荧光定量PCR的历史

荧光定量PCR是PCR的一种。PCR仪目的为了基因扩增。在基因扩增中最重要的就是升降温过程，最早的PCR就是三个水浴锅,一个机械臂，定时抓出反应槽转换水浴锅。PCR的结果需要借助其他手段来检测。后来随着定量技术的发展，将PCR和检测做成一体，就形成了定量PCR仪。由于应用的是荧光技术，同时在每个扩增过程都能实施监控，所以标准的叫法为实时荧光定量PCR仪。准确的讲实时荧光定量PCR没有自动加样和标本处理系统，只能算半自动的。PCR仪简单的讲，就是一个温控设备和一个检测设备。

荧光实时定量PCR技术最早是在1992年由一位日本人Higuchi第一次报告提出的，他当时想实时地看到PCR反应的整个过程，由于当时EB（溴化乙锭）的广泛使用，最直接想到的标记染料就是EB，可以插入到双链核酸中受激发光，在PCR反应的退火或延伸时检测掺入到双链核酸中EB的含量就能实时监控PCR反应的进程，考虑到PCR反应的数学函数关系，结合相应的算法，通过加入标准品的方法，就可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。这样，在普通PCR仪的基础上再配备一个激发和检测的装置，第一台实时定量PCR仪就诞生了。

而真正市场化的美国应用生物系统公司自1996年推出荧光定量PCR仪，ABI公司一直标称其推出了全世界首台荧光定量PCR仪

目前市面上有多家品牌，主要有ABI、Roche、Bio-Rad和MJ

荧光定量PCR的技术

定量PCR技术自产生以来，不断发展完善，到目前为止已经非常成熟了。标记方法由最初单一的染料法，发展到了特异性更高的探针法，如Taqman、Molecular Beacon、Fret等不同方法的标记探针，其中由于Taqman探针的广泛使用，实时定量PCR的方法也称为Tagman法。

在过去很长一段时间里，由于PCR检测的灵敏性和不稳定性，容易产生假阳性，国家对这种检测方法在临床上的应用是禁止的。但是随着荧光定量PCR技术的发展成熟和完善，特别是Taqman方法的广泛使用，使得荧光定量PCR以一种新的PCR检测技术得以在在临床检测上使用，如对病毒、病菌及其它致病微生物，致病基因的检测。 

Taqman探针法具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重复性好；由引物、探针序列和引物探针相互作用关系的双重保证克服了普通PCR的缺陷，现在国家对这方面的正逐步解开，目前正在规范相应的法律法规，为荧光定量PCR技术在分子诊断中的广泛使用做准备工作。

最常用的有三种检测模式：

１、R Green I检测模式。

2、Taqman探针法

3、杂交探针

荧光定量检测技术的优势

相对于抗原抗体法检测具有以下优势：

1. 研发方便，设计探针和摸定反应条件可以在短时间内完成，顺利的话，只需几次反应和几天的工作量就可以完成一种检测方法的建立。而拿到一个好的抗体至少需要一个完整的免疫周期，还不考虑筛选获得一个高特异性、高滴度免疫株的成功几率。 

2. 检测灵敏度高，是一个基于PCR的信号放大检测系统。 

3. 可以准确定量。 

荧光定量PCR的应用

荧光定量检测技术在临床诊断方面很多，主要集中在各种病原体引起疾病的临床诊断，如肝炎类疾病、性病、与优生优育相关的疾病以及肺结核等等。

荧光定量PCR的应用不仅限于临床检测，在基础研究和海关、食品卫生检疫方面的应用前景都相当广泛。

基础研究中，对某一样品中目标基因含量的测定需求是相当广泛的，荧光定量PCR技术具有操作方便、反应快速的特点，可以对一些微量样品进行检测。所以在新药开发、超早期感染用药物及疗法的研究与开发、药物疗法研究、新诊断及检验试剂的开发、血液检验漏检率等方面，荧光定量PC技术有着广泛的应用前景。

在海关卫生检疫方面，进口的粮食、食品、花果是否安全，是否含有危险或潜在危险的成分，都可以用荧光定量PCR技术进行检测。一些瘟疫流行地区进口的相关食品也需要进行检测，比如前一段时间，欧洲流行疯牛病，日本流行猪口蹄疫，那么从这些地区进口相应的肉品及肉类加工产品，就要进行食品卫生检疫

在食品卫生检疫方面，如转基因食品，由于其是否安全目前尚无定论，因此有些国家明确规定转基因食品需要标签标识区分，我国也正在出台类似的法律法规。

此外一些生物类的恐怖袭击等，都可以用荧光定量PCR的方法进行快速检测。

所以荧光定量PCR最明显的对象主要是医院的检验科、中心实验室、临检中心、地方的疾病控制中心、生物技术公司、血液制品相关的部门。当然科研院所、学校是少不了的。

市场竞争情况：

现在国内国外荧光定量PCR仪的品牌不是很多，国内外品牌及产品代理商一览（见表一）

ABI美国应用生物公司：老牌的生物公司贵族，荧光定量PCR仪有四种型号的。其中5700、7700已停产；现在剩Prism® 7000荧光定量PCR仪、Prism® 7900高通量荧光定量PCR仪。ABI在中国有自己的办事处和销售人员。由于ABI是生物仪器的著名品牌，同时在产品推广方面有独到之处，所以其产品的销路一直很好。

ROCHE罗氏诊断：单一产品LightCycler，以科研定位为主。其很特色离心、气加热、毛细管等，设计另类，是最有特色的PCR仪。

罗氏其很多产品如诊断试剂，都进入医院，与医院的关系密切，在国内很多医院使用，市场做得很不错。

MJ Research：实时荧光PCR仪刚进入中国不久，孔间能使用不同温度是其特色。，其MJ Research在北京设立了办事处，其DNA Engine Opticon产品于2003年4月2日获得国家食品药品监督管理局的医疗器械准入证。

该公司系列产品早先是由基因公司代理，市场销售十分火爆，于2003年起正式由东胜公司独家代理。MJ的扩增仪在生命科研领域比较出名，加之东胜公司的擅长在学校和科研院所的推广，所以其荧光定量PCR在以实验为主体的研究领域占有重要地位。

伯乐： iCycler是其主打，进入中国已经比较久了，产品和5700一样，是扩增仪上加装定量模块而成，特点是价格较低。

生产商 型号 参考报价 代理销售商

美国应用生物系统公司 PRISM 7900高通量型  美国应用生物系统公司（上海）

 7000型   

瑞士罗氏诊断 LightCycler US$88,000 罗氏诊断产品（上海）有限公司

美国MJ Research公司 Opticon  东胜创新生物科技科技有限公司

 Opticon2多色荧光  

美国Bio－Rad iCycler iQ  伯乐分析生化仪器有限公司（上海）

美国Stratagene Mx3000P  安莱公司

 Mx4000   

Corbett Roter Cene-3000  基因公司

美国Cepheid公司 SmartCycler US$38000 上海皓嘉科技发展有限公司

英国HYBAID 不祥  广州三元科技有限公司

日本BIOER 齐全  上海华耀贸易有限公司 

上海枫岭生物技术公司 FTC2000  上海枫岭生物技术公司

厦门安普利生物工程有限公司 FluoScan 9700   厦门安普利生物工程有限公司

杭州博日科技有限公司 FQD-33A ￥428,000 杭州博日科技有限公司

深圳Hema公司 Hema荧光定量PCR ￥98,000 深圳Hema公司

                     表一

荧光定量PCR仪技术指标比较

荧光定量PCR简单讲即温控设备pcr和荧光检测系统、计算机及软件系统。

关于温控，包括温度的均一性、升降温速度。主要是介质问题。理想的介质是要求导热性好、比热大、接触紧密。

水浴和油浴：温控的首选，比热大（油比水更大）、与反应物无缝接触，效果当然最好。

缺点不能自动化、小型化，只有最初的水浴锅式使用。

硅加热：Peltier这是使用最普遍的一种，优点：易自动化、速度快、直接加热降温，效果当然好，

缺点1、成本较高；

2、第二其使用的介质是金属，导热虽然好，但是与反应管，很难做到无缝接触，定性时代可以加油，但用荧光定量，由于油有荧光信号不能用。所以在无缝接触上差一些。

空气加热：与反应体系无缝接触

缺点：空气的导热性差、比热小的弱点明显。因此空气加热的要利用离心来产生空气流动，增强导热性，同时使用毛细管，加大接触面积、试剂微量化来弥补。这样做了以后效果还是不错。

同时，使用离心，对标本量增大是有影响的，并且标本量越大，空气比热小的弱点就越明显，所以空气加热的仪器标本量都比较小。使用毛细管后由于反应液与管的接触面积增大，吸附现象更大，因此试剂的通用性差，一般要专门开发，成本高，虽然试剂用量少，但因为是专用试剂，每人份就是以实际量算，并不省试剂。反而增加了毛细管成本。

关于功能，所有的PCR仪功能都大体相同。只有MJ孔间能使用不同温度比较独特，这对于多项目同时检测以及循环参数的调整比较有用。但其实时荧光的仪器刚进入中国不久，

所以这样就可以把市面上的产品分两类，半导体Peltier和空气。

表一7家公司产品，其中罗氏的LightCycler和Corbert的RotorGene是用空气加热，其余是Peltier

当然加热还有电热丝+半导体，致冷还有压缩机

空气的加热的标本量为32/批，其他96/批，iCycler 能达到384/批，这也难怪，是扩增仪上加装定量模块而成，所以如果标本量大，建议不要用罗氏。一则会累死的。同时每个标本要分摊的标准曲线，对照成本太高，试剂也比较受限。

监测系统：

光源，钨灯、激光、发光二极管

检测器：摄像头、光电二极管、光电倍增管PMT

型号 激发光源  检测器

PRISM 7

品牌不是唯一，高性价比的荧光定量PCR仪选购指南

从1996年ABI公司推出了全球第一款荧光定量PCR以来，经过10几年的发展，由于荧光定量PCR仪的在科研、检测和诊断领域的广泛应用，市场规模也不断扩大。已有多家国内外生产厂商涉足研发生产,就连Eppendorf公司也于2006年底推出了自己的荧光定量PCR仪。这些产品良莠不齐，令研究人员选择是不免挑花了眼。于是很多资金充足的实验室为了保险起见都选择购买了几家最有名气公司的产品，如ABI的7500和7900，罗氏的Lightcycler2.0，Lightcycler480，Eppendorf mastercycler等产品。但是这些名牌产品因为品牌溢价所以价格都高高在上，另很多经费不是很充足的实验室望而却步。这些产品的性能有大量文章做过比较，在这里就不做过多描述。但是品牌不是唯一，科研工作者更不应该迷信品牌，依靠自己真实的实验体会做的选择才是最准确的。下面综合大量的科研人员的实验体会着重向广大科研工作者介绍一些现在市场上高性价比的几款荧光定量PCR仪。

进口篇

1.        Bio-rad

伯乐在国际上属于中端品牌，在中国最初由于电泳系统被广大科研用户所熟知。伯乐的PCR产品线也比较丰富，收购MJ Rearch之后进一步丰富的PCR的产品线。目前伯乐的IQ5荧光定量PCR仪是一款性价比较高的产品，采用96孔Peltier半导体加热，5通道，12bit CCD检测，而且还带有梯度功能。售价也是远远低于ABI7500，所以这两年来用户较多。但有用户反应说这款仪器的检测灵敏度不太好，另外维修率比较高。实际情况大家还可以通过多咨询老用户进一步了解

2.        BIONEER

国内的用户可能听说过这个品牌的不多，只有早期较多使用进口引物的实验室和研究所或留美学者知道这个品牌。Bioneer最初是以高通量的引物合成起家，引物合成在国际上有很高的知名度。后经10几年发展产品线已覆盖整个分子生物学领域，目前同takara的产品线几乎完全一样。BIONEER的普通梯度PCR仪的价格同其他进口设备的价位比较，很具有杀伤力。这家公司也于2006年底推出了荧光定量PCR仪ExicyclerTM 96，产品技术参数也是采用96孔Peltier半导体加热，5通道，16bit CCD检测，也带有梯度功能。这款产品的参数几乎与Bio-rad的IQ5一模一样，而且检测的CCD像素还要高于IQ5, 理论上检测灵敏度应该更好一些。产品价格据说还要比Bio-rad更低一些，号称是性价比最高的荧光定量PCR仪。但是缺点是现在国内用户很少，了解起来不太容易。有兴趣的客户可以联系他们的子公司柏业贸易（上海）有限公司进行试用，新公司都注重是售后服务，大家毕竟要亲身体会到才是最可靠的。

3.        Stratagene

Stratagene现在为安捷司的子公司，也是专著于分子生物学研究产品开发的公司。在国内它的试剂产品卖的不多，处于推广阶段。Stratagene的荧光定量PCR产品Mx3005P同以上两种产品技术参数也差不多96孔Peltier半导体加热，5通道，PMT检测器，但是没有梯度功能，用户不能在这台仪器上优化反应条件。另外有客户反应该仪器做工较粗糙，噪音比较大，而且边缘的孔做实验的效果不太好，但是只要使用热模块中间的孔做实验效果还是不错的。这样的问题问题在ABI7500仪器上也同样存在，但是Stratagene的价格要实惠很多。

国产篇

现在国内的生命科学研究市场基本上是被国外的公司所垄断，国内的厂商只能靠底价来占领一小部分市场，平心而论国内的厂商在技术和工艺上面确实和国外厂商有一定的差距。但这也是由于我国的基础研究水平和制造工艺起步都比较晚的客观原因造成的，再加上国内厂商的经营和财力等问题，所能提供的员工待遇与公司也有一定的差距，所能吸引的人才也受到。有国内生产仪器公司的老总就直言不讳的提出，他们暂时还没有能力请国际一流的设计师和改进生产工艺的能力，只能是靠低价来占领一部分市场待原始积累达到一定程度之后再改进产品争取进入更高一个级别的市场中。当然我们也看到国内的厂商也是在不断的进步之中，随着越来越多的一流人才加入到生物技术领域中，相信生物技术市场也会像当年的家电市场一样慢慢的将国外厂商的垄断局面打破并夺回大部分的市场。下面就介绍几款国内厂商生产的荧光定量PCR仪

1.        杭州博日（Bioer）

提到国产PCR仪就不得不提到杭州博日公司，和Takara一样属于日本在华投资较早的生物技术企业。博日公司一度在低端PCR仪领域占领了很大的市场，虽然近年来随着其他国产品牌的冲击，市场占有率已经严重下降，但是总体上还是处于领先的水平。该公司的荧光定量PCR仪产品FQD-48A是4通道，48孔Peltier半导体加热。相对于前面介绍的几款进口产品相比较样品通量和检测光路均较低，但也可以满足实验样本不是很大的用户使用。而且博日产品的价格比前面介绍的几款进口产品的价格也要更低一些。

2.        西安天隆

西安天隆的荧光定量PCR产品TL988是一款真正的依靠国内自主研发而成多通道荧光定量PCR仪，TL988设计比较灵活，可选36孔与96孔加热模块，但通道和多通道几种组合模式。最多可达5通道，但不足之处是还是使用单激发虑光片，激发光特异性不好，导致检测灵敏度较低。据了解在国内的医疗系统还是一些用户，科研系统的用户比较少。

3.        上海宏石

上海宏石生产的SLAN®实时荧光定量PCR是一款在国内市场反应不错的仪器，在国产荧光定量PCR仪的性能比较中是属于检测灵敏度和重复性最受认可的仪器。不足之处是光路通道和样品孔数量比较小。最大只有三通道和48个样品孔的机型，不能满足较大样品量的客户需求。目前在医院临床检验科中是国产荧光定量PCR仪销量最高的仪器，在科研系统用户比较少。

小节： 目前大部分的市场份额还是被国外厂商所占领，尤其是在科研, CDC和血站等系统，国外厂商更是处于垄断地位。但是目前国内的厂商也在医院临床检验系统占有一席之地。科研人员和医疗工作者还是要根据自己的实际需求和亲身体会做出选择，“选对的，不选贵的”这句名言用于购买荧光定量PCR仪也同样适用。