绿色荧光蛋白标记的人脂联素真核表达载体的构建

脂联素（Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）是一种脂肪组织特异性分泌的蛋白质［１］。大量的研究证明脂联素在调节内分

泌代谢及能量平衡过程中发挥了极其重要的作用。

在脂联素转基因小鼠中，脂联素的过度表达成为预

防糖尿病和动脉粥样硬化的保护性因素，重组脂联

素在动物模型中具有抑制内源性葡萄糖的产生等

作用［２］。脂联素的深入研究将为胰岛素抵抗、肥胖、

动脉粥样硬化及２型糖尿病的防治开辟一个新的

领域。本实验旨在体外构建人重组脂联素真核表达

质粒ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ－ＧＦＰ－ＴＯＰＯ－Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，为进

一步研究其功能及信号转导机制等提供实验基础。１

材料与方法１．１材料含有人脂联素基因完整编码序列的模板质粒由本室构建和保存；ＴＯＰ１０感受态细胞购于天根生物有限公司；大肠杆菌ＤＨ５α及ＢＬ２１（ＤＥ３）为本实验室保存；真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ－ＧＦＰ－ＴＯＰＯ及转染试剂ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ为Ｉｎ－ｖｉｔｒｏｇｅｎ产品；高保真ｐｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡ聚合酶，质粒小提试剂盒，ＰＣＲ产物回收试剂盒均为大连宝生物产品；ＰＣＲ上、下游

引物为本室设计，由上海英骏生物技术公司合成及测序；其

他试剂均为国产分析纯试剂。１．２方法１．２．１人脂肪组织总ＲＮＡ提取、脂联素基因的合成及ＰＣＲ扩增、克隆载体的构建见参考文献［３］。１．２．２真核表达载体的构建及序列分析从实验室保存的含ｐＭＤ１８－Ｔ／Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ克隆质粒的ＤＥ３菌株中挑取一环，接种到氨苄青霉素Ａｍｐ（＋）的ＬＢ培养板中，３７℃孵育过夜。从中挑取一单个菌落接种到Ａｍｐ（＋）的ＬＢ液体培养基中，２５０ｒ／ｍｉｎ、３７℃过夜，按照质粒提取试剂盒说明书抽提过夜菌中的克隆质粒，１％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。采用Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的载体ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ－ＧＦＰ－ＴＯＰＯ构建人脂联素真核表

达质粒，按照该载体引物设计原则即上游引物５′末端加

ＣＡＣＣ，保证正确的延伸方向；为了使绿色荧光蛋白成功表达，要去掉下游引物的终止密码子，故设计引物如下：上游引

物５′－ＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＡＧＣＴＡ－３′

；下游引物５′－ＴＣＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＴＧＧＴＡＧＡＧＡＡＡ－３′

。以ｐＭＤ１８－Ｔ／摘要目的：构建绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）标记的人脂联素（Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）真核表达质粒。方法：用本实验室已构建好的人脂联素克隆载体ｐＭＤ１８－Ｔ／Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ为模板，结合已设计好的特异性引物，采用ＰＣＲ方法克隆出Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ目的片段，将该目的片段再连至真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ－ＧＦＰ－ＴＯＰＯ上，转化入ＴＯＰ１０感受态细胞中，通过筛选得到融合有绿色荧光蛋白的重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ－ＧＦＰ－ＴＯＰＯ－Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ。结果：ＰＣＲ获得长度为７３６ｂｐ的目的片段，经ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ－ＧＦＰ－ＴＯＰＯ真核表达载体连接、筛选及序列分析后，证实所插入的目的片段与ｇｅｎｅｂａｎｋ检索的人脂联素ｃＤＮＡ序列（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮＭ－００４７９７）１００％匹配。结论：绿色荧光蛋白标记的人脂联素真核表达载体构建成功。

关键词脂类遗传载体质粒绿色荧光蛋白质类聚合酶链反应

绿色荧光蛋白标记的人脂联素真核表达载体的构建V

刘德敏

杜春红孙颖张捷ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＥｕｋａｒｙｏｔｉｃｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ－ＧＦＰ－ＴＯＰＯ－Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ

ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒ

ＬＩＵＤｅｍｉｎ，ＤＵＣｈｕｎｈｏｎｇ，ＳＵＮＹｉｎｇ，ＺＨＡＮＧＪｉｅ

ＴｉａｎｊｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭｅｔａｂｏｌｉｃＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７０，Ｃｈｉｎａ

ＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ－ＧＦＰ－ＴＯＰＯ－Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅｅｎｃｏｄｉｎｇｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｈｕｍａｎＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｇｅｎｅｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＭＤ１８－Ｔ／ＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｕｓｉｎｇＰＣＲ，ｔｈｅｎｔｈｅｇｅｎｅｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｖｅｃｔｏｒｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ－ＧＦＰ－ＴＯＰＯａｆｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｗｈｉｃｈｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｏＴＯＰ１０ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌｓｉｎｏｒｄｅｒｔｏｃｈｏｏｓｅａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ａ７３６ｂｐｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＰＣＲｃｌｏｎｅａｆｔｅｒｂｌｏｔｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｍａｔｃｈｉｎｇｔｏｔｈｅｃＤＮＡｏｆｈｕｍａｎａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，ｗｈｉｃｈａｃｃｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｇｅｎｅｂａｎｋｗａｓＮＭ－００４７９７．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ－ＧＦＰ－ＴＯＰＯ－Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓｌｉｐｉｄｓｇｅｎｅｔｉｃｖｅｃｔｏｒｓｐｌａｓｍｉｄｓｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ

V 天津市教委基金项目（项目编号：２００３０２５）和天津市自然科学

基金资助项目（项目编号：０４３６０９２１１）

作者单位：３０００７０天津医科大学代谢病医院３２４

Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ克隆质粒为模板，ＰＣＲ扩增出含有特异性引物的人脂联素目的片段，ＰＣＲ扩增体系为：１０×ＰＣＲ缓冲液２．５μＬ，ｄＮＴＰ１μＬ，上下游引物各１μＬ，ＤＮＡ聚合酶０．２μＬ，模板０．５μＬ，加ｄｄＨ２Ｏ定容至２５μＬ；反应条件为：９４℃预变性５ｍｉｎ，９５℃变性３０ｓ，退火３０ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ，共３４个循环，最后７２℃充分延伸１０ｍｉｎ，１％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，按照ＰＣＲ产物回收试剂盒说明书回收纯化目的片段，为了更好地进行Ｔ－Ａ连接，将已纯化的ＰＣＲ片段进行３′末端加Ａ反应，反应体系如下：纯化ＰＣＲ产物１０μＬ，１０×ＰＣＲ缓冲液２．５μＬ，ｄＮＴＰ２μＬ，ＤＮＡ聚合酶１μＬ，加ｄｄＨ２Ｏ定容至２５μＬ；反应条件为：７２℃３０ｍｉｎ。取加Ａ后的ＰＣＲ产物４μＬ、真核表达质粒１μＬ，混匀，孵育５ｍｉｎ。取２μＬ重组质粒转化入ＴＯＰ１０感受态细胞中，２００ｒ／ｍｉｎ３７℃温育１ｈ，取２００μＬ接种到氨苄青霉素阳性的ＬＢ培养板中过夜，筛选阳性菌落，扩增菌落提取重组表达质粒，１％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，将菌液送至上海英骏生物技术公司测序以后，保存菌种于－８０℃。

２结果

２．１ｐＭＤ１８－Ｔ／Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ克隆质粒提取结果重组克隆质粒的长度为３５０９ｂｐ，１％琼脂糖凝胶电泳结果见图１，重组克隆质粒与预期片段大小相符。２．２人脂联素ＰＣＲ产物的鉴定结果以ｐＭＤ１８－Ｔ／Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ克隆质粒为模板，结合设计好的引物，经ＰＣＲ扩增后得到的人脂联素ＤＮＡ长度为７３６ｂｐ，与预期片段相符，见图２。

２．３脂联素真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ－ＧＦＰ－ＴＯＰＯ－Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ的鉴定将扩增好的人脂联素目的片段连入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ－ＧＦＰ－ＴＯＰＯ中，构建重组表达质粒，长度为６８９３ｂｐ，见图３。

２．４测序结果将构建好的重组表达质粒转入ＴＯＰ１０感受态细胞中，抗生素筛选阳性菌落，取１ｍＬ菌液送至上海英骏生物技术公司测序，测序报告与ＧｅｎｅＢａｎｋ检索的脂联素ｃＤＮＡ序列（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮＭ－００４７９７）１００％匹配。

３讨论

有研究发现脂肪组织除了储存能量外，尚具有活跃的内分泌功能，其分泌的多种激素参与神经、内分泌与免疫网络的调节，尤其对能量代谢调节具有重要作用。脂联素亦称Ａｃｒｐ３０，Ａｐｍｌ、ＡｄｉｐｏＱ及ＧＢＰ２８，是脂肪组织基因表达最丰富的蛋白质产物之一。人类脂联素基因长１７ｋｂ，位于染色体３ｑ２７，包含３个外显子和２个内含子。目前脂联素的多种生理功能如降糖、抗炎、抗动脉粥样硬化等均得到证实，但其作用的分子机制尚不清楚。有学者认为脂联素是通过腺苷酸激活的蛋白激酶（ＡＭＰＫ）信号通路发挥其降糖作用［４］；Ｋｏｏ等［５］认为存在于肝细胞中的环腺苷酸反应元件结合蛋白辅激活物（ＴＯＲＣ２）是控制糖异生的开关，该学者通过试验发现激活的ＡＭＰＫ能够与ＴＯＲＣ２结合，并使其磷酸化，固定在细胞质中，抑制糖异生。故笔者推测脂联素亦是通过ＡＭＰＫ－ＴＯＲＣ２传导通路发挥降糖作用。本实验以ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ－ＧＦＰ－ＴＯＰＯ为载体，成功构建了人脂联素真核表达载体。该载体是一种新型的真核表达载体，可以转染哺乳动物细胞、组织；载体本身带有绿色荧光蛋白（ＧＦＰ），可以方便地在荧光显微镜下鉴定转染是否成功；并且此载体可直接与目的基因ＰＣＲ产物进行Ｔ－Ａ连接，无需连接液，冰上孵育５ｍｉｎ即可，连接效率在９５％以上，快速、高效，大大缩短了实验时间。而传统方法是从组织或细胞中提取总ＲＮＡ，经反转录反应、ＰＣＲ反应获取目的片段后，连入克隆载体，采用双酶切的方法连入表达载体，连接过程往往需要过夜，时间长、效率低，并且重组的表达质粒转染细胞或动物后，无法迅速鉴定。与传统方法相比，本实验在目的片段之后，仅需要３５ｍｉｎ即可连入ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ－ＧＦＰ－ＴＯＰＯ、转化入ＴＯＰ１０感受态细胞中进行扩增，采用双酶切法则需要４８～７２ｈ，可见本实验大大缩短了重组表达质粒的构建时间，提高了鉴定速度。该重组表达载体的构建成功为进一步研究脂联素信号传导机制及其他的生理作用奠定了基础。

（图１￣３见插页）

参考文献

［１］ＡｒｉｔａＹ，ＫｉｈａｒａＳ，ＯｕｃｈｉＮ，ｅｔａｌ．Ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌｄｅｃｒｅａｓｅｏｆａｎａｄｉ－ｐｏｓｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｔｅｉｎ，ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，ｉｎｏｂｅｓｉｔｙ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ，１９９９，２５７：７９－８３．

［２］ＦｒｕｅｂｉｓＪ，ＴｓａｏＴ，ＪａｖｏｒｓｃｈｉＳ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｔｅｏｌｙｃｉｃｃｌｅａｖａｇｅｐｒｏｄｕｃｔｏｆ３０ｋＤａａｄｉｐｏｃｙｔｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ｒｅｌａｔｅｄｉｎｃｒｅａｓｅｓｆａｔｔｙａｃｉｄｏｘｉｄａｔｉｏｎｉｎｍｕｓｃｌｅａｎｄｃａｕｓｅｓｗｅｉｇｈｔｌｏｓｓｉｎｍｉｃｅ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２００１，９８（４）：２００５－２０１０．

［３］刘德敏，靳立忠，孙颖，等．人脂联素ｃＤＮＡ的克隆及序列分析［Ｊ］．天津医药，２００５，３３（２）：７１－７３．

［４］ＳｈａｗＲＪ，ＬａｍｉａＫＡ，ＶａｓｑｕｅｚＤ，ｅｔａｌ．ＴｈｅｋｉｎａｓｅＬＫＢ１ｍｅｄｉａｔｅｓｇｌｕ－ｃｏｓｅｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓｉｎｌｉｖｅｒａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｅｆｆｅｃｔｓｏｆｍｅｔｆｏｒｍｉｎ［Ｊ］．Ｓｃｉ－ｅｎｃｅ，２００５，３１０（５７５４）：１６４２－１６４５．

［５］ＫｏｏＳＨ，ＦｌｅｃｈｎｅｒＬ，ＱｉＬ，ｅｔａｌ．ＴｈｅＣＲＥＢｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒＴＯＲＣ２ｉｓａｋｅｙｒｅｇｕｌａｔｏｒｏｆｆａｓｔｉｎｇｇｌｕｃｏｓｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３７：１１０９－１１１１．

（２００６－１１－０２收稿２００７－０１－０５修回）

３２５