clustalx的应用

目录

1. 方法介绍

1.1概念

1.2理论基础

1.3任务

1.4目的

2研究内容

3. 工具

3.1  clustalx简介

3.2  clustalx 后台运作流程

3.3 clustalx的下载

3.4 clustalx菜单设置

4.操作步骤

4.1获取目标序列

4.2执行比对

4.3  treeview软件制作进化树

5. 结果分析

正文

1. 方法介绍：多序列比对

1.1  概念：多序列比对即通过多个核苷酸或氨基酸的序列进行比较，确定序列之间可能由于功能、结构或进化上的关联而形成的相似片段。

1.2  理论基础：1）生物学一个最基本的假设是地球上所有物种都有共同的祖先，从这个祖先开始以树状形式发展，通常称为生命之树。

2）基于序列比对的同源即具有共同祖先。同源序列一般相似；相似可以用百分比来描述。序列不一定是同源的，相似序列在进化上具有趋同性 。序列决定结构，结构决定功能。

3）现有的基因、蛋白质等携带生物学信息、具有生物学功能的分子都是由原有的分子演化而来；现有的基因及其他核酸序列，都是由已经存在的基因或其他序列经过复制、转移、合并、删减等方式形成的；不同物种的基因、蛋白质在结构、序列上的相似性与其进化上亲缘关系密切相关。

1.3  任务：发现序列之间的相似性，找出序列之间共同的区域，辨别序列之间的差异。

1.4  目的：通过“相似序列  相似的结构 相似的功能“来判别序列之间的同源性，进而推测序列之间的进化关系。

2. 研究内容：通过对人类、家鼠、大鼠和鸡体内BMP-2（bone morphogenetic protein 2）即骨形态发生蛋白2的多序列比对得到的dnd结果文件来揭示在四种生物中的该蛋白的同源性。

3. 工具：clustalx 2.1

3.1  clustalx简介：Clustal是用来对核酸与蛋白序列进行多序列比对的软件，可以用来发现特征序列，进行蛋白分类，证明序列间的同源性，帮助预测新序列二级结构与三级结构，确定PCR引物，以及在分子进化分析方面均有很大帮助。Clustal包括Clustalw和Clustalx和Clustal omega。Clustalw是命令行接口；Clustalx是一个图形用户界面;；Clustal omega是Clustal家族的最新补充，是在以前的版本基础上，提供了一个显著增长的可扩展性，使数以十万计的序列在只有几个小时内排列。 它也将使用多个处理器包含其中。此报告仅介绍本地软件版clustalx，其操作界面简单，运行速度较快使其被广泛使用。

 3.2  clustalx 后台运作流程：

3.3 clustalx的下载：

     1）在浏览器地址栏输入clustal官方网站网址www.clustal.org并进入；

2）在右下角点击ClustalW/ClustalX并进入

              3）呈现的界面如下，点击EBI ftp sitej进入下载条目界面

4）选择最新版本2.1，进入

5）选择windowns版本的clustalx2.1，点击进行下载

6)在弹出的下载窗口中选择保存位置

7)完成下载

3.4 clustalx菜单设置（因软件功能多样，此模块仅介绍与多序列比对相关的主要操作内容）

输入序列的格式比较灵活，可以是FASTA格式，还可以是PIR、SWISS-PROT、GDE、Clustal、GCG/MSF、RSF等格式；输出格式也可以选择，有ALN、GCG、PHYLIP和NEXUS等，用户可以根据自己的需要选择合适的输出格式。

1）打开clustalx软件，操作界面如下图所示。上方有七个条目，分别是file（文件），edit（编辑），alignment（比对），tree（树状图），colors（颜色），quality（打分）和help（帮助）。

2）空白处的上方“mode”下可选择比对模式，有multiple alignment mode（多序列比对模式）和profile alignment file（剖面比对模式）。我们做的一般选择多序列比对模式。

3）在mode右边的font（字体）下拉框中可根据需要选择字体大小

4）上方工具栏点击file，出现的load sequence为载入序列，选择此载入方式的前提是要把比对的多条序列保存在一个TXT文件中，重复操作则覆盖上次文件；append sequence为添加序列，选择此载入方式即可把分开保存的序列文件分别载入到界面中；save sequence为保存序列。

5）Edit下有针对已载入序列的各种编辑操作，“cut sequence”为剪切，”paste sequence” 为粘贴，”select all sequence”为选中全部，下面还有”clear sequence selection”清除所选序列，”clear range selection” 清除所选区域，”remove gaps”清除空位等操作

6)alignment下有“do complete alignment“执行序列比对,”do guide tree only“只输出引导树，”alignment parameters“比对参数等，点击比对参数后，在右弹窗中可选择需要的比对参数，如”multiple alignment parameters“多序列比对参数。

             7）点击multiple alignment parameters,弹出窗口如下所示              

8）以下为构建引导树的内容，因下文实例操作中用treeview构建进        化树，此处引导树不再做介绍 。应注意的是，引导树不等同于进化树，引导树是clustalx软件在运行时知道比对的一个参照。此处可选择draw tree 观看引导树。

9）在colors 下可选择设置序列颜色，可选black and white 设置黑白色，也可通过load color parameter file 上传自定义色彩文件，一般默认即可

10）在quality下可以选择突出显示“show low-scoring segment“打分低的区段，“show exceptional residues”显示空位位点，也可选择“save column score to file”把比对得分以纵列形式保存成文件。

11）help中有关于软件操作的所有指导

4.操作步骤

4.1获取目标序列

BMP-2（bone morphogenetic protein 2）骨形态发生蛋白2的序列

Homo sapiens 人类

Mus musculus 家鼠

Rattus norvegicus 大鼠             

Gallus gallus 鸡

以其中一条序列为例的序列下载过程：

1）在浏览器中输入NCBI的网址www.ncbi.nlm.nih.gov并进入

2）在下方搜索栏中选择“protein”数据库，搜索关键词“bmp-2”

3）点击搜索后出现以下界面，根据描述“Mus musculus”打开此条目

4）在出现的界面中选择“FASTA”格式显示。

5）以FASTA格式显示的序列如下图所示

6）点击右上方的“send to”,选择下载FASTA格式的序列文件

7）依次下载四条序列。下载完成后可将四条序列保存在一个文件中，选择load载入软件；也可以分开保存，选择append载入软件。文件中每条序列必须以“>”号和注释开头，序列部分则另起一行，其中注释部分就是软件操作过程中序列的标识。必须把序列文件以英文命名并保存在clustalx所在的文件夹下，且此文件下所有文件名均需是英文的。

4.2执行比对

1）打开软件，选择append sequence

2）选中所选序列，依次载入后，调整字体大小后如下图所示。序列左边是物种名称，序列的不同颜色代表不同氨基酸残基（help中有详细描述）。

3）在alignment parameters 下选择multiple alignment parameters多序列比对参数

4)选择默认参数值

5）在alignment下选择do complete alignment执行序列比对操作

6）弹出的窗口中可以默认或选择aln文件和dnd文件的存放位置。默认的话则保存在软件的文件夹下。

aln文件打开后如图所示这个文件是默认输出，可以转换成各种格式，而且很多软件都支持这种格式。Aln文件可以用于保存序列比对结果，可用专门的多序列比对着色软件如着色，并进一步做分析等操作。

dnd文件是构建进化树的文件，只能用构建进化树的软件打开。是根据两两序列相似值构建的一个指导后面多重联配的启发树。不能做进化分析。进化分析要考虑的所有同源位点的一个综合效应，因此应该用.aln格式文件专门做进化分析。

7）默认后保存的文件如下图所示，保存在软件的文件夹下

8）保存竖列的打分文件，选中全部序列，选择“quality”下的“save column to file”保存，默认保存在软件的文件夹下，如下图所示

9）打开保存的打分文件

打开保存的打分文件，打开此文件后选择写字板显示如左图。其中五条序列相应位置上残基的比对得分在右侧显示，当五个残基完全一致时，分值为100分；当有不同残基时，根据选择的矩阵打分方式，不同的残基种类和不同的个数，其得分也不尽相同。

10）打开Aln文件，如下图中，“*”表示在所选打分矩阵下，该位置完全保守；“：”表示该位置的残基极相似，打分大于0.8；“.”表示该位置残基相似度较“：”低，打分低于0.8。Aln文件可以用于保存序列比对结果，可用专门的多序列比对着色软件如着色，并进一步做分析等操作。

4.3  treeview软件制作进化树

1）treeview软件下载网站很多，Treeview软件可以将多序列比对结果以进化树的形式展示，其默认前提是所有蛋白源自同一祖先。枝的长度代表进化距离。在其中两种树状图的左下角有标尺，可根据它来计算进化距离。主要的操作窗口如下图所示。

2）点击file载入，显示的选项中自动检索出了本地的dnd文件，点击即可得到进化树。

3）载入序列后默认已第二种树形图显示，也可选择其他几种树形图显示。右侧注释是物种名称，图形和字体的大小均可调整，注释也可修改。

上图中的0.1及下方的横线代表了该进化树上的相同距离所代表的数值，是对进化距离的一个定量显示。

4）点击file下的save as graphic 可将进化树保存成emf图形文件，如下图所示

5. 结果分析

1）从执行序列比对操作后的软件界面来看：

原来的序列中某些位置插入了空位，上方有“*”，“：”，“.”等符号。“*”集中出现在比对后第241-600个残基的区域，该区域保守度较高，说明这段区域很可能决定相近的功能。把这段区域的序列拷贝保存后可进入profile等网站中搜索或预测相应的功能。

2）从打分文件来看：残基相同时大氛围100,100集中出现的位置与软件界面显示的结果是一致的。

3）从生成的aln文件来看: aln文件将软件界面的图形结果用字符保存，可以更直观地看到保守区域。

4）从进化树文件来看：

从图上可以看出，从进化的初期，人类、鸡和两种鼠的BMP-2就朝着不同的进化方向进化。而家鼠和大鼠的BMP-2则在较晚时期才分开向着不同的方向进化。故家鼠和大鼠BMP-2的同源性较高，二者与人类和鸡的BMP-2同源性较低。