小鼠胚胎干细胞培养实验步骤

点击次数： 540  作者：佚名 发表于：2009-03-06 16:26　转载请注明来自丁香园 

一、原代细胞培养原理

原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。

• 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养

• 掌握无菌操作技术

• 了解小鼠解剖操作技术

• 了解原代细胞培养的一般方法与步骤

• 了解培养细胞的消化分散

• 了解倒置显微镜的使用

二、实验材料

• 实验动物：孕鼠或新生小鼠

• 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）

0.25%胰蛋白酶

平衡盐溶液

70%乙醇

•  器材：灭菌镊子、剪刀若干把

灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个

吸管若干支

酒精灯

原代细胞培养方法

三、胰酶消化法

（1）胰酶消化法操作步骤——取材

a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。

b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。

c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。

d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。

e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。

f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。

（2）胰酶消化法操作步骤——切割

a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。

b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。

c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。

（3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养

a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。

c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。

d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。

e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。

e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。

（4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养

a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次。

b.静置，吸去上清，用平衡盐溶液漂洗消化后的组织块，用吸管反复吹打组织块，使细胞分离，静置，使未分散的组织块下沉。

c. 取细胞悬液接种至加了细胞生长液的培养瓶中（调整细胞浓度到5×105/ml左右），37℃下培养。

（注意：省略了离心、计数等步骤）

一、实验器材：手术小直剪刀三把、眼科直镊子三把、眼科弯镊子两把、玻璃平 皿三套、200目尼龙滤网、50ML、15ML离心管和手术刀片。以上物品均需要高压灭菌消毒处理。

二、实验试剂：无Ca+2和Mg+2的PBS、0.05%胰酶0.53mmol/L EDTA溶液、小鼠胚成纤维细胞（MEF）生长培养基:高糖DMEM加10%FCS。

`三、实验动物：孕期14至16天的孕鼠

四、实验步骤：

 1. 处死孕鼠，置于75%酒精里全身浸泡，然后在超净台中用一把剪刀和一把镊子把孕鼠外皮剪开，用另外一把剪刀和一把镊子把内皮剪开，露出子宫，最后用第三把剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。

2.用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30MLPBS的50ML离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉PBS，再重复此步骤一次，留少许PBS将胚胎转移到另一装有PBS的平皿中，用手术刀片将其细细切碎。

3.用200ul的移液反复快速吹打平皿中的液体，放在15ML离心管中，4℃1500rpm离心5分钟，倒掉上清，加10ML胰酶，重悬沉淀，放37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。

4.将上层细胞悬液倒入一装有10MLMEF生长培养基的50ML离心管中，用200目尼龙滤网过滤后，1500rpm离心5分钟收集细胞。30ML　MEF生长培养基洗涤两次（此步骤中作者试过用无血清的培养基洗涤，结果无差别）。

5.细胞沉淀用15ML生长培养基悬起，细胞计数（八只14天胎鼠可获得2-3×107细胞）。

6细胞悬浮于15ML MEF生长培养基中，接种到200ML的培养瓶中。

7.24小时后更换新鲜的MEF生长培养基。

8 E. n8.细胞长满后，先用PBS冲洗，倒掉，加胰酶消化（此步时间不宜过长，作者一般不超过五分钟），按1：5传代

9.细胞再次长到覆盖率80-90%左右，将其消化后，常规冻存。（冻存液要现配）4

五、实验结果：

六、讨论：1.原代培养，一定要避免污染。" i+ K1 h# d$ i4 S6 y6 o3 F

2. MEF生存能力有限，如果不冻存，体外存活十代左右。

3. 冻存后复苏的细胞只能传代一次，因为这些细胞繁殖能力有限。

4. 消化细胞时间不要过长

小鼠胚胎干细胞培养实验步骤

1、一般培养——保持胚胎干细胞处于未分化状态

培养基

      细胞复苏

      冻存细胞

      明胶包被

      细胞传代

2 、体外分化

培养基：包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）

体外分化方法

注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。

一般培养——维持ES细胞处于未分化状态

ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活*。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。

培养基

ES：配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。

贮存液

      DMEM（高糖）

      马血清（HS）

      L-谷氨酰胺（200mM）

      MEM NEAA（10mM）

      HEPES（1M）

      β-巯基乙醇（55Mm）

      PEST

      LIF

复苏细胞

细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒*，快速的进行细胞复苏是很重要的。

步骤：

1、从液氮中取出一管细胞；

      2、将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；

      3、将细胞转移到一15ml Falcon管中；

      4、加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；

      5、离心3分钟；

      6、弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；

      7、种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；

      8、孵育。

冻存细胞

冻存液：90％HS和10％DMSO

步骤：

1、1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；

      2、用细胞刮刀收集细胞；

      3、将细胞转入15ml 离心管管内并离心3分钟；

      4、弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10 cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。）

      5、分装于冻存管内，每管1ml；

      6、置－80℃过夜，第二天移入液氮。

Geltin（明胶）包被

准备500ml 0.1％geltin溶液

1、将0.5 g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。

      2、最好在溶液没有冷却的情况下通过0.22 μm滤膜过滤，贮存在4℃。

包被培养板或培养皿

1、加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15 cm培养皿加2ml，10 cm培养皿加0.5～1 ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。）；

      2、置室温30分钟；

      3、去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平放或倒扣，以免明胶污染盖子和流出培养板。

细胞传代

建议每2天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞。

纯化步骤包含在下面的方法中。

      1、去除培养液；

      2、无钙镁PBS（Gibco）洗涤；

      3、加入胰酶EDTA（Gibco）。37℃孵育5分钟。

      4、加入ES培养基使胰酶失活；

      5、将细胞转入15 ml离心管中离心3min；

      6、去除上清，将细胞重悬于2 ml ES培养基，至少吹打10－20次。如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。ES细胞有聚集成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。这样可能会减少细胞的自然分化。

      7、将细胞接种在没有包被的组织培养皿中（使用和一开始同样规格的培养皿）放入温箱2小时（分化细胞在该时间内将黏附，而ES细胞仍将保持悬浮）；

      8、含有细胞的培养基转入geltin包被的组织培养皿。吹打以确保细胞被分散开（前面已经提到--ES细胞有聚集成团的倾向）

      9、建议按1：4－1：10的比率传代 (ATCC)

保持细胞的传代比率很重要，以我们的经验，1：8的比率是好的，可以使细胞的自然分化降到最低。当你使用不同规格的培养板进行细胞传代可以使用表1来计算传代比率。

体外分化

胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。一般体外诱导向神经细胞方向分化，也可以采用低浓度的RA进行诱导。

时间线（总时间为27～34天）

第2步；4＋1天 第3步；4－10天 第4步；4天 第5步；10－15天

体外向心肌细胞方向分化

胚胎干细胞在体外去除LIF情况下会自然向心肌细胞方向分化，小鼠的R1系一般在第7-8天自然出现搏动的心肌细胞，与胚胎发育时间线是完全一致的。

培养基

EB

配制一20×不含DMEM，FBS，LIF的溶液（该溶液也能用于ES培养基--见前述）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。将21ml该溶液和50ml FBS加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。

贮存液

      DMEM(高糖)

      胎牛血清

      L-谷氨酰胺（200mM）

      MEM NEAA（10mM）

      HEPES（1M）

      β-巯基乙醇（55Mm）

      PEST（P104U/mlS104μg/ml

ITSFn and N3（分化培养基）：

      配制一20×不含DMEM/F12的溶液。分装在15ml 离心管中，（稀释为1×，ITSFn 7.05ml，N3 12.55ml），0.2μm滤膜过滤，贮存在-20℃。将该溶液加入DMEM/F12中制备培养基，贮存于4℃。

贮存液

      DMEM(高糖)

      转铁蛋白50mg/ml

      胰岛素5mg/ml

      亚硒酸钠300μM

      黄体酮（20μM）

      腐胺（100μM）

      PEST（P104U/ml S104μg/ml）

      层粘连蛋白100μg/ml

      纤维连接蛋白250μg/ml

      碱*rhFGF, 10μg/ml

      *在第4步将bFGF加入N3培养基使终浓度为10ng/ml。

      ITSFn and N3培养基贮存液的准备

使用无菌的溶剂和稀释液，在分装之前要对溶液进行过滤，如果因为某些原因溶液在分装之前没有进行过滤，需要在管子上标明以便别人在使用时知道该溶液不能直接用于细胞培养。

贮存液  溶剂，贮存液，稀释剂和储存

      转铁蛋白50mg/ml

      胰岛素5mg/ml

      亚硒酸钠300μM

      黄体酮（20μM）

      腐胺（100μM）

      PEST（P104U/ml S104μg/ml）

      层粘连蛋白（100μg/ml）

      纤维连接蛋白（250μg/ml ）

      碱*rhFGF, （10μg/ml）

      包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）

包被液的准备

      多聚-L-赖氨酸，15μg/ml

      把75ml多聚-L-赖氨酸和425ml 1×PBS混合。贮存在4℃。

      纤维结合蛋白，1μg/ml

      把0.5ml纤维结合蛋白和500ml 1×PBS混合。

包被过程：

1、加入多聚-L-赖氨酸，至少2－3小时（过夜也行）

      2、吸出多聚-L-赖氨酸

      3、加入纤维结合蛋白，大约1－2小时

      4、吸出纤维结合蛋白，放置30分钟晾干

      5、贮存在4℃

24孔板用200μl，6孔板用500μl。震荡培养板确保溶液能够覆盖盖玻片或培养孔。有时需要剧烈震荡培养板。

体外分化方法 

第1步：ES培养基 

      在LIF存在的条件下维持细胞培养 

第2步：EB培养基 

      使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。

1、分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分） 

2、纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15ml管中离心3分钟。

3、用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液 

4、一个15cm的细菌培养皿接种4～5×106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。 

5、2天后更换培养基 

将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。

6、用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。

形成胚状体需要4天时间。在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。这一天被认为是第2步和第3步的分界。

第3步：ITSFn培养基 

在最少量培养基中选择神经前体细胞 

1、胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基。

2、并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。 

3、保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔一天。 

观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。步骤的转换应该在神经前体细胞出现第一个清晰的标志几天以后，通常是在第3步的第6到第10天。 

第4步：N3培养基＋bFGF 

通过将神经前体细胞培养在含有10ng/ml bFGF的培养基中进行扩增。 

1、PBS洗涤，加入1-2ml 胰酶 

2、37℃孵育5分钟 

3、用4mlEB培养基终止胰酶活*，将细胞转入锥形管中放置3～5分钟移出细胞团，将上清移入一新的离心管离心。 

4、将细胞重悬于含有bFGF的N3培养基。 

5、将细胞接种在包被多聚-L-鸟氨酸/纤维连接蛋白的盖玻片上（最好将盖玻片放于24孔培养板或6孔培养板，6孔培养板中每孔放置5个盖玻片如果是塑料的放置4个，以使最大可能的获得样品数量）。24孔板接种3.5×105/孔或6孔板1.7×106 /孔。 

6、2天后更换培养基 

第5步：N3培养基 通过撤除bFGF使神经前体细胞分化 

1、细胞被接种在盖玻片上4天后将培养基换成不含bFGF的N3培养基 

2、根据需要换液（大约每隔一天） 

3、分化10～15天后固定细胞 

移除培养基 

      PBS洗涤 

      加入4% 

      室温放置30分钟 

      PBS洗涤2次 

      储存于PBS。长期储存使用含0.01％叠氮化纳的PBS

移植细胞的准备

细胞在胚状体形成4天以后被移植（相应于体外分化过程中的第2步末细胞被转种到组织培养板）。正如在前文体外分化中所描述的在移植之前4天开始形成胚状体。通常再需要一天时间以便将胚状体移植入一10cm的培养皿。

移植 

1、将胚状体转移至一15ml 圆锥形管中放置3～5分钟使胚状体沉降下来。

细胞被离心3分钟会更好。放置使之沉降将会去除更多的单个细胞（包括死细胞）而这些细胞可以被离心下来。

2、去除上清将胚状体重悬于无钙镁离子的1×PBS中 

3、离心3分钟 

4、去除上清加入1×胰酶（10cm的培养皿加1ml） 

5、37℃水浴5分钟 

6、加入5mlEB培养基小心吹打约10次 

小心处理细胞很重要，进行细胞传代分散细胞时不可剧烈吹打。 

7、离心2分钟 

8、吸出上清将细胞重悬于500μl EB培养基 

9、用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次 

10、离心2次 

11、吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基 

烟酸己可碱标记ES细胞进行移植 

1、准备一10μg/ml的烟酸已可碱染液（双苯酰亚胺，在冷冻室118） 

2、加入1mg（你能称到的最小量）到5ml EB培养基（制成200μg/ml） 

3、将溶液稀释成10μg/ml （100μl 200μg/ml 溶液和1.9ml EB培养基） 

4、如前所述将细胞重悬于2ml烟酸已可碱染液而不是EB培养基中制备ES细胞悬液

5、将悬液置于室温（或冰上）30分钟 

6、离心2分钟 

7、吸出上清将细胞重悬于2ml EB培养基 

8、重复一次 

9、离心2分钟 

10、吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基并置于冰上。 

细胞的冻存与复苏

为了防止因污染或技术原因使长期培养功亏一篑，考虑到培养细胞因传代而迟早会出现变异，有时因寄赠、交换和购买，培养细胞从一个实验室转运到另一个实验室，最佳的策略是进行低温保存。这对于维持一些特殊细胞株的遗传特性极为重要。现简要介绍深低温保存法（-70℃～196℃）的特点。细胞深低温保存的基本原理是：在-70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0～20℃阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。

一、细胞的冻存：为避免污染造成的损失，最小化连续细胞系的遗传改变和避免有限细胞系的老化和转化，需要冻存哺乳细胞。冻存细胞前，细胞应该特性化并检查是否污染。

有几种普通培养基用来冻存细胞。对于包含有血清的培养基，成分可能如下：

◆包含10%甘油的完全培养基， 

　　◆包含10%二甲基亚砜（DMSO）的完全培养基， 

　　◆50%细胞条件培养基和50%含有10%甘油的新鲜培养基，或 

　　◆50%细胞条件培养基和50%含有10%二甲基亚砜的新鲜培养基。

对于无血清培养基，一些普通的培养基成分可能是： 

　　◆50%细胞条件无血清培养基和50%包含有7.5%二甲基亚砜的新鲜的无血清培养基，或 

　　◆包含有7.5%二甲基亚砜和10%细胞培养级BSA的新鲜无血清培养基。

1、悬浮细胞

●计数将要冻存的活细胞。细胞应该处于对数生长期。以大约200～400g离心5分钟沉淀细胞，使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。 

　　●以1×107到5×107细胞/ml密度，在包含有血清的冷冻培养基中再次悬浮细胞，或者以0.5×107到1×107在无血清培养基中，再次悬浮细胞。 

　　●分装进冻存管，将冻存管置于湿冰上或放入4℃冰箱中，5分钟内开始冷冻步骤。 

　　●细胞以1℃/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。

2.贴壁细胞 

●使用分离试剂从基层分离细胞，分离时尽可能温和，使对细胞的损伤减少到最小。 

　　●在完全生长培养基中，再次悬浮分离细胞，确定有活力细胞数。

　　●以大约200g离心5分钟沉淀细胞。使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。 

　　●以5×106到1×106细胞/ml密度，在冻存液中悬浮细胞。 

　　●分装进冻存管，将冻存管置于湿的冰上或放入4℃冰箱中，5分钟内开始冷冻步骤。 

　　●细胞以1℃/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。

二、冻存细胞的复苏：冻存细胞较脆弱，要轻柔操作。冻存细胞要快速融化，并直接加入完全生长培养基中。若细胞对冻存剂（DMSO或甘油）敏感，离心去除冻存培养基，然后加入完全生长培养基中。

1、直接铺板方法

●取出贮存细胞，37℃水浴中快速融化。 

　　●直接用完全生长培养基铺板细胞。1ml冻存细胞使用10～20ml完全生长培养基。进行活细胞计数，细胞接种应该至少在3×105活细胞/ml。 

　　●培养细胞12到24小时，更换新鲜的完全生长培养基，去除冻存剂。

2、离心方法 

●取出贮存细胞，37℃水浴中快速融化。 

　　●把1到2ml冻存细胞加入到大约25ml完全生长培养基，轻轻混匀。 

　　●以大约80xg离心2到3分钟。 

　　●弃去上清。 

　　●在完全生长培养基轻轻再次悬浮细胞，并且进行活细胞计数。 

　　●细胞铺板，细胞接种应该至少为3×105活细胞/ml。 

复苏技术

1. 细胞复苏的原则

在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。

2. 细胞复苏的主要操作步骤

（1）佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。

（2）迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化，然后在无菌下取出细胞。

（3）在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。

细胞冻存液中一般会含有5—10%的DMSO，常温下DMSO对细胞有较强的毒副作用，因此在细胞解冻后应及时离心（1000r/min，5min）去除冻存液，否则严重影响细胞生存。若担心离心损失细胞量，可将细胞悬液先孵育4—6h（不离心），此时细胞已经贴壁，再轻轻倒掉含有冻存液的培养液，更换新的培养液后继续培养。另外，经丝裂霉素C或r射线处理过的饲养层细胞最好在事先包被过明胶的培养皿中培养，则更容易贴壁。

3. 注意事项

在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段（-5～0℃）。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上（已死亡）的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。

技术总结要点

1. 冷冻速度

冷冻速度也就是降温的速度，它与冷冻效果直接相关。Morris认为在冷冻过程中生物物理作用比生物化学作用更重要。冷冻速度、细胞收缩引起细胞膜和细胞器的变化是造成损伤的主要因素目。冷冻速度不同，细胞内水分向细胞外流动的情况也会不同。如果冷冻速度过慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，同时细胞内溶质浓度增高，细胞内不发生结冰；冷冻速度过快，细胞内水分没有足够时间外渗，随着温度的下降，细胞内会发生结冰；如果冷冻速度非常快，细胞内形成的冰晶反而非常小或不结冰而呈玻璃状凝固（玻璃化冷冻）。

不同的冷冻速度会使细胞内外产生不同的生理变化，同样也会对细胞造成损伤。冷冻速度过慢，细胞严重脱水，体积急剧收缩．超过一定程度时细胞失去活性。冷冻速度过慢会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶液损伤。冷冻速度过快，细胞内水分来不及外渗，会在胞内形成较大冰晶，造成细胞膜和细胞器的损伤，产生细胞内冰晶损伤。1937年，Luyet实液体的凝固可分为两种形式：一种是晶体化，液体中的分子呈有序的排列；另一种为非晶体化即玻璃化，液体中的分子呈无序排列，保持未凝固前的状态。故从细胞存活角度来说玻璃化冷冻是最为理想的冻存方法。细胞内外呈玻璃化凝固。无冰晶形成或形成很小的冰晶，对细胞膜和细胞器不造成破坏；细胞也不会在高浓度溶质的溶液中因暴露时间过长而受损。

不同细胞的最适冷冻速度不同，主要取决于水分渗透过程是否与降温速度相匹配；同时还取决于细胞的表面积与体积之比，以及细胞膜的渗透率。一般来说，小细胞（如红细胞等）对水通透性强，适用于快冻，最佳冷冻速率较高，可达103℃/min或更高；相反大的细胞或组织，如直径100nm以上的胚胎，对水的通透性弱，则适于慢冻。此外，最佳冷冻速度还受是否应用防冻剂、防冻剂的含量以及培养的细胞所处的状态等多方面的因素影响。目前被普遍接受的是皮肤的低温保存中采用慢冻快复温，一般认为降温速率以1～5 ℃/min为最佳。

2. 冷冻保存温度

冷冻保存温度是指长久保存细胞的超低温度，在此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止。经过长期保存的细胞和组织在复苏后仍能保存正常的结构和功能。

冷冻保存温度可以随着不同的细胞和生物体以及不同的冷冻保存方法而不同。液氮温度（-196 ℃）是目前最佳冷冻保存温度。在-196 ℃时，细胞生命活动几乎停止，但复苏后细胞结构和功能完好。应用-70～-80 ℃条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显降低。在0～40℃范围内保存细胞效果不佳。

3. 复苏

复温速度是指在细胞复苏时温度升高的速度。冷冻保存体外培养物，除了必须有最佳的冷冻速度、合适的冷冻保护剂和冻存温度外，在复苏时也需要有最佳的复温速度，这样才能保证最终得最佳冷冻保存效果。与冷冻过程相比，复温过程的研究显得薄弱得多。

复温速度不当同样会造成细胞损伤，降低冻存细胞存活率。其损伤发生非常快，持续时间也很短，原因可能有多方面。Mackenzie和Bank通过对酵母细胞的冷冻研究发现，冷冻过程中胞内形成的冰晶并未对细胞造成致命的损伤，反而是在复温过程中，复温到-40℃或者更高的温度时，细胞内会重新形成较大冰晶而造成细胞的致命损伤。常规的做法是，在37℃水浴中，于1～2min内完成复温，也就是通常采用的快速复苏。因此，最佳复温速率与最佳冷冻速率对保证获得最佳冻存效果同等重要。

4. 冻存保护剂

冻存保护剂（Cryoprotectant）是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质（常为溶液）。细胞悬液中加入冷冻保护剂可保护细胞免受溶液损伤和冰晶损伤。冷冻保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成．同时冷冻保护剂可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。冷冻保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂多是一些小分子物质，可以透过细胞膜渗透到细胞内。该类保护剂主要包括二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤同时。细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定时间进行预冷，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。目前使用较多的是DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等。

非渗透性冷冻保护剂一般是些大分子物质，不能渗透到细胞内。该类保护剂主要包括聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone，PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羟乙基淀粉等。其保护机制的假设很多，其中一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中的水分子相结合，降低溶液中自由水的含量。使冰点降低。减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。

不同的冷冻保护剂有不同的优缺点。目前的趋势是联合使用两种以上冷冻保护剂组合。由于许多冷冻保护剂在低温条件下保护细胞，在常温下对细胞有害。故在细胞复温后要及时清除冷冻保护剂。

1. Quick and humane sacrifice of pregnant female CD1 mice (E13.5) by cervical dislocation.

2. Dissect out uterine horns and transfer into 90mm dish.

3. Carefully remove fetuses from the uterus using forceps and scissors and rinse in DPBS.

4. Cut away brain and dark red organs, wash with fresh DPBS, and remove as much blood clots as possible.

5. Put tissue into a 60mm dish. Using an elbow iris scissors finely mince the fetuses until they become 1-3mm3 piece of tissue.

6. Wash with fresh DPBS three times.

7. Add 2ml of 0.05% trypsin/EDTA and incubate at 37°C for 5-10min.

8. Inactivate trypsin/EDTA by adding equal volume of MEF medium, Put into syringe up and down several times to dissociate into single cell.

9. Collect the suspensions in a fresh 15 ml centrifuge tube and pellet cells by centrifugation at 200g for 5-10min.

10. Carefully take off the supernatant and resuspend cells in 1ml MEF medium.

11. Seed cells into approximately two 60mm dishes containing 6ml MEF medium. Incubate dishes in a 37°C incubator with 5% CO2 for approximately 3h.

12. Change medium after cells attach (label these cells as P0).

13. The next day, allow cells to grow until confluence (repeat step 6-10). Split the cells 1:3-4 (label these cells as P1). 

14. When cells reach confluence, repeat step 6-10. Resuspend cells in freezing medium and freeze each plate in three cryovials.

15. Transfer the cryovials to -80°C freezer, the next day transfer cells to a liquid nitrogen store tanks (see Fig. 1).