗菌性能研究

龙世佳;刘妍;董小宁;唐惠安;王晓峰;刘岿

【摘 要】采用化学还原和晶种诱导结合法制备银纳米粒子,并用紫外-可见分光光度计(UV-vis)和透射电子显微镜(TEM)对所制备的银纳米粒子进行表征;用大肠杆菌为受试菌株进行药敏实验,采用纸片法通过比较抑菌圈大小测试了不同浓度银纳米粒子的抗菌性能.结果表明单分散的、平均粒径约为15nm的准球形银纳米粒子对埃希氏大肠杆菌(E.coli)具有明显的抗菌作用,且抗菌效果随着纳米粒子浓度的增加而增强.

【期刊名称】《甘肃高师学报》

【年(卷),期】2017(022)006

【总页数】5页(P20-24)

【关键词】银纳米粒子;大肠杆菌;抗菌性能

【作 者】龙世佳;刘妍;董小宁;唐惠安;王晓峰;刘岿

【作者单位】天水师范学院化学工程与技术学院,甘肃天水 741001;天水师范学院化学工程与技术学院,甘肃天水 741001;天水师范学院化学工程与技术学院,甘肃天水 741001;天水师范学院化学工程与技术学院,甘肃天水 741001;天水师范学院化学工程与技术学院,甘肃天水 741001;天水师范学院化学工程与技术学院,甘肃天水 741001

【正文语种】中 文

【中图分类】TB383.1

银纳米颗粒因其小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应等特异性，从而具备特殊的光、热、电、声、磁、力学性能、催化性能和化学活性等等[1-4]，可广泛应用于催化、生物、工程等众多领域，在整个新兴功能材料开发应用方面占据着核心位置.近几年，银纳米抗菌技术发展迅速，显示出广阔的应用前景，银纳米粒子作为一种重要的纳米抗菌剂，其高效、广谱、持久及不产生耐药的抗菌性能，引起研究者的极大关注.因此彰显银纳米优异性能的开发应用研究如火如荼，其物理化学制备方法也越来越多.常用的如化学还原法、微波法、微乳液法、光诱导法、电化学法等.[5～8]

使用一种纯化学还原法制备了银纳米粒子，采用紫外-分光光度计（UV-vis）和透射电子显微镜（TEM）对所制备的银纳米粒子进行表征，并通过抑菌圈法[9]对纳米银的抗菌性能进行定性测试研究.

1.1 主要仪器

HITACHI-7500型透射电子显微镜，日本日立公司；UV-2550型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；KQ-218型超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司；WHY-2S型数显旋转水浴恒温振荡器，中国金坛诚辉仪器厂；TGL-20M高速台式冷冻离心机，长沙湘仪离心机有限公司；立式压力蒸汽灭菌机，上海申安医疗器械厂；ZHWY-2012C型恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；ZDP-2120型全自动新型电热培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司.

1.2 实验材料

（1）药品及试剂：银、硼氢化钾、十六烷基三甲基溴化铵、柠檬酸钠、抗坏血酸、氢氧化钠、琼脂、庆大霉素、普通琼脂、蛋白胨、牛肉膏、氯化钠均为国产分析纯试剂.

（2）培养基配方

牛肉膏固体培养基[10]：牛肉膏3g，蛋白胨5g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL，琼脂15～20g，pH=7.4.

牛肉膏液体培养基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL，pH=7.4.

（3）实验菌株

大肠杆菌（Escherichia coli ATCC 25922）由天水师范学院基因工程实验室保存备用.

1.3 银纳米粒子的制备

1.3.1 方法

以银为前躯体，硼氢化钾为还原剂，在柠檬酸钠的体系中还原银制得银纳米晶种；再以十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）为保护剂，在CTAB与银形成的生长溶液中加入晶种，用抗坏血酸做还原剂，使晶种进一步成长为银纳米颗粒.

1.3.2 制备

往大试管中加0.5mL的0.01mol·L-1AgNO3和0.5mL的0.01mol·L-1Na3C6H5O6，然后加水至20mL，不断搅拌，并立即加入0.12mL的0.05mol·L-1KBH4，反应30秒后停止搅拌，溶液呈金黄色，静置两小时后，即制得银纳米晶种.[11]制备的种子必须在2～5小时内使用，否则晶种会失活.

往B、C、D、H每个干净的试管分别依次加入0.5mL的0.01mol·L-1AgNO3、1mL的0.1mol·L-1抗坏血酸和20mL的0.08mol·L-1CTAB.然后向这四个试管中依次加入2mL、1.5mL、1mL和0.5mL的种子溶液.最后往每支试管中加入0.2mL的1mol·L-1NaOH溶液.加入NaOH后，轻摇使溶液混合均匀.将试管放在40℃的恒温水浴中，10分钟内，每个试管由于所加种子量的不同而出现不同的颜色，即制得银纳米粒子溶胶.

1.3.3 表征

使用紫外可见分光光度计（UV-Vis spectrum）选择扫描波长在300 nm～600 nm之间，进行银纳米溶胶的吸收光谱分析与检测.

银纳米颗粒的形貌分析表征用透射电子显微镜，加速电压为20 kV.样品的制备是将5 mL已制备的金纳米棒溶胶经过10000r/s离心清洗三次（每次离心15～20 min，移出上层清液将沉淀物重新分散到2 mL二次水中，第三次离心重新分散到1mL乙醇中待测）.提前超声3～5分钟后，铺展在涂有碳膜的铜网上,然后经自然干燥后再进行TEM检测. 1.4银纳米粒子的抑菌实验

1.4.1 菌种的活化

取冷藏保存的大肠杆菌菌种，在琼脂平板上进行划线培养，放置在电热恒温培养箱中，在37℃下培养24h后，挑取单菌落接种在液体培养基中，放置在电热恒温振荡器中，在37℃下培养24h活化菌种.[12]

1.4.2 纸片法检测抑菌作用

将B试管中的银纳米胶体以10000 r/m高速离心20 min，取上层清液，将直径为0.6厘米的灭菌滤纸片在离心后的以上清液、稀释后的庆大霉素及普通生理盐水中浸泡24h，制成药敏纸片，其中庆大霉素和生理盐水为对照试剂.在无菌条件下，将分离纯培养菌株接种于普通营养肉汤中，37℃培养9h，将培养菌液用普通营养肉汤稀释至10-2，吸取0.1mL滴入普通营养琼脂平板均匀涂布，无菌操作将上述药敏纸片贴于培养皿上，置于37℃培养箱中培养24h，观察测量抑菌圈大小并记录结果.[13]

将B试管银纳米粒子经多次离心分离处理，完全去除CTAB后，加无菌水制得5ug/mL银纳米粒子溶胶，按2、4、8、16、32倍用无菌水进行稀释，重复上述抑菌实验操作，对比不同浓度下银纳米粒子的抑菌强弱.判定标准：菌圈直径0mm为不敏感；1～ 10mm为低度敏感；10～15mm为中度敏感；大于15mm为高度敏感.

2.1 银纳米粒子的表征

如图1所示，试管B、C、D、H中为所加银纳米种子体积依次为4mL、2mL、1mL、0.5mL而出现不同的颜色的银纳米溶胶，可观察其内溶胶的颜色依种子量的递减而从深黄色到黄色再到淡绿色.

银纳米粒子的紫外可见光谱如图2所示，谱线B，C，D，H分别表示在制备时所加种子的体积为4mL，2mL，1mL，0.5mL银纳米溶胶的吸收谱图.由经典紫外光谱理论可知，吸收峰的半高宽越宽，粒子尺寸分布就越广泛；吸收峰的位置和半高宽均不改变而吸收峰的峰值增大，则说明金属纳米粒子浓度增大，即单位体积内粒子数增多[14].由图2看出，对比B、C、D、H谱线，发现其均在400nm左右处有吸收峰，且随着加入种子量的减少，峰半高宽逐渐加宽，吸收强度减小.表明B、C、D、H试管中银纳米的尺寸分布依次不均，粒子浓度依次减小.

B谱线为单峰且吸收峰最强，峰形非常对称并且半峰宽很窄，这表明形成银纳米粒子的形状和尺寸分布都比较均一，且纳米颗粒浓度大；C、D谱线为双峰，除400nm处的峰外，在500nm左右又出现一很弱吸收峰，双峰是纳米棒的特征峰，表明粒子形状不一，球形中有杂型棒状粒子存在；H谱线虽是单峰，但吸收峰最弱而宽，表明该粒子数目少而且不均一.因此选则浓度较大的B试管和C试管中银纳米粒子进行电镜表征.

取少量经制样处理的银纳米粒子溶液，滴加到碳网上，防尘条件下干燥后，使用透射电镜，调整合适放大倍数，得到电镜图片.

图3A为B试管中的银纳米颗粒的电镜图，从图中可以看到银纳米粒子呈单分散的准球形，粒度尺寸分布均匀，粒径平均在15nm左右.该电镜照片正好与紫外表征B谱线的单峰,峰形对称且半峰宽窄相吻合.

图3B为C试管中银纳米颗粒的电镜图，从图中可以看到银纳米球中混有少量纳米棒，其中球形银纳米粒度分布较均匀，分散度较好，粒径平均在15nm左右.纳米棒长径比大概是25nm×10nm，杂型约占粒子总数的10%.这也与紫外表征C谱线预测的基本一致.

目前研究表明，纳米银的尺寸越小，其毒性越强.这是因为纳米银颗粒尺寸减小，其表面积/体积比更大，纳米颗粒溶解释放银离子的能力也增强.小尺寸释放银离子的量比大尺寸纳米银多，杀菌效果与银离子的释放量成正相关.[15]鉴于此，对照图3A和图3B，图3A的银纳米粒子形状尺寸分布均一，且尺寸保持较小的15nm，故以下的抑菌实验采用之.

2.2 抑菌实验结果

2.2.1 庆大霉素的对照与CTAB的抑菌实验

将庆大霉素和生理盐水制成药敏纸片，贴于普通营养琼脂平板上，并将其在37℃进行培养24h，结果如图4所示:左侧对照平皿（纸片浸有生理盐水）和右侧实验平皿（纸片浸有庆大霉素），左侧平皿没有抑菌圈而右侧平皿有明显的抑菌圈.

将CTAB溶液和生理盐水制成药敏纸片，贴于普通营养琼脂平板上，并将其在37℃进行培养24h，结果如图5所示：左侧对照平皿（纸片浸有生理盐水）和右侧实验平皿（纸片浸有CTAB溶液），左侧没有抑菌圈，右侧平皿有明显的抑菌圈.说明CTAB本身具有很强的杀菌能力.

由此可知，制备银纳米粒子时所用的保护剂十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）本身具有明显的抑菌作用，因此在检测纳米银的抑菌性能时必须先分离或彻底去除纳米银体系中CTAB.分离操作选用高速离心机以10000 r/min离心二十分钟,去除清液，沉淀再次用无菌水分散，经多次重复离心后，为确保CTAB与银纳米粒子的彻底分离，取上清液来制备药敏纸片，验证无明显的抑菌圈，说明CTAB完全除去.

2.2.2 银纳米粒子的抑菌实验

将B试管中的经多次离心分离完全去除CTAB后的银纳米粒子，加无菌水制得5ug/mL银纳米粒子溶胶，将其按2（2.5ug·mL-1）倍、4（1.25ug·mL-1）倍、8（0.625ug·mL-1）倍、16（0.3125ug·mL-1）倍、20（0.25ug· mL-1）倍用无菌水稀释，将稀释前后的6份溶胶制成药敏纸片，贴于普通营养琼脂平板上（标号A、B、C、D、E、G），将其在37℃进行培养24h，并与浸有生理盐水的对照皿（F）进行对比，结果如图6所示.图6中A、B、C、D、E平皿与F（浸有生理盐水）对照平皿对比有明显的抑菌圈，且抑菌圈因银纳米粒子浓度依次降低而减小；图7的G平皿与F对照几乎无抑菌圈，表明该浓度时几乎已无抑菌作用.结果表明：银纳米粒子浓度由5ug/mL降至0.3125ug/mL时对大肠杆菌的抑菌圈直径均大于15mm，基本保持在20mm以上，且随着银纳米粒子浓度的降低抑菌圈直径有所减小，说明纳米银对埃希氏大肠杆菌（E. coli）具有明显的抗菌作用，且随着银纳米粒子浓度的增加其抑菌能力也逐渐增强，但银纳米粒子浓度在0.25ug/mL以下几乎无明显的抑菌作用.

通过化学还原法制备了粒度较小的银纳米颗粒，经紫外分光光度计、TEM分析表征得知所制得的银纳米颗粒粒径约l5nm，呈单分散的球形.通过抑菌圈试验对该纳米银溶胶的抗菌性能进行了分析研究，结果发现所制得的准球形纳米银对大肠杆菌有很强的杀菌效果，且纳米银浓度越高、杀菌效果越明显.与其它形状银纳米相比，这些l5nm、粒径较小的准球形纳米银能更充分地与细菌接触，从而杀菌能力更强.可能是由于银纳米粒子的比表面积极大，遇水或在水中有Ag=Ag++e的反应存在；同时其直径极其微小，可以轻易侵入细菌.[4]Ag0与Ag+之间的平衡共存，这也许正是银纳米的持久抗菌性所在.

【相关文献】

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