组织蛋白提取

一：蛋白提取

　　1.脑组织称重，按照1：8（1g脑组织加8ml）的比例计算蛋白酶抑制剂的量(Aprotinin 、Pepstatin、NaF、Na3VO4 、Leupeptin ，PMSF不稳定最后取出来加，都是1:100的稀释)和TNE的量，先在每个EP管中加入计算好的TNE再加蛋白酶抑制剂，每个ＥＰ管中加入３颗珠子，用匀浆器匀浆或用研磨棒研磨。（蛋白酶抑制剂五种从-20拿到4度冰箱中溶解.各取100微升加入10毫升的TNE中（13层析柜中），TNE缓冲液（1.21g Tris,5.84g NaCl,0.37g EDTA/升），

　　2.匀浆完毕后用头将混合好的溶液吸入EP管，一般大块组织加600微，小块加300微，4°离心14000转/min，20min。

3.取上清移入新EP管(最好离两次) ，溴酚蓝·甘油·SDS·巯基乙醇等组成sample buffer（4X），Sample Buffer与蛋白比为3:1，在97度煮5分钟。防止盖子开，最好用东西盖住。始终在冰盒中操作，最后蛋白放入-80。

二：测蛋白浓度

计算所需BCA的量，按MA:MB:MC=25：24：1的比例配好，每个孔总量为300ul,BSA:A-I各加150ul,Mix加150ul

因BSA是溶解在NaCl，故加样时蛋白溶液和0.9%NaCl共加150ul(蛋白3ul,NaCl 147ul)

注意加样时要加复孔。

酶标仪震荡5s

37°孵育2小时

Western Blot的有效检测下限为0.1-1ng

蛋白提取可以分为三个步骤：

第一步获取材料。

第二步分离目的细胞或组织成份并破碎。细胞破碎的方法分为机械法和非机械法，机械法可以是振动、搅拌、研磨、压滤、超声、匀浆，非机械法可以是干燥、改变渗透压、冻融、酶解（纤维素酶、溶菌菌、蜗牛酶）等，不同来源的材料对于不同的处理方法耐受程度是不一样的，例如超声波可以很容易破碎动物细胞，但是破碎酵母细胞就困难许多。 

有三个问题需要指出：（1）所有的操作尽量在低温条件下进行，防止细胞内的蛋白酶释放出来而将目的蛋白降解，最好全程都在冰浴中进行，有条件用液氮的就用液氮，下同。（2）超声处理中会释放出大量的热，因此一定需要冰浴。同时超声过程会释放自由基，有可能改变蛋白质的结构，可向系统中加入少量的GSH（谷胱甘肽）进行还原。另外，超声过程有可能打断蛋白质大分子，所以如果研究的蛋白质分子量比较大时建议减少超声处理时间或者换用其它方法处理。（3）如果使用蛋白酶处理，可能会将目的蛋白降解，同时还引入了新的蛋白质从而干扰实验，所以一般不推荐使用。细胞的破碎与裂解过程没有严格的时间和空间界线，其作用仅仅是为了使裂解过程更容易，因此在破碎细胞过程中所用的Buffer一般也是裂解时的裂解液，注意不能加太多，根据经验，一般每克组织加2-3ml裂解液为宜。

常用的蛋白酶抑制剂有以下几种：

  丝氨酸蛋白酶抑制剂： PMSF，AEBSF-HCl，Aprotinin，Chymostatin，亮肽素（Leupeptin）

  天冬氨酸蛋白酶：PMSF，碘乙酸、抑肽素(Pepstatin),云芝发酵物

  巯基蛋白酶抑制剂：PMSF，TLCK，TPCK，Antipain-HCl,N-乙基顺丁烯二酰亚胺

  金属蛋白酶抑制剂（金属离子螯合剂）：EDTA，EGTA，塔罗肽

  苏氨酸蛋白酶：目前缺乏资料

  磷酸酶抑制剂：NaF，激活的原矾酸钠（激活方法将在试剂档案提及）、焦磷酸钠、β-甘油磷酸钠。

所有的去垢剂都由两部份组成，一部份是亲水的，一部份是疏水的，在助溶蛋白质的过程中，去垢剂的疏水基团一般主要和蛋白质结合，亲水基的一端则倾向于溶解在水中。

溶于水后能解离成离子的去垢剂叫离子型去垢剂，否则叫非离子型去垢剂，离子型去垢剂按照水中生成的离子类型又可以分为阳离子型去垢剂、阴离子去垢剂和两性离子去垢剂，近年来还发明了含离子型亲水基又有非离子型亲水基的混合型去垢剂。在这五种类型的去垢剂中，混合型垢剂垢一般不常用，而阳离子型去垢剂不可以用于SDS-PAGE(因为它们会使蛋白质带上正电荷，电泳习性和SDS-PAGE原理相前背)。

用于蛋白质提取的去垢剂只有阴离子去垢剂、两性离子去垢剂和非离子型去垢剂，它们的代表试剂如下：

   阴离子去垢剂：SDS（十二烷基磺酸钠）、DOC（脱氧胆酸钠）、SLS（十二烷基肌氨酸钠）

   两性离子去垢剂：CHAPS，Zwittergent系列

   非离子型去垢剂：Triton X-100，Triton X-114，Tween-20 ，NP40，C8APG（辛基葡萄糖苷）

第三步就是进行裂解制样。