DNA亚硫酸氢钠修饰

1）、取3μg DNA，溶于60μl水中，95℃水浴10分钟；立即放于冰浴；加入6μl 10M氢氧化钠，使DNA变性，成为单链DNA；

2）、加入亚硫酸氢钠修饰液（5M亚硫酸氢钠；10mM氢醌；1mM TAC；0.3M盐酸胍；PH5.0） 690μl，混匀后分装到6个PCR管，每管约130μl；

3）、将3个PCR管放入PCR仪，运行下列程序进行亚硫酸氢钠修饰反应：

95℃ 20秒

95℃ 10秒

58℃ 20分钟 

Hold at 4℃

2、 DNA修饰产物的纯化：

1）、纯化：合并上述三管DNA修饰溶液，加入1ml PH为5.0的 6M 盐酸胍溶液作为结合剂以利于吸附，混匀后将溶液转移到套放在2ml收集管内的ΜNIQ-10柱中，室温放置2分钟，8,000rpm室温离心30秒，弃收集管中的废液；

2）、洗涤：加入500µl洗涤缓冲液（10mM Tris，PH=6.8，80％ 乙醇），8,000rpm室温离心30秒，弃洗涤液，再次加入500µl洗涤缓冲液清洗一次；

3）、脱磺化：在上述ΜNIQ-10柱中加入250μl脱磺化液（含30％ 乙醇，5%甘油，200mM NaOH，100mM NaCl），室温放置10分钟，8,000rpm室温离心30秒，弃收集管中的废液；

4）、洗涤：加入500µl洗涤缓冲液（10mM Tris，PH=6.8，80％ 乙醇），8,000rpm室温离心30秒，弃洗涤液，再次加入500µl洗涤缓冲液清洗一次。

5）、洗脱：把ΜNIQ-10柱放入一个新的1.5mlEP管中，加入70℃预热的TE（10mM Tris ，PH=8.0；1mM  EDTA） 35μl, 12,000rpm室温离心2分钟，收集洗脱液，此为修饰后的DNA溶液，即PCR模板。