SYBRGreenI实时荧光定量RT_PCR测定猴免疫缺陷病毒RNA拷贝数方法的建立

中国实验动物学报

ACT A LABORAT ORIUM ANIM A LIS SCIE NTIA SINICA Dec.,2006

V ol.14　N o.4

研究报告

SY BR G reen I 实时荧光定量RT 2PCR 测定猴免疫

缺陷病毒RNA 拷贝数方法的建立

丛　　1

,李兆忠2

,魏　强1

,许　琰1

,蒋　虹1

,佟　巍1

,卢圣栋2

,涂新明

1

(11中国医学科学院中国协和医科大学实验动物研究所,北京　100021;21中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所,北京　100730)

　　【摘要】　目的　建立SY BR G reen I 荧光染料实时定量RT 2PCR 方法,测定猴免疫缺陷病毒(SI V )RNA 拷贝数。方法　巢式RT 2PCR 扩增SI V 病毒RNA gag 基因上1360-1837之间的长度为477bp 的片段,将该片段克隆到p GE M

T 载体上,构建p GE M 2SI Vgag477质粒。该质粒经性内切酶Not Ⅰ酶切后,进行体外转录,转录出的RNA 产物(RS )纯化后10倍系列稀释,作出标准曲线,作为SI V 病毒RNA 荧光定量检测的外标准品。结果　应用Qiagen 公

司QuantiT ect SY BR G REE N RT 2PCR K it ,该标准品可精确定量到100copies ΠμL 。结论　

制备的RS 外标准品纯度高,SY BR G reen I 荧光染料实时定量RT 2PCR 法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SI V )RNA 拷贝数。

【关键词】　SI V ;病毒载量;实时荧光定量RT 2PCR ;SY BR G reen I

【中图分类号】R373133　　【文献标识码】A 　　【文章编号】100524847(2006)0420271205

[基金项目]中国CIPRA 项目,由美国NIH 资助(编号:U19AI51915204)。[作者简介]丛　(19722),硕士,从事实验动物病毒分子生物学研究工作。

[通讯作者]涂新明,教授,硕士生导师,研究方向:实验动物病毒学。E 2mail :txming062@s ohu.com

Q uantification of Simian Immunodeficiency Virus (SIV )Viral Load Using

R eal 2Time Q uantitative RT 2PCR with SYBR G reen I

C ONG Zhe 1

,LI Zhao 2zhong 2

,WEI Qiang 1

,X U Y an 1

,J I ANG H ong 1

,

T ONG Wei 1

,LU Sheng 2dong 2

,T U X in 2ming

1

(11Institute of Laboratory Animal Sciences ,Chinese Academy of Medical Sciences (C AMS )&Peking Union

Medical C ollege (PUMC ),Beijing 100021,China ;

21Institute of Basic Medical Sciences ,C AMS &PUMC ,Beijing 100730,China )

【Abstract 】　Objective 　T o develop a real 2time quantitative RT 2PCR method with SY BR G reen I to assess the viral load of

SI V.Methods 　A 477bp specific fragment was amplified with nested RT 2PCR and ligated into a p GE M T vector.The

recombinant p GE M 2SI Vgag477was trans formed into E.coli DH5

αcompetent cells.Large am ount of cells were collected and purified after cultured in LB medium.Plasmids DNA were digested by restriction enzyme N ot I to linearize DNA after purified from the cells.The linearized plasmids DNA were transcripted into RNA using riboprobe in vitro transcription systems (Promega ,P1420).102fold serial dilutions of the RNA standards were quantified and the actual copy numbers were assessed using real 2time

quantitative RT 2PCR with SY BR G reen I by R oche LightCycler.R esults 　From 1×108copies ΠμL to 1×102

copies ΠμL of 102fold

serial diluted RNA could be quantified with real 2time quantitative RT 2PCR.The standard curve showed that they had g ood linear correlation and could be served for the quantification of other samples.The specification of amplified products is checked by melting curve analysis.Conclusions 　The RNA standards could be used as an external standards of the real 2time quantitative RT 2PCR method with SY BR G reen I.The method has high sensitivity ,specificity and stability s o that it could be used for the quantification of SI V RNA load.

【K ey w ords 】　SI V ;Viral Load ;Real time RT 2PCR ;SY BR G reen I

1　材料和方法

111　材料

11111　毒株:毒株为SI Vmac251,由美国Aaron Diam ond艾滋病研究中心Marx博士惠赠。

11112　p GE M T载体:p GE M T载体是Promega公司的产品,插入位点位于多克隆位点区内,其3′2T突出端为T ag酶产生的带A末端的PCR产物提供了一个匹配碱基,方便进行克隆。多克隆位点区还位于β2半乳糖苷酶的α编码区内,适用于蓝白斑筛选挑选重组质粒。

11113　大肠杆菌E.coli DH5α:大肠杆菌E.coli DH5α[supE44%lac169(φ80lacZ%M15)hsdR17 recA L1endA1gyrA96thi21redA1],由中国医学科学院基础医学研究所卢圣栋组保存。

11114　引物:实时荧光定量RT2PCR和巢式RT2 PCR中所用引物是用Primer510设计,来自于SI V病毒上高度保守的gag基因(表1)。

11115　real2time PCR仪:本研究中用到的real2time PCR仪是R oche公司的LightCycler,软件版本是315。

　　表1　引物

　　T ab.1　Primers used in the experiment

引物名称Primer 位　置

S ite

序列(5′→3′)

Sequence

PCR产物大小

PCR product size

2F1360213G CAG AG ACATCT AG TGG TGG AAACAGG AAC

477bp 2R180821837AATG TTG CCT ACTGG T ATGGGG TTTTG TTG

2f147621498G T AACT ATG TCCACCTG CCATT A

209bp 2r166521685CAG CCTCCTCG TTT ATG ATG T

112　方法

11211　外标准品的制备:①目的DNA片段的制备:用巢式PCR方法调取SI Vmac251病毒gag基因上的一段长度为477bp(136021837)的DNA片段,方法见参考文献[2]。②载体的构建、转化和鉴定:用T4 DNA连接酶将扩增的SI Vmac251病毒的DNA片段和p GE M T载体连接,构成p GE M2SI Vgag477,转化感受态细胞E.coli DH5α,应用蓝白斑筛选鉴定含重组子的宿主细胞。③重组质粒的提取和纯化:用牙签挑取白色单菌落接种于含50μgΠm L Am p的LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜。离心收集细菌,用T akara MiniBEST Plasmid Purification K it Ver.210提取纯化质粒DNA。④重组质粒的酶切、纯化:针对p GE M T载体上SP6启动子和插入片段下游的Not Ⅰ酶切位点选用NotⅠ内切酶,37℃1h酶切环状质粒成线性DNA,1%琼脂糖凝胶电泳。切下含3477 bp的目的DNA片段的琼脂糖凝胶,用T aK aRa Agarose G el DNA Purification K it Ver.210纯化。⑤体外转录:选用Promega的Riboprobe System2SP6进行体外转录。用Qiagen的RNeasy MinElute Cleanup K it纯

化转录得到的RNA标准品RS。⑥拷贝数的换算:用紫外分光光度计测定RS的A值和浓度,根据下面的公式计算拷贝数[3]。拷贝数(copiesΠμL)= 6×1023(copiesΠμL)×RNA浓度(gΠμL)

质量MW(gΠm ol)

其中,MW=RNA碱基数(bp)×330daltonsΠbp。11212　定量曲线和标准曲线的测定:按上述公式计算的拷贝数,将RS标准品用含30μgΠm L Carrier tRNA的DEPC水做10倍系列稀释,从1×107copiesΠμL、1×106copiesΠμL、1×105copiesΠμL、1×104copiesΠμL、1×103copiesΠμL、1×102copiesΠμL直至10copiesΠμL。使用Qiagen的QuantiT ect SY BR G reen RT2PCR K it,用R oche的LightCycler315real2time PCR仪测定定量曲线和标准曲线。总反应体系为20μL。内含: 2×QuantiT ect SY BR G reen I RT2PCR Master Mix10μL;引物2f、2r(10μm olΠL)各1μL,终浓度为015μm olΠL;QuantiT ect RT Mix012μL;模板1μL;PCR级水618μL。反应条件为:50℃20min(×1),95℃10 min(×1),94℃15s(×45),56℃20s(×45),72℃30 s(×45),75℃3s(×45)测定吸光值,即在每个循环结束后测定吸光值。随着PCR系统在每一个循环结束后测定吸光值,就得到了以循环数为横坐标、吸光值为纵坐标的定量曲线和以标准品浓度的对数值为横坐标,Ct值为纵坐标的标准曲线。(Ct值,是指每个反应体系内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小;起始拷贝数越少,Ct值越大。)反应结束后测定熔点曲线,全部反应终止在45℃。

11213　熔点曲线的测定:熔点曲线的测定是从65℃到90℃,每隔012℃测定吸光值。

11214　巢式RT2PCR方法测定RS外标准品:以10倍系列稀释的外标准品RS为模板,用巢式RT2PCR 方法扩增[2]。每轮PCR反应体系20μL,模板1μL,第一轮PCR引物为2F、2R,巢式PCR引物使用2f、2r。

2　结果

211　标准曲线

1×107copiesΠμL RS标准品的Ct值大概在15个循环左右,1×106copiesΠμL标准品的Ct值大概在18个循环左右,每两个相临稀释度RS标准品的Ct值都相差3到4个循环(PCR仪会自动给出精确的Ct 值)。所有标准品的Ct值基本在一条直线上,没有任何一个标准品出现大的偏差。本图中标准曲线的斜率是-31337,根据公式计算得扩增效率E= 101Π31337-1=01994,即9914%。

212　定量曲线

各个稀释度RS标准品在第一个循环结束后测到一个基础吸光值,接下来一直到第10个循环结束时都没有明显变化。从第11个循环开始1×107 copiesΠμL RS标准品的吸光值增大,定量曲线开始抬头,15个循环(Ct值)后,曲线迅速上扬,至第30个循环前后达到峰值,随后进入平台期,一直到反应结束。1×107copies

ΠμL到1×103copiesΠμL RS标准品的变化趋势与此相同,只是曲线抬头的位置(Ct值)依浓度降低而依次错后3到4个循环,显示为一组斜率相同,间距相等的平行曲线,见图2。102和10个拷贝RS标准品几乎同时在33个循环左右出现曲线,但斜率不同。阴性对照PCR级水也出现了扩增曲线,但吸光值不高。

213　熔点曲线

除1×102copies

ΠμL和10copiesΠμL标准品外,其

　　注:横坐标是RS标准品浓度的对数值,纵坐标是Ct值。

　　图1　10倍系列稀释RS标准品的标准曲线

　　N ote:The x2axis shows the log concentration of the RNA

standard(RS)and the y2axis shows the cycle number.

　　Fig.1　S tandard curve was calculated with6values

ranging from107to102RNA copiesΠμL by R oche LightCycler

and serves for the quantification of other samples.

　　注:由左至右分别是1×107copiesΠμL、1×106copiesΠμL、1

×105copiesΠμL、1×104copiesΠμL、1×103copiesΠμL、1×102

copiesΠμL和10copiesΠμL RNA标准品(RS)的荧光定量曲线,

最下面一条线是PCR级水做的阴性对照。

　　图2　10倍系列稀释RNA标准品(RS)的荧光定

量曲线

　　N ote:It shows am plification curve of1×107copiesΠμL,1×106

copiesΠμL,1×105copiesΠμL,1×104copiesΠμL,1×103copiesΠμL,1×102copiesΠμL and10copiesΠμL RNA standard(RS),

respectively,from left to right.As a negative control,the tem plate

RNA was replaced with PCR2grade water.

　　Fig.2　Amplification curve obtained with102fold serial

dilutions of the RNA standard(RS).

他稀释度RS标准品的熔点峰都在80℃左右,曲线平稳,峰尖且窄。1×102copiesΠμL标准品除了80℃的特异性熔点峰外,在73℃附近也出现了一个峰,并且它在80℃的熔点峰明显较其他稀释度标准品的峰矮。10copiesΠμL标准品和阴性对照PCR级水只在73℃附近出现一个熔点峰(图3)。

214　重复性实验

我们重复测定RNA标准品(RS)五次,分别得到五个Ct值,计算Ct平均值、标准差和变异系数,见表2。随着标准品拷贝数的降低,Ct值增大,标准差

　　图3　10倍系列稀释RS标准品的熔点曲线

　　Fig.3　Melting curve obtained with102fold serial dilutions of RNA standard(RS).

和变异系数也呈逐渐增大的趋势。

　　表2　10倍系列稀释RNA标准品(RS)重复性实验结果　　T ab.2　The reproducibility evaluation of102fold serial dilutions of RNA standard(RS).

标准品

S tandard dilution(copiesΠμL)

Ct平均值

M ean Ct value

标准差

S.D.

变异系数

CV(%)

1×1081214001282125

1×1071514801362133

1×1061819401502165

1×1052217501592160

1×1042612601672156

1×10329162013101

1×1023219411043117

我们重复测定RNA标准品(RS)五次,分别得到五个Ct值,计算Ct平均值、标准差和变异系数,见表2。随着标准品拷贝数的降低,Ct值增大,标准差和变异系数也呈逐渐增大的趋势。

215　N ested RT2PCR方法测定

RS外标准品实验结果[2],1μL系列稀释的RS 标准品经过巢式RT2PCR扩增后,1×105到1×102 copiesΠ

μL的RS标准品扩增出209bp的目的片段, 10copiesΠμL的样品PCR结果阴性,见图4。

3　讨　论

　　SI V是RNA病毒,属逆转录病毒科,慢病毒亚科[1]。SI V感染宿主细胞后,利用细胞的代谢系统包装出成熟病毒并释放到宿主的血液或组织液中。与人的HI V感染一样,在SI VΠSHI VΠS AI DS模型猴感染的高峰期,游离病毒滴度升高,随后下降。在S AI DS模型猴感染不同阶段,血浆中游离病毒量会有相应的变化,因此这个指标是和病程的发展有密切关系的。但一直以来,我们在这方面缺乏相对应的检测指标。定性RT2PCR方法敏感性很高,但不

　　注:111×105copiesΠμL;211×104copiesΠμL;311×103

copiesΠμL;411×102copiesΠμL;5110copiesΠμL;61D L2000DNA

marker。

　　图4　10倍系列稀释RS标准品巢式RT2PCR电泳

结果。

　　N ote:lane1,1×105copiesΠμL;lane2,1×104copiesΠμL;lane

3,1×103copiesΠμL;lane4,1×102copiesΠμL;lane5,1×101

copiesΠμL;lane6,D L2000DNA marker.

　　Fig.4　Results of electrophoresis obtained with102fold

serial dilutions of RNA standard(RS).

能精确定量;病毒分离方法虽然可以粗定量,但敏感性差,周期长。为此,我们建立了SY BR G reen I荧光染料实时定量RT2PCR方法来检测猴免疫缺陷病毒(SI V)RNA载量。

实时定量RT2PCR技术,是指在RT2PCR体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了RT2PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规RT2PCR相比,具有特异性更强、自动化程度高等特点,目前已得到广泛应用。目前国内外普遍使用的实时荧光定量RT2PCR包括使用荧光探针和非探针类两种。探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加,以T agMan 探针为代表;非探针类则是利用一些理化特征指示扩增产物的增加,以SY BR G reen I荧光染料为代表。SY BR G reen I是一种能与双链DNA结合发光的荧光染料,当PCR聚合延伸过程完成后,SY BR G reen I染料与双链产物结合,定量系统检测并记录荧光信号。随着PCR反应的进行,目的产物逐渐增多,所结合的SY BR G reen I荧光染料也相应增多,系统检测到的荧光信号强度就逐渐增大[3,4]。因此它产生的荧光信号强度与双链DNA的数量相关,可以根据荧光信号检测出反应体系中存在的双链DNA数量。但由于SY BR G reen I没有特异性,不能识别特定的双链,只要是双链就会结合发光,对反应中的非特异性扩增产物或引物二聚体也会结合产生荧光,所以在临床上使用可能会有假阳性发生[3,4]。但如果结合R oche LightCyCler测定熔点曲线的功能,就能正确区分特异性与非特异性。同时,也正由于它能和所有的双链DNA相结合,所以对不同模板不需特别定制,不需要设计特异性很好的探针,通用性比较好。

熔点曲线的测定主要是为了检测产物是否是特异性目的产物。我们知道,DNA双链的碱基组成不同,熔点温度不同。当到达产物的熔点温度导致DNA双链打开时,与DNA双链结合的SY BR G reen I 荧光染料释放致荧光值降低,LightCycler会根据在不同温度测得的荧光值绘制出一条熔点曲线。如果反应体系和条件优化的很好,引物的特异性很高, PCR产物纯度高,则熔点曲线的熔点峰窄且尖,如果产物不纯,有非特异性反应产物及引物二聚体,则熔点峰范围宽或有几个峰。

我们利用基因克隆技术,克隆了一个含有SI V 病毒gag基因片段的质粒p GE M2SI Vgag477,并利用体外转录系统转录成RNA,作为RNA定量的外标准品,建立了SY BR G reen I荧光染料实时定量RT2PCR 方法,来测定病毒RNA载量。应用R oche LightCycler PCR仪,该标准品可精确定量到100copiesΠμL,这表示只要20μL反应体系中含有100个拷贝的病毒RNA,就能被这个系统检测到。在不同的Ct值,不同稀释度的标准品依次扩增出一条间距基本相等、呈平行排列的曲线。这样一群平行曲线提示我们反应体系稳定性很好,扩增效率较高,每个样品管间的误差较小,从根本上保证了定量的准确性。1×102 copiesΠμL和10copiesΠμL标准品的熔点曲线在73℃附近出现了一个峰,这主要是由于拷贝数过低,其他非特异产物包括引物二聚体等产生的非特异的吸收峰。这个峰和电泳结果上的引物二聚体的条带是相对应的。由此我们可以判定,虽然10copiesΠμL标准品有荧光值,但通过测定熔点曲线看到这只是一个非特异吸收值,因此它仍然是阴性的。而1×102copiesΠμL标准品出现的双峰提示它虽然是阳性的,但模板量低。阴性对照PCR级水在73℃附近出现的熔点峰也同样是由非特异产物引起的,它没有出现目的产物的熔点峰,说明该反应体系未被污染,所得结果可信度高。

为了证明该标准品的稳定性,我们进行了重复性实验。每个稀释度标准品的Ct值基本恒定,标准差和变异系数随着标准品拷贝数的降低,有逐渐增大的趋势。这说明外标定量的方法也存在着可信区间,标准品拷贝数过低或过高,都可能影响定量的准确性,这提示我们在选择标准品时,不要选择极端拷贝数标准品,而应该在可信区间内选择,这样才能尽可能保持定量结果的准确性。

我们在建立此方法的过程中也发现SY BR G reen I实时荧光定量RT2PCR与巢式RT2PCR相比,具有线行关系好、线性范围宽等特点;并且,扩增和检测在同一管内完成,不需要开盖,不需要电泳检测PCR 产物,有效解决了污染问题[4]。同时,大大缩短了反应时间,本研究中我们应用R oche LightCycler可在一个半小时左右完成32个RNA样本的RT2PCR反应。

参考文献

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[收稿日期]　2005211201