两种中药黄酮类成分的微乳薄层色谱鉴别

两种中药黄酮类成分的微乳薄层色谱鉴别

邬浩杰

浙江省奉化市中医院　浙江奉化315500

关键词　微乳液　展开剂　黄酮类　薄层色谱　菟丝子　苦丁茶

　　色谱法是药物分析广为应用的经典方法,而薄层色谱法是最常应用的方法,其展开剂多为有机溶剂。以微乳液为流动相进行的色谱分析称为微乳色谱。微乳液是由表面活性剂、助表面活性剂、油和水按适当比例自发生成的无色透明、各向同性、低粘度的热力学稳定体系,与有机溶剂相似而有增溶作用[1]。康纯等[2-3]首次将微乳液应用到了薄层色谱技术中,研究分离和鉴定中药中的黄酮。与传统的方法相比,该法分离效率和检测灵敏度高,且斑点圆而集中,重现性好,毒性小且价格低廉。本文以不同含水量的SDS2正丁醇2正己烷2水微乳液为流动相[4],聚酰胺薄膜为固定相,对菟丝子、苦丁茶2种中药材的黄酮成分进行了鉴别,考察了微乳液类型、酸度、温度、时间因素对分离层析效果的影响,得到了理想的结果。

1　实验材料与仪器

111　材料:菟丝子、苦丁茶中药样品均于2008年9月购于浙江省奉化市中医院,由医院药房鉴定。

112　试剂:十二烷基硫酸钠(SDS)、正丁醇、正己烷、甲醇、甲酸、苯、乙酸乙酯、丁酮、乙酸、丙酮、无水乙醇、乙腈、盐酸、氨水(以上均为分析纯),铝、重蒸馏水、芦丁对照品(购自国药集团化学试剂有限公司)。

113　仪器:WF H–203B型三用紫外分析仪(上海精科实业有限公司);层析用聚酰胺薄膜(浙江台州市四青生化材料厂);P-1型薄层色谱展开缸(上海信谊仪器厂);SK-2510HB超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司);ZN-100高速中药粉碎机(长沙市岳麓区中南制药机械厂);YP2001N电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);硅胶G薄层板(自制)。

2　实验方法

211　溶液的配制:分述如下。

21111　微乳液展开剂的配制:在保证SDS、正丁醇、正己烷为27∶63∶10(质量比)的条件下,改变水量,配制系列微乳液。按上述质量比,取SDS、正丁醇、正己烷,加适量水搅拌溶解,然后加水至足量,混匀,放置24h,即可。6种微乳液的成分配比及结构[5]。见表1。

表1　微乳液的成分配比及结构(总量:100g)

含水量/%成分配比(g)微乳结构十二烷基硫酸钠(表面活性剂)正丁醇(助表面活性剂)正己烷(油)重蒸馏水(水) 15221953168151510W/O型30181944117103010W/O型45141834175154510W/O～O/W型60101825124106010W/O～O/W型7561715182157510O/W型902176131109010O/W型

21112　供试品溶液:取菟丝子、苦丁茶粉末各110g,分别加甲醇10ml,超声30min,过滤,取滤液作为上述两种药材的供试品溶液。

21113　对照品溶液:称取芦丁对照品适量,配成2mg/ml的甲醇溶液,作为对照品溶液。

212　薄层色谱条件:①微乳法:用毛细管吸取上述供试品溶液适量,于聚酰胺薄膜上点样,以表1中的微乳液为展开剂,于室温(15℃)上行法展开6cm。取出晾干,2%铝乙醇溶液显色,晾干,365nm 紫外灯下检视,拍照。②药典或文献方法:用毛细管吸取上述供试品溶液适量,按照各中药材在《中国药典》(2000版)[6]或《新编中药志》[7]中各自质量标准项下的薄层色谱条件点样、展开(展开剂见表2)、显色后置于365nm紫外灯下检视,拍照。

3　条件筛选

311　展开剂含水量对层析效果的影响:微乳液的含

水量可显著影响黄酮化合物的分离效果,本文以对照品、供试品进行了聚酰胺薄膜微乳层析实验,结果见

表2和图1。

表2　对照品、供试品的Rf 值与微乳液含水量的关系

序号

品名Rf 值Rf value (15℃

)15%30%45%60%75%90%1芦　丁

01863018230173T 0168016101552

菟丝子01853017930171T 016701610149T 3

苦丁茶

0184

3

0180

3

0172T

0168

0162

0151s T

　　注:T :拖尾(tailing );ST :严重拖尾(strong tailing );3:不规则斑点(irregular spot )。

图1　对照品、供试品的Rf 值与微乳液含水量的关系

从图1中可见,对照品和供试品的Rf 值随着微乳液中的含水量增加略有下降,分离效果随水量的增大而显著改善,且△Rf 值越大,分离效果越好。对照品和供试品在含水量为15%和30%的微乳液中Rf 值偏高,相互间的△Rf 值较小

,斑点不规则,分离效果不理想;含水量为45%的微乳液分离效果虽然得到改善,斑点有拖尾现象;含水量为90%的微乳液作为展开剂时,Rf 值太小,鉴别斑点在水相前沿与油相间出现影响分离效果;含水量为60%与75%的微乳液分离的效果较理想,两者相差不大,但后者斑点较圆整,前者分离更清晰,且层析时间更长。因此,从分离度和斑点效果及时间综合考虑,选择含水量75%的O/W 型微乳液作为展开剂最为适宜。

312　展开剂含水量对层析时间的影响:微乳液的含

水量对层析时间有显著的影响。本文将两种供试液点样于聚酰胺薄膜,测定了其在不同含水量的微乳液层析6cm 距离所需要的时间,见图2。

图2　展开剂含水量对层析时间的影响

　　由图2可见,含水量越低,层析时间越长。含水

量为15%的微乳液层析时间太长,90%的层析时间太

短,两者的层析效果均不理想,结合含水量与Rf 值的关系,选择含水量为75%的微乳液作为展开剂较为适宜。

313　展开剂酸度对层析效果的影响:本实验以含水量75%(O/W 型)微乳液作为展开剂,采用甲酸调节酸

度,分别以微乳液∶甲酸(9175∶0125)、(915∶015)、

(9125∶0175)和(910∶110)的展开剂进行选择。实验结果表明,在不用甲酸调整酸度的微乳液中,供试品及芦丁层析的斑点有明显的拖尾现象,在含5%甲酸的微乳液中的层析斑点拖尾现象明显减弱

,甲酸达到10%时基本上无拖尾现象。另外,实验结果也表明随着甲酸浓度的升高,对照品芦丁的Rf 值也逐渐增大,添加5%甲酸时R f 值为0155,添加10%甲酸时为0161。供试品各斑点基本能分离,添加10%甲酸时分离的斑点更圆整,少拖尾。现以含水量75%微乳液∶甲酸(910∶110)和(915∶015)层析效果作比较,见图3。

a :微乳液∶甲酸(915∶015)

b :微乳液∶甲酸(910∶110)

r :芦丁对照品　1组:菟丝子　2组:苦丁茶

图3　展开剂酸度对层析效果的影响

314　展开温度对层析效果的影响:以含水量60%和75%的微乳液:甲酸(9125∶0175)为展开系统,各

取两份,分别在室温和冰箱展开后进行比较。实验结果表明,温度(室温)和湿度对本法的薄层色谱层析

效果无显著影响;在冰箱的层析时间比室温(15℃

)下的层析时间长,两个不同含水量微乳液层析时间均为55min ,分别比相应水平下多21min 和15min ,即含水量

315　层析结果:由选择的各展开系统的薄层色谱图可见,供试品各有1个黄酮斑点的位置和荧光颜色与对照品芦丁相同,说明均含有芦丁。菟丝子、苦丁茶鉴别斑点的R f值随含水量的增加而下降,但分离效果随含水量的增加而改善,且展开时间减少;含水量<60%微乳液:甲酸为展开剂,斑点有重叠,展开不理想;含水量≥60%的微乳液∶甲酸(9125∶0175)鉴别菟丝子、苦丁茶均较理想。将各供试液采用微乳薄层色谱法与常规方法比较,层析结果具有显著地提高,能分离斑点数目增加,详见表3,且斑点清晰,圆而集中,拖尾少。

表3　黄酮成分在微乳展开系统与常用展开系统分离效果的比较

序号品名

药品质量标准方法或文献方法微乳薄层色谱法

展开系统斑点数展开系统斑点数

1菟丝子苯∶乙酸乙酯∶甲酸[8](5∶4∶2)6微乳液∶甲酸(9125∶0175)13 2苦丁茶石油醚∶乙酸乙酯(5∶1)5微乳液∶甲酸(9125∶0175)11　　注:括号内数值为溶剂的体积比。

4　讨论

根据胶束色谱理论[8-9],当流动相中存在胶束及两性表面活性剂,展开系统即具增溶、降低界面张力作用,并且因静电、疏水及立体等效应,供试品中各组分在微乳液中展开时迁移速度不同,而使结构和性质差别细微的复杂组分得以较理想地分离。微乳液与胶束同属低粘度的缔和胶体,且与胶束相比,具有更大的增溶量和超低界面张力,更有利于提高色谱效率。由于其富集增溶增敏的作用,使极性大的分子分配于微乳水连续相中,极性小的分子分配于微乳油核或穿插排列于表面活性剂与助表面活性剂组成的膜栅栏中。以微乳液作为展开剂与药品标准或文献报道的展开系统比较,分离效果显著提高,样品中检出的斑点明显增多,荧光增强,因此分离检测的灵敏度显著提高。

多数黄酮类活性物质分子中含有酚羟基,在中性微乳液中展开时会有斑点拖尾现象,而酸性微乳液有利于提高分离效果,有效地抑制拖尾现象,但易引起黄酮苷类的分解。本实验尝试过对微乳液改性剂进行选择,如甲酸、乙酸、丙酮、甲醇、乙腈、盐酸、氨水等,结果以甲酸、丙酮的效果最佳,可减少斑点的扩散和拖尾现象;与马柏林等人[10-11]采用甲酸抑制拖尾的实验结论一致。从图3可看出,两种中药中的黄酮组成成分不同,其酸性和极性的差异,使其微乳液展开系统需要添加的甲酸量也不同;当加入体积分数大于5%的甲酸时,两种中药中的黄酮类化合物层析效果均可得以改善。此外,温度(室温)和湿度对本法的薄层色谱层析效果无显著影响,温度在一定范围内可改变微乳液在聚酰胺薄膜层析速度,从而影响其层析时间;一般低温时(如冰箱)的层析时间比室温(15℃)的层析时间延长,温度每下降10℃层析时间将相应延长10min以上。因此,用温度来调整极性较大的黄酮微乳薄层色谱的层析行为。

中成药的成分复杂,有效成分的鉴定较难。部分含黄酮类有效成分的中成药质量标准,因处方组成复杂,检出困难。中药复方制剂的薄层鉴定实验是质量控制中非常重要的手段之一,应进一步总结和探寻微乳液在药物研究应用的范围和效果,开阔微乳液在色谱分析应用的良好前景。相信微乳技术今后在中药学领域会有更大的发展。

5　参考文献

[1]戈早川,余倩.胶束薄层色谱扫描法测定银黄片与银黄注射液中的黄芩苷与绿原酸[J].药物分析杂志,1999,19(5):348.

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收稿日期　2009209214