动物免疫学讲义

讲义

绪论

第一节 免疫学基本概念

现代免疫学认为：免疫(immunity)是指机体接触“免疫反应性异物”或“异己成分”的一种特异性生理反应，其作用是识别和排除免疫反应性异物，以此维持机体的生理平衡。这些维持机体稳定的反应，通常对机体有利，但在某些条件下也可以是有害的。所以免疫的现代概念可以概括地指机体识别和排除免疫反应性异物的功能，即机体区分自身与异己的功能。

免疫学：是研究免疫反应性异物，免疫应答规律以及免疫应答产物与抗原反应的理论和技术的一门生物科学。

    一、免疫的基本特性

   （一）识别自身和非自身

    机体免疫系统具有精确的识别机能，表现在不仅能识别异种蛋白质，甚至对同一种动物的不同个体的组织和细胞也能识别，这是免疫应答的基础。识别功能对保证机体的健康是十分重要的。识别功能的降低就会延缓免疫应答的启动，

从而降低或丧失对传染或肿瘤的防御能力。

（二）特异性

机体免疫系统不仅能识别自身和非自身，还能识别非自身物质间的微小差异，甚至某些同分异构体，如氨基苯磺酸的陨酸基位置(邻位、对位、间位)、酒石酸的旋光性(左旋、右旋、消旋)等均能予以识别。这是免疫系统对抗原物质持异性免疫应答的基础，这也奠定了免疫学技术在生物活性物质的定性、定量和定位中的不可替代的地位。

（三）多样性

 免疫系统具有庞大的T细胞和B细胞库。可与外界多种多样的抗原物质发生免疫应答。而且，这种免疫应答精确、复杂、多样。

（四）免疫记忆

免疫活性细胞具有保存抗原信息的功能，在初次接触某一抗原产生免疫应答后，形成特异性记忆的免疫活性细胞，在再次接触相同抗原时，这些免疫活性细胞迅速大量扩增而发生再次应答，再次应答出现快，反应强。

（五）转移性

特异性免疫可通过免疫话性细胞或抗体转移给正常个体，使受者对原始抗原发生特异反应。免疫转移性为一些传染病的紧急预防和治疗、肿瘤的免疫学治疗莫定了基础。

（六）耐受性

抗原可诱导产生特异的无应答性，对原先接触的抗原不产生免疫应答，而与无关的抗原仍能产生正常的免疫应答，这就是免疫耐受性。免疫耐受性是免疫系统识别“自身”和“非自身”物质建立的基础，在调节机体免疫应答中也发挥着重要的作用。

二、免疫基本功能

体现在对免疫反应性异物的识别相清除。可归纳为三个功能：

（一）免疫防御

是指宿主抵御、清除入侵病原微生物的免疫保护作用。这是免疫系统最基本的功能，即通常所指的抗感染免疫，也是在科学上免疫学所获依据较充分、理论阐释较清楚的方面。免疫防御应答异常增高可导致超敏反应；应答低或缺失，则可发生免疫缺陷病。

（二）免疫监视

 指机体识别和清除突变细胞，防止发生肿瘤。

生物体最危险的“敌人”来自身体内部。正常细胞在化学、物理和病毒等致癌因素的诱导下可以变为肿瘤细胞。免疫的第二个重要功能就是严密监视这些肿瘤细胞的出现，一旦出现就能立即予以识别，井调动免疫系统在其尚未形成肿瘤组织之前将其歼灭。免疫功能降低或抑制就会使肿瘤细胞大量增殖，从而出现临床的肿瘤。肾移植患者应用免疫抑制疗法，以及老龄动物因免疫功能低下，癌症的发病率均较高。因此，保持动物健康，加强免疫功能是预防肿瘤的有效方法。

（三）免疫自稳

 指机体清除衰老或损伤的细胞，进行自身调节，维持体内生理平衡的功能。

 在新陈代谢中，每天都有大量的细胞衰老死亡，这些失去了功能的细胞积累在体内，必然会影响正常细胞的话动。免疫系统的第三个重要功能就是消除这些废物，保持机体正常细胞的生理活动，使机体的各部门都能精确地执行正常功能，充满活力。当细胞衰老死亡时，可刺激机体产生自身抗体，以便及时清除这些细胞。

第二节  免疫学的发展简史

免疫学是人类在与传染病斗争过程中发展起来的。从中国人接种“人痘”预防天花的正式记载算起，到其后的Jenner接种牛痘苗预防天花，直至今日，免疫学的发展已有三个半世纪。前后走过经验免疫学时期、科学免疫学时期、现代免疫学时期。在后两个时期中，随着科学发展，免疫学经历了四个迅速发展阶段，即：①1876年后，多种病原菌被发现，用已灭活及减毒的病原成疫苗，预防多种传染病，从而疫苗得以广泛发展和使用；②1900年前后，抗原(Ag)与抗体(Ab)的发现，揭示出“抗原诱导特异抗体产生”这一免疫学的根本问题，促进了免疫化学的发展及Ab的临床应用；③1957年后，细胞免疫学的兴起，人类理解到特异免疫是T及B淋巴细胞对抗原刺激所进行的主动免疫应答过程的结果，理解到细胞免疫和体液免疫的不同效应与协同功能；④1977年后分子免疫学的发展，得以从基因活化的分子水平，理解抗原刺激与淋巴细胞应答类型的内在联系与机制。当今，免疫学正进入第五个迅速发展阶段，即后基因组时代，从功能基因入手，研究免疫应答与耐受的分子机制，及新型疫苗的设计研制。现代免疫学已超越狭义“免疫”的范围，以分子、细胞、器官及整体调节为基础，发展起来的现代免疫学，研究生命中的生、老、病、死等基本问题，是生命科学中的前沿学科之一，推动着医学和生命科学的全面发展。

    一、经验免疫学时期

免疫学是在人类与传染病的斗争过程中发展起来的。人们在长期实践中看到有很多流行性疾病，如麻疹、天花、腮腺炎、百日咳等，一旦患病康复后很少二次感染。公元16世纪，中国人种人痘。

二、科学免疫时期

19世纪中叶开始，病原体被发现，微生物学的发展推动了抗感染免疫的发展。19世纪未，抗体的发现导致了20世纪初对抗原的研究，以实验生物学为基础，研究宿主在受抗原刺激后所致的免疫应答，从而使免疫学发展至科学免疫学时期，成为一门的学科。在此期间，对抗原与抗体特性的详细研究，创立了免疫化学，发展了体液免疫；以无毒或减毒的病原成的菌苗得以广泛使用；在抗体的应用中，发现了免疫应答所致的超敏反应性疾病，认识到适宜的免疫应答有免疫防卫作用，不适宜的免疫应答则有致病作用。

（一）病原菌的发现与疫苗使用的推广

（二）抗体的发现、应用及细胞免疫的研究

 1、抗体的发现

 19世纪80年代后期，在研究病原菌的过程中，发现白喉杆菌经其分泌的白喉外毒素致病，进而发现再感染者的血清中有“杀菌素”，此为最早发现的抗体。

 2、抗原的结构与抗原特异性

 20世纪初开始，Landsteiner将芳香族有机化学分子偶联到蛋白质载体上，免疫动物，研究芳香族分子的结构与活性基团的部位与所产生抗体的特异性的关系，认识到决定抗原特异性的是很小的分子，它们的结构不同，使其免疫反应性不同。据此，Landsteiner发现人红细胞表面的糖蛋白中，其末端寡糖特点决定了它的免疫反应性，从而发现了ABO血型，避免了输血导致严重超敏反应的问题。

3、抗体是免疫球蛋白

20世纪30年代，Tiselius和Kabat用电泳鉴定，证明Ab是γ—球蛋白。

4、抗体是四肽链结构

1959年，Poner和Edelman分别对AL结构进行了研究，证明它是由四肢链组成，即二硫键连接在一起。

5、免疫耐受的发现

1945年，Owen观察到异卵胎盘融合双生的小牛，其体内并存有两种血型不同的红细胞，互不排斥。

6、Burnet学说及其对免疫学发展的推动作用

7、细胞免疫学的发展

8、固有免疫与抗原提呈

9、超敏反应和自身免疫病

三、现代免疫学时期

细胞免疫学的发展明确了T细胞及B细胞经表面受体识别抗原分子，受体与抗原结合的信号由细胞表面传至细胞核内，导致基因活化，使细胞进行克隆扩增，并分化为效应细胞，表达功能。

第一章  免疫系统

免疫系统：是指动物机体内参与对抗原的免疫应答，执行免疫功能的一系列器官、细胞和分子。动物的免疫系统是随动物的进化而逐步发展和完善的。无脊椎动物没有免疫系统，仅具有天然防御功能的吞噬细胞及体液中的凝集素、溶菌酶和抗菌因子等。低等脊椎动物开始形成淋巴样组织，随着脊椎动物的进化，免疫系统形成并不断完善，到哺乳类动物，免疫系统最完善。

第一节  免疫器官

免疫器官包括中枢免疫器官和外周免疫器官。

一、中枢免疫器官

中枢免疫器官是源生免疫细胞或诱导淋巴细胞成熟的器官，包括骨髓、胸腺和禽类的法氏囊。

1、骨髓：主要是四肢长骨骨髓，是源生淋巴干细胞、自然杀伤细胞、单核/吞噬细胞、红细胞、粒细胞等免疫细胞的器官。哺乳类动物的骨髓还直接诱导淋巴干细胞成熟为B细胞，并且骨髓中的B细胞也可直接与抗原进行免疫应答，产生特异抗体，故骨髓是非常重要的免疫器官。

2、胸腺：畜禽胸腺位于胸腔前部纵膈内，向颈部伸延。幼畜、幼禽胸腺随年龄增大而增长，到性成熟期为最大，以后逐渐退化萎缩。长期应激，严重营养不良，长期患病，都会导致胸腺迅速萎缩。

胸腺在免疫中的重要作用是诱导淋巴干细胞成熟为T细胞。骨髓的淋巴干细胞经血流到达胸腺，在胸腺素等及细胞因子诱导下分化增殖，大部分凋亡，少部分成熟为胸腺诱导细胞，简称为T细胞。T细胞随淋巴和血流迁移到外周免疫器官，参与细胞免疫应答，也辅助和调节体液免疫应答。

3、法氏囊：位于鸡法囊腔背侧。性成熟前长到最大，以后逐渐退化萎缩，消失。法氏囊是禽类持有的淋巴器官。骨髓的淋巴干细胞到达法氏囊被诱导成熟为囊诱导细胞，也简称B细胞，其特性和免疫作用与哺乳动物骨髓中成熟的B细胞相同。B细胞经淋巴和血液循环移到外周免疫器官，参与体掖免疫应答。

二、外周免疫器官

外周免疫器官是各种免疫细胞分布，并与抗原进行免疫应答的器官，包括淋巴结、脾脏、黏膜免疫系统和鸡的哈德腺等。

1、淋巴结：哺乳类动物机体有许多淋巴结分布于全身各部位淋巴管的径路上，定居着大量巨噬细胞、T细胞和B细胞，其中T细胞占75％，B细胞25％。禽类只有水禽在颈胸和腰共有两对淋巴结，其余禽类无淋巴结，仅有分散的淋巴组织。淋巴结和淋巴组织起过滤捕捉淋巴液中的抗原，并在其中进行免疫应答的作用。

2、脾脏：是造血、贮血、滤血和淋巴细胞分布及进行免疫应答的器官。脾脏由红髓和白髓两部分组成，红髓中分布网状细胞、巨噬细胞、浆细胞和各种血细胞；白髓包括淋巴鞘和脾小结，淋巴鞘主要聚居T细胞，脾小结内是B细胞，受抗原刺激后也形成生发中心。在脾脏中B细胞占65％，血流中的大部分抗原在脾脏中被巨噬细胞吞噬、加工，传递给T细胞，辅助B细胞进行体液免疫应答。

3、黏膜免疫系统：包括肠黏膜、Peyers淋巴集结、肠系膜淋巴结、阑尾、气管黏膜、腮腺、泪腺、泌尿生殖道黏膜和乳腺管黏膜等的淋巴组织，共同组成一个数膜免疫应答网络，故称为黏膜免疫系统。

4、禽哈德腺：鸡的哈德腺又称瞬膜腺，位于眼窝中腹部，眼球后的，它除分泌眼泪，润滑、保护瞬膜，也分布有T细胞、B细胞，是对抗原进行免疫应答的部位，鸡新城疫Ⅱ系弱毒疫苗等滴眼就主要在哈德氏腺进行免疫应答，产生抗体。

第二节  免疫细胞

机体内参与免疫的细胞统称为免疫细胞。免疫细胞分类淋巴细胞和辅助细胞两大类，具体为淋巴细胞，单核/吞噬细胞，抗原递呈细胞，粒细胞，肥大细胞和红细胞免疫系统等。

免疫活性细胞：在淋巴细胞中，受抗原物质刺激后能分化增殖，产生特异性免疫应答的细胞，称为免疫活性细胞，也称为抗原特异性淋巴细胞，主要是指T细胞和B细胞，在免疫应答过程中起核心作用。除此之外，淋巴细胞还包括自然杀伤细胞、杀伤细胞等。

单核吞噬细胞和树突状细胞，在免疫应答过程中起重要的辅佐作用，故称免疫辅佐细胞，具有捕获和处理抗原以及能把抗原递呈给免疫活性细胞的功能。

一、免疫活性细胞  

1、T细胞

（1）T细胞的发育及分布  畜禽机体T细胞来源于骨髓多能干细胞。干细胞从血流进入胸腺后，在胸腺素、白细胞介素7(IL-7)等诱导下经过10-30d分化、增殖，98％凋亡，2％左右成熟为T细胞。在胸腺成熟后的T细胞经血流转移，主要分布于淋巴结和脾脏的胸腺依赖区。

   （2）成熟T细胞的重要表面受体和表面抗原

① T细胞抗原受体

② 丝裂原受体

③ T细胞表面抗原：不同分化增殖时期的T细胞，细胞膜表面出现的标志性蛋白抗原，称为表面抗原亦称CD分化抗原。

T细胞膜上重要的表面抗原有CD2、CD3、CD4、CD8等。

2、B细胞

（1）B细胞的发育及分布  哺乳动物的B细胞是由骨髓内的淋巴干细胞直接在骨髓内成熟为B细胞的。禽类的B细胞则由骨髓的淋巴干细胞到达法氏囊内，被诱导成熟为B细胞。B细胞成熟后，定居于外周免疫器官中相应部位。

（2）B细胞的重要受体  

①抗原受体 B细胞的抗原受体是B细胞发育成熟过程中自然表达在膜表面，能特异识别、结合抗原的免疫球蛋白分子。

②Fc受体  B细胞膜上另有一些糖蛋白，能与免疫球蛋白IgG的Fc段结合，称为Fc受体。

③C3b受体  B淋巴细胞膜上还有一些蛋白分子，可与补体C3b的蛋白分子结合，称为C3b受体。

B细胞的亚群及功能  B细胞的亚群尚不确定，目前，按其成熟程度和细胞表面是否有CD5表面抗原，分为B1、B2两个亚群。

3、自然杀伤细胞：是直接在骨髓中由淋巴干细胞分化成熟的—种大颗粒淋巴细胞，能非特异地杀伤某些病毒感染细胞和某些肿瘤细胞，故称为自然杀伤细胞。

（1）NK细胞的膜表面标志  NK细胞膜上不具有抗原受体，具有编号为CDl6的蛋白分子，CDl6是IgG Fc的受体。

（2）NK细胞的杀伤作用  NK细胞可以杀伤某些病毒感染的细胞，但不杀伤未感染的细胞；可杀伤某些肿瘤细胞，尤其对造血细胞来源的肿瘤细胞敏感。

二、单核巨噬细胞系统

单核巨噬细胞系统包括骨髓内的前单核细胞、外周血中的单核细胞和组织内的巨噬细胞。它们是机体重要的免疫细胞，具有抗感染、抗肿瘤、参与免疫应答和免疫调节等多种生物学功能。

（一）巨噬细胞来源、分布：

 单核巨噬细胞由骨髓干细胞衍生而来。骨髓中的髓样干细胞受骨髓微环境的作用发育成前单核细胞。

（二）巨噬细胞表面标志及分泌产物

在单核---巨噬细胞的膜表面有许多功能不同的受体分子，如Fc受体和补体分子的受体（CR）。这两种受体通过与IgG和补体结合，能促进巨噬细胞的活化和吞噬功能。

单核—巨噬细胞具有多方面的生物功能，主要可以概括为以下几个方面：①非特异免疫防御。②清除外来细胞。③非特异免疫监视。④递呈抗原。⑤分泌介质IL-1、干扰素、补体（C1、C2、C3、C4、C5、B因子）等。

三、树突状细胞

树突状细胞是定居于体内不同部位的由不同于细胞分化而来的一类专职的抗原提呈细胞，也是体内抗原提呈作用最强的一类细胞。

四、其他免疫细胞

（一）自然杀伤细胞（Natural killer cell，NKC）

NK细胞有以下重要作用：

1、抗肿瘤

2、抗病毒

3、免疫调节作用

（二）杀伤细胞

（三）粒细胞系统：嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞等

（四）红细胞

第三节  免疫相关分子

参与免疫应答的相关分子包括抗体、补体及细胞因子等。

一、抗体：是机体在抗原物质刺激下，产生的一类具有与该抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。它主要存在于动物的血液、淋巴液、黏膜分泌物和组织液中，是构成机体体液免疫的主要物质。

二、补体：是正常人和动物血清中含有的非特异性杀菌物质。在早期研究中发现，它可促进特异性抗体溶解相应的细菌和红细胞，故称之为补体。

补体并不是一种单一物质，而是一组具有酶原活性的血清球蛋白，由多种成分组成。

三、细胞因子：在机体免疫应答过程中，除上述抗体、补体免疫相关分子发挥作用外，还有细胞因子等参与。

细胞因子：是指由免疫细胞和某些非免疫细胞合成和分泌的一类高活性多功能蛋白质多肽分子。细胞因子多属小分子多肽或糖蛋白，作为细胞间信号传递分子，主要介导和调节免疫应答及炎症反应，刺激造血功能，并参与组织修复等。

细胞因子的来源分为两大类：一类是由免疫细胞即单核巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、粒细胞和肥大细胞等产生的，另一类是由非免疫细胞即基质类细胞如血管内皮细胞、表皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞和小胶质细胞等分泌的。

TH细胞是产生细胞因子的重要细胞，根据它分泌细胞因子不同，把TH细胞分为TH0细胞、TH1细胞、TH2细胞3个亚型。

细胞因子的共同特性：理化特性为糖蛋白，分泌特点是多细胞来源、短暂的自限性分泌、自分泌和旁分泌特点，生物学作用特性包括具有激素样活性作用、细胞因子通过细胞因子受体发挥效应、生物学作用的多效性、生物学作用的冗余性、生物学作用的协同性和生物学作用的拮抗性；细胞因子的网络性即细胞因子间可相互诱生、细胞因子受体表达的调节、细胞因子间生物学活性的相互影响。

细胞因子的主要生物学活性：参与免疫应答与免疫调节包括对肿瘤和炎症的作用，对体液免疫和细胞免疫的调节、刺激造血功能、参与神经-内分泌-免疫网络。

第二章  抗原

第一节  抗原的概念

    抗原（antigen，Ag）是指凡能刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与之结合发生特异性免疫反应的物质。抗原具有两种基本特性，即免疫原性和反应原性，这两种基本特性统称为抗原性（antigenicity）。

免疫原性(immunogenicity)：是指抗原能刺激机体的免疫系统产生抗体或致敏淋巴细胞的特性。具有这种特性的物质称为免疫原（immunogen）。

反应原性（reactiongenictity）是指抗原能与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的特性。

免疫原性是指引起机体免疫应答的特性，而反应原性是指抗原与免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）结合反应的特性。

第二节  构成抗原的条件

    一、异源性

指某抗原的理化性质与其所刺激机体的物质间的差异程度。在正常情况下，机体的自身物质或细胞不能刺激自体的免疫系统发生免疫应答，因此一般的抗原都必须是异种的或异体的物质。

对免疫功物而言，完全抗原应是非自身的物质，称为异物。亲缘关系愈远的物质，免疫原性愈强。这是因为机体在胚胎发育时期形成各种淋巴细胞，凡与自身组织成分或外来抗原接触过的淋巴细胞，在机体出生后正常情况下都不起免疫应答作用，称为“天然免疫耐受”。

机体出生后仅存在与非自身组织异物的抗原起反应的淋巴细胞，故在机体正常情况下，自身组织都不成抗原。但是，自身组织若受烧伤、电离辐射或感染，结构和成分发生改变后，便成了抗原，这种抗原称为自身抗原。一些产生较迟的组织蛋白，如眼球晶体蛋白、精子蛋白和甲状腺蛋白等，机体内具有与之反应的淋巴细胞，但因上述组织细胞在正常情况下易使周围的淋巴细胞凋亡，使这些蛋白免受免疫应答。—但因外伤或感染等原因，组织细胞受破坏，接触到淋巴细胞，便可引起免疫应答，这类抗原称为“隐蔽抗原”。

二、大分子物质

抗原物质要有一定的分子质量，分子质量小于5000道尔顿的物质，抗原性较弱或无免疫原性；分子质量大于10000道尔顿的物质，有良好的免疫原性，一般分子量越大，抗原性越强。在有机物中蛋白质的分子量最高，所以它的抗原性最强。如果蛋白质被消化成眎、胨或氨基酸后，分子变小便失去免疫原性。

三、化学组成，结构复杂

免疫原性好的抗原除了分子量大以外，还要有复杂的化学组成和分子结构。化学组成和结构越复杂的抗原，免疫原性越强。凡含有苯环氨基酸或杂环氨基酸并结合有糖的蛋白质，免疫原性好。例如，胰岛索分子量虽然只有5734道尔顿，但其组成成分和结构较复杂，乃是一种良好的抗原。明胶蛋白虽然分子量高达10万道尔顿，因其化学组成主要是直链氨基酸，稳定性差，在体内容易被降解，所以免疫原性很弱。单纯的脂类、碳水化合物和核酸是化学组成和结构较简单的聚合物，所以无免疫原性。当它们与蛋白质结合成脂蛋白、糖蛋白、核蛋白才具有免疫原性。

四、物理状态

抗原的物理状态对免疫原性具有很重要的影响。一般球状分子蛋白质的抗原性较直链分子蛋白质强，聚合状态的蛋白质较单体状态的蛋白质抗原性强。一些免疫原性弱的可溶性抗原，但经过超速离心，呈非聚集状态时则不能诱导免疫反应。许多抗原溶于生理盐水中给动物注射，则显示出弱免疫原性，不能引起动物的免疫反应，若加入福氏佐剂或吸附在氢氧化铝等大分子颗粒上，常可增强其免疫原性。

五、适当的进入途径

抗原分子只有完整的进入免疫活性细胞所在的场所，如脾、淋巴结和血液等处，才能刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞。如蛋白质若在未进入这些场所之前，在消化道内就分解成小分子的氨基酸或短肽链时，由于氨基酸的结构在各种生物体内皆相同，则失去异物的特性，便没有抗原性。

第三节  抗原决定簇

一、抗原特异性和决定簇

1、抗原的特异性

抗原的特异性是指抗原刺激机体产生免疫应答及其与应答产物发生反应所显示的专一性，即某一特定抗原只能刺激机体产生特异性的抗体或致敏淋巴细胞，且仅能与该抗体或对该抗原应答的淋巴细胞有特异性结合。抗原的这种特性是由抗原物质表面的特殊化学基团的排列、组成、空间分布、立体构型和旋光性等所决定，而决定这些的即是存在于抗原分子中的抗原表位。

2、抗原表位

抗原表位即抗原决定簇，即是由暴露在抗原分子表面具有特殊立体构型和免疫活性的化学基团决定的，这些基团称为抗原表位。抗原的特异性取决于抗原表位，它对于免疫功能的研究及人工合成疫苗都极为重要。

3、抗原的免疫优势

尽管所有具有免疫原性的抗原都能诱发免疫应答，但是不同的免疫原分子同时注射给宿主，诱发的免疫应答明差别的。有的免疫原能诱发产生高效价的抗体，有的产生低效价的抗体。同一种免疫原分子上有许多抗原决定簇，它们诱发免疫应答的能力也是不同的。有的决定簇能诱导产生高效价的抗体，称为免疫优势决定簇。还有的决定簇不能诱导产生抗体，这种无效力的决定簇称为免疫静止决定簇。改变决定簇内某一单个的氨基酸残基，就可能引起决定簇免疫优势的变化。

二、抗原决定簇的组成和性质

抗原决定簇是由一定数量的特异物质构成。在天然抗原中构成一个抗原决定簇所必须的条件是蛋白质抗原的每个决定簇是由5—7个氨基酸组成的短肽链，碳水化合物抗原的每个决定簇是由6个六碳糖组成的短糖链；核酸半抗原的每个抗原决定簇约含有6—8个核苷酸。一般而言，抗原决定簇只有暴露在分子的表面才能呈现它的作用。

简单半抗原一般只与一个抗体分子结合，称为单价抗原，大部分天然抗原分子结构复杂，含有多个抗原决定簇，称之为多价抗原。

根据抗原决定簇特异性不同，可将抗原分为单特异性决定簇和多特异性决定簇两类。简单半抗原和非胸腺依赖性抗原为为单特异性决定簇，而绝大部分天然抗原为多特异性决定簇。暴露于分子表面的决定簇，能与免疫活性细胞接触，对激发机体的免疫应答有决定意义，故将这些暴露于抗原大分子表面的决定簇称为功能决定簇(功能价)，而在分子内部的决定簇称为非功能决定簇(非功能价)。单特异性决定簇抗原免疫后，血清中只出现一种特异性抗体，反之，用多特异性决定簇抗原免疫，则血清中可出现多种特异性抗体。天然抗原如各类微生物，一般都是大分子，其表面有多个多种决定簇，每一个决定簇都可以使机体产生一种抗体，因此一种抗血清往往是针对多种抗原决定簇的不同抗体组成的混合物—多克隆抗体。

三、抗原的交叉反应

抗原物质分子表面有几个抗原决定簇即为几价抗原，通常说的多价抗原是指表面多个抗原决定簇。每个抗原决定簇可刺激机体产生一种抗体，因此一种抗血清中往往含有针对该抗原各个决定簇的多种类型的特异性抗体。多价抗原与一个抗体分子结合后，其他的决定簇还可以和另外的相应抗体结合。如果抗原、抗体比例合适的话，就可以形成“网格状”结构的复合物，呈现肉眼可见的凝集反应或沉淀反应。但也有些抗原分子的决定簇较少，甚至少到一个决定簇，这种单价抗原，主要是简单的半抗原，它只能与相应的抗体结合，但不能相互凝集，也不出现可见的沉淀反应。

每种抗原都可以具有数种不同的抗原决定簇，其中有些抗原决定簇为某种抗原分子所有，而有的抗原决定簇是和其他抗原所共有，这种共有的抗原成分称为共同抗原或类属抗原。

不同抗原物质之间有时可出现不同程度的交叉反应，发生交叉反应主要有以下几种形式：

     1、不同物种间存在共同的抗原组成：某些微生物与哺乳动物组织之间存在着共同抗原，可引起交叉反应。存在于人、动物、植物、微生物之间的具有相同抗原性的抗原，称为异嗜抗原。

     2、不同抗原分子存在共同的抗原决定簇：

     3、不同决定簇之间部分构型类似：蛋白质抗原的决定簇通常决定于多肽末端的氨基酸组成，特别是末端氨基酸的羧基对特异性影响最大。如末端氨基酸相似，即可出现交叉反应。而交叉反应的强度又与相似的程度成正比。

第四节  半抗原与载体

    一、半抗原

半抗原是一类不完全半抗原，它只具有反应原性而不具有免疫原性。小分子物质不是免疫原，不能诱导机体产生免疫应答，但是它们与大分子胶体蛋白连接后，就能诱导机体产生免疫应答，并能与相应的抗体结合。这些小分子物质称为半抗原，与半抗原相连接的大分子蛋白称为载体。当青霉素等药物、药理活性肽类、一些激素、cAMP、cGMP等代谢物、嘌呤、嘧啶碱基、核苷、核苷酸等分子质量较小的半抗原与适宜的载体蛋白结合成复合物后，就可各自诱导产生高度特异的抗体。

半抗原可分成两类：

1、复合半抗原：无免疫原性，但具有免疫反应性，在试管中与相应抗体发生特异性结合，并产生肉眼可见的反应，如细菌的荚膜多糖、类脂、脂多糖等。

2、简单半抗原：既无免疫原性，也无免疫反应性，但能与抗体发生肉眼不可见的结合，从而可阻止抗体与相应的完全抗原或复合半抗原间的可见反应。如酒石酸、苯甲酸、抗生素等低分子化合物。

二、半抗原—载体现象

通过动物对已知半抗原载体复合物的反应证明，抗体的特异性虽然依赖于半抗原站定簇，但载体大分子对于抗体反应的性质和量也有影响。载体现象的发现进一步证明，T细胞表面的抗原受体主要和免疫原的载体相互作用，而B细胞表面的抗原受体则和完整抗原的半抗原决定簇相互作用。

任何一个完全抗原均看做是半抗原与载体的复合物。在免疫应答中，T细胞识别载体，B细胞识别半抗原，故细胞免疫应答中载体起重要作用，而体液免疫应答时，也必须通过T细胞来识别载体，从而促进B细胞对半抗原的反应。

第四节  抗原的类型

     根据不同的分类方法，可把抗原分为不同的种类。

     抗原的种类繁多，其分类方法也有多种，主要根据诱导抗体时是否需Th细胞参与，抗原与抗体的亲缘关系，以及抗原是否在抗原提呈细胞内合成进行分类。

    一、根据诱导抗体产生是否需要T细胞分

根据刺激机体产生抗体是否需要T细胞辅助，将抗原分为胸腺依赖性抗原（TD—Ag）和非胸腺依赖性抗原（TI—Ag）。

1、胸腺依赖性抗原：在刺激机体使B细胞分化成浆细胞的过程中需要辅助性T细胞协助，这种抗原称为胸腺依赖性抗原或T细胞依赖性抗原。绝大部分抗原均属此类，如异种红细胞、异种组织、微生物、异种蛋白质及人工复合抗原等。

2、非胸腺依赖性抗原：不需要T细胞协助就能直接刺激B细胞分化成浆细胞的抗原称为非胸腺依赖性抗原。如大肠杆菌脂多糖（LPS）、肺炎球菌荚膜多糖（SS）、聚合鞭毛素（POL）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等。此类抗原的特点是由同一构成单位重复排列而成。

二、根据抗原物质的性质分

根据抗原物质是天然的生物物质还是人工合成物质要将抗原分为天然抗原、人工抗原和合成抗原。

1、天然抗原：自然界中天然存在的来自于动物、植物和微生物的抗原物质。如微生物及其毒素、寄生虫、动物血清、各种血细胞以及植物花粉等均为天然抗原。天然抗原有的呈颗粒状，如血细胞、细菌等；有的为可溶性，如血清蛋白、细菌毒素等。

2、人工抗原：经过人工化学改造的天然抗原即为人工抗原。制备人工抗原主要是为了研究了解免疫原性的化学基础，因此将高度复杂的天然抗原用已知的化学基团置换，这种方法可以为免疫反应的特异性本质提供很多重要的信息。

3、合成抗原：是指用化学方法将某些已知氨基酸按一定顺序聚合成大分子多肽，使其具有抗原性。可以使用一种氨基酸，也可以使用多种氨基酸构成多肽，这种合成肽可以是直接的，也可以是带有侧链的。合成抗原一方面可用于抗原结构、抗原特异性等免疫理论的研究，另一方面合成肽疫苗可能提供更为优秀的无副作用的生物制品。

三、根据抗原的来源分

根据抗原的来源不同，可将抗原分为异种抗原、同种抗原、自身抗原、异嗜性抗原。

1、异种抗原：来自与被免疫动物不同种属生物的抗原物质，如各种疫苗、异种红细胞、异种蛋白等。大部分抗原均为异种抗原。

2、同种抗原：来自与被免疫动物同种属动物的抗原，如血型抗原、组织相容性抗原等。

3、自身抗原：被免疫动物的自身组织在某种特定条件下所形成的抗原。

4、异嗜性抗原：是一类与种族特异性无关的，存在于人、动物、植物、微生物之间的性质相同的抗原。这一抗原首先由Forssman发现，故又称Forssman抗原。

四、根据免疫原性分

根据抗原的性质可将抗原分为完全抗原和不完全抗原（半抗原）。

                  单纯蛋白质

       完全抗原   蛋白质类脂复合物    免疫原性+

                                      反应原性+

                  蛋白质多糖复合物

抗原                        多糖  免疫原性-

                复合半抗原  类脂

                            核酸  反应原性+

       半抗原

                            酒石酸   免疫原性-

                简单半抗原

                            苯甲酸   反应原性-

                 图示：抗原根据其性质的分类

1、完全抗原：既具有免疫原性，又具有反应原性的物质称为完全抗原。如大多数的异种蛋白都是完全抗原。病原微生物，如细菌及其毒素、病毒、立克次氏体、螺旋体、原虫等也都是完全抗原，而且是抗原性很强的抗原。

2、不完全抗原：仅有反应原性而缺乏免疫原性或免疫原性很不完善的物质，称为不完全抗原或半抗原。如大多数的多糖、类脂以及青霉素、磺胺等药物。

五、根据化学组成分

天然抗原种类繁多，有数百万种之多，但就其化学性质来说，主要有以下几类：

根据抗原存在于菌体的部位不同，分为表面抗原和深部抗原。

1、表面抗原：包围在细菌细胞壁外面的抗原称为表面抗原。随细菌的种类和结构不同，可有不同的名称。例如，肺炎链球菌的表面抗原称为荚膜抗原；大肠杆菌和痢疾杆菌的表面抗原称为包膜抗原或K抗原；伤寒杆菌的表面抗原称为Vi抗原。

2、深部抗原：细菌的内部结构如胞浆膜和核蛋白质等均具有抗原性，称为深部抗原。深部抗原只有在菌体裂解后，才暴露出来。

七、根据临床应用分

根据参与免疫学诊断方法不同或免疫学防治的作用又可以把抗原分为凝集原、沉淀原、病毒中和抗原、免疫保护性抗原、凝血素抗原。

1、凝集原：参与凝集反应的抗原称为凝集原。凝集原又可分为平板凝集抗原、试管凝集抗原、SPA协同凝集抗原等。凝集原为颗粒抗原或吸附可溶性抗原的颗粒。

2、沉淀原：参与沉淀反应的抗原称为沉淀原。沉淀原又可分为环状沉淀反应抗原、絮状沉淀反应抗原、琼脂扩散反应抗原等。沉淀原可以是类脂、多糖或蛋白质，为可溶性抗原（细菌培养物滤液、细胞或组织浸出液、血清蛋白等）。

3、病毒中和抗原：存在于病毒中，能刺激机体产生中和抗原的病毒组成成分。它能与相应中和抗体结合，使病毒失去吸附细胞的能力，或抑制病毒侵入，使病毒失去感染力。

4、免疫保护性抗原：存在于微生物中的能刺激机体产生保护性抗体的成分。

5、血凝素抗原：某些病毒的囊膜上有血凝素，如鸡新城疫病毒、流感病毒、减蛋综合征病毒、兔出血症病毒等。血凝素具有抗原性，称为血凝素抗原，能刺激机体产生相应抗体。

六、重要的抗原物质

  （一）细菌抗原：鞭毛抗原、菌体抗原、荚膜抗原、菌毛抗原

  （二）病毒抗原：囊膜抗原、衣壳抗原、可溶性抗原

  （三）毒素抗原

    细菌外毒素经0.3%—0.4%甲醛或其他适当方法（酸处理，39—40℃加热）处理后，毒力减低但仍保持免疫原性，称为类毒素。外毒素分子的毒性基团与抗原决定簇二者是不同的，但在空间排列上是互相靠近的基团。

  （四）寄生虫抗原：寄生虫抗原成分复杂，由多种物质组合而成。在这些抗原成分中，有的是弱抗原，有的是强抗原，后者可以激发宿主的免疫应答，引起体液免疫和细胞免疫。

   寄生虫抗原含有多糖、类脂和蛋白质。电流分析表明有些虫体可以鉴定出25-30种抗原成分。寄生虫组织的总蛋白量变异很大，占干重的20-80%不等。寄生虫的组织蛋白分两大类，即可溶性蛋白和颗粒性蛋白。可溶性蛋白包括酶、激素及可溶性抗原物质。颗粒抗原与细胞膜及细胞内膜结合，与保持虫体外形有一定关系，如胶原蛋白、角蛋白及硬蛋白。所以，寄生虫抗原可以说是最复杂的抗原之一。

  （五）血型抗原：红细胞膜上的同种异型表面抗原称为血型抗原。大多数血型抗原是糖蛋白，由黏多糖和黏蛋白等复合蛋白质构成，其抗原特异性决定于多糖的侧链。血型抗原有两种存在形式，一种是与类脂细胞膜结合的形式，一种是水溶性的分泌形式。大多数血型抗原与细胞膜结合，为细胞膜的组成部分，也有个别血型抗原游离存在于血清或其他体液内，但能被动吸附于红细胞表面。

   七、佐剂

预先注射于机体或与抗原混合后注射能增强抗原免疫原性的物质称为佐剂。传统常用的佐剂有两类。

一、用于疫苗的佐剂

细菌、病毒的灭活疫苗、亚单位疫苗或基因工程亚单位疫苗，它们的免疫原性较差，为提高免疫效果都加一定比例的佐剂。目前，常用的佐剂是氢氧化铝胶和注射用白油(轻质矿物油)。前者，一方面疫苗吸附于铝胶颗粒表面，易被递呈细胞吞噬；另一方面疫苗可在注射部位持久地释放，提高免疫效果。注射用白油与灭活后的细菌或病毒液乳化成油包水剂形，称为油苗。

近几年来，蜂胶也用作疫苗佐剂。蜂胶是蜜蜂采集花粉等经过咀嚼、唾液中酶的作用而制成的物质，含大量氨基酸、有机酸、微量元素、维生素，实验证明是一种安全、有效的疫苗佐剂。

二、用于试验动物制备高免血清的佐剂

为制备蛋白质抗原或病毒抗原的高免血清，常用弗氏不完全佐剂（FIA）和弗氏完全佐剂（FCA）。

FIA是将抗原水溶液，注入机体后，因抗原受油的保护，一方面油滴缓慢分解，抗原持久释放，发挥长期的刺激作用；另一方面石蜡油在注射部位刺激、形成肉芽肿，集中大量巨噬细胞、淋巴细胞，大大促进抗体的产生。

第三章  非特异性免疫

第一节 非特异性免疫的概念

     机体的免疫应答包括非特异性免疫应答和特异性免疫应答。非特异性免疫是动物在进化过程所形成的阻挡病原微生物侵入及杀灭、吞噬病原微生物的免疫，是先天性的，可以遗传的。

    机体经常不断地与病原微生物接触，但并不经常发生传染，这首先是因为机体免疫系统具有识别各种异物，并把它们杀死、降解和排除的非特异性免疫应答所致，这种应答是在种系发育和进化过程中形成的，是与生具来，任何动物皆有的，不需预先的特异刺激，也不是专对某种微生物起作用，故亦称天然抵抗力。这种天然抵抗力是由机体的防御屏障、吞噬细胞的吞噬功能、炎症反应、体液中的补体和干扰素等因素共问作用体现的。

    非特异性免疫应答是特异性免疫应答的基础，发挥作用快，作用范围广，初次与外来异物接触时，即可发生反应，起着第一线的防御功能。以后随着特异性免疫应答的形成，非特异性免疫应答又可与之起协同作用。

第二节     机体非特异性免疫的主要因素

一、防御屏障

（一）外部屏障

健康完整的皮肤和黏膜具有强大的阻挡病原微生物入侵的作用。鼻孔中的鼻毛，呼吸道黏膜表面的粘液和纤毛，都能机械地阻挡并排除微生物。皮肤的汗腺分泌乳酸，使汗液呈酸性(pH值5．2—5．8)，不利于病原菌生长，皮脂腺分泌的不饱和脂肪酸，也有一定的杀灭细菌和真菌的作用。黏膜也能分泌多种杀菌物质，如溶菌酶、粘多糖、胃酸等，都有杀菌作用。但少数病原微生物如羊布氏菌、野兔疫菌和钧端螺旋体等，可突破健康皮肤和黏膜的屏障作用，侵入体内引起传染。

在健康动物的皮肤、黏膜及与外界相通的腔道中，常常寄居着多种微生物，它们之间的相互制约和拮抗作用，可以抑制病原微生物的生长繁殖，阻挡其侵袭。如口腔中的唾液链球菌产生的过氧化氢，能抑制脑膜炎双球菌，肠道中的大肠杆菌产生的大肠菌素和酸性产物，能抑制其他大肠杆菌菌株或近缘细菌，以及金黄色葡萄球菌与白色念珠菌等的生长。

（二）内部屏障

机体对于内部的重要器官，如神经中枢一大脑，免疫中枢一胸腺，以及处于妊娠时期的胎儿等都是重点的防卫对象，通过下述屏障予以保护。

淋巴结内的树状细胞可将侵入的微生物及其他异物捕获固定，继而被吞噬细胞吞噬消毁，阻止它们向深部组织扩散蔓延，淋巴结的这种屏障机能，由于微生物侵入所引起的炎症过程，还可得到加强。

血脑屏障一般认为是由软脑膜、脉络丛、脑毛细血管壁及星状胶质细胞等组成，这些组织结构致密，可以阻止某些病原微生物、毒素、药物等有害物质从血液进入脑组织及脑脊液中，从而保护中枢神经系统不受侵害。如动物发生脑脊髓炎时，病毒经脑外途径侵入机体后，虽能引起病毒血症，但病毒未必能进一步侵入到易感的脑脊髓组织中去；又如小鼠对于流行性乙型脑炎病毒皮下感染致死量病毒的抵抗力，随着年龄的增长而越来越强，如10周龄与l0日龄的小鼠相比较，皮下感染量前者较后者大l000万倍，而脑内注射时，其差别不到l00倍，可能就是因为年龄大的动物，血脑屏障越来越完善的缘故。如果组成血脑屏障的组织发生炎症，或受到强烈的刺激，组织通透性加大，屏障功能减弱，即容易引起中枢神经系统的疾患。

血胎屏障是由母体子宫内膜的基蜕膜和胎儿绒毛膜组成。正常情况下，它不妨碍母子间的小分子物质交换，但可阻止药物、细菌、病毒、毒素等通过血胎屏障，进入胎儿体内，从而保证了胎儿在子宫内的正常发育。但在妊娠早期，血胎屏障发育不全，此时若感染病毒等，则可影响胎儿的发育，造成畸胎甚至死亡。

除上述内部屏障外，还有血胸屏障及血睾屏障等，均起着重要的防卫作用。

二、吞噬作用和炎症反应

（一）吞噬作用

病原微生物及其他异物如果进入血流，便很容易被血循环中游走的或固定于组织中的吞噬细胞所吞噬。这些吞噬细胞分为两类，一为小吞噬细胞，另一为巨噬细胞。

1、吞噬细胞的种类  其中的小吞噬细胞系指中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。嗜中性粒细胞有活跃的游走性，能吞噬进入血流和局部组织的致病性微生物及其他异物，并在细胞内进行消化，在补体、调理素、抗体等体液因素的协同作用下，其吞噬与杀菌作用更为强大。血液的嗜酸性粒细胞，也有一定的吞噬作用，可吞噬免疫复合物及组织胺等物质。

巨噬细胞来源于骨髓干细胞，在骨髓内分化成幼嫩单核细胞，进入血液，即为单核细胞。单核细胞在血流中经1—2天后移行到组织，成为具有强大吞噬力的巨噬细胞，定居于结缔组织及各个脏器，因而有着各种名称，如在疏松结缔组织中的称组织细胞，在腹腔渗出液中游走的单核细胞称巨噬细胞，在脏器中固定的巨噬细胞有：肝脏的星形细胞(即枯否氏细胞，Kupffer,s cell)，骨组织的破骨细胞，骨髓及脾脏的巨噬细胞，肺脏的尘细胞，神经系统的小胶质细胞及其他器官血管的内皮细胞等。因而1972年范弗思（Van Furth）将这些具有高度吞噬活力的表面有抗体受体和补体受体的巨噬细胞，统称为单核—吞噬细胞系统（Mononuclear phagocytic system）或巨噬细胞系统（Macrophage system）。这一细胞系统是真正负责清除异物的巨噬细胞，特别是能吞噬力的细胞统称网状内皮系统，尽管现在仍有人在应用，但由于这一名称未指明吞噬细胞的来源、功能和形态特征，故当前多采用单核—吞噬细胞系统一词，代替网状内皮系统，但它不包括原网状内皮系统中的网状细胞。

2、吞噬细胞的吞噬功能     当病原微生物或其他抗原物质进入体内时，吞噬细胞立即向抗原处集结，并伸出伪足进行吞噬，进入细胞内的细菌、异物等成为吞噬体(Phagosome)，对较小的异物如病毒，则胞浆膜内陷、闭合，将异物颗粒包围，形成一个吞饮泡，上述的吞饮泡及吞噬体，与胞浆内的溶酶体(系含有多种水解酶，如中性蛋白酶、酸性蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶等的亚细胞结构)靠近，并相互融合，将溶酶体(Lysosome)中的各种复杂的酶释放到吞噬体中，发挥酶的消化作用，称为吞噬溶酶体(Phago—1ysosome)或次级溶酶体。此时，细菌被溶解、消化，最后其残渣亦被排出细胞外。大多数化脓性病原菌被吞噬后5～10分钟死亡，30～60分钟消化排出，称为“完全吞噬”(Complete phagocytosis)。有些细菌如结核杆菌、鼻疽杆菌、李氏杆菌、某些沙门氏菌、布氏杆菌等细胞内寄生菌，以及许多病毒，虽可被吞噬，但却不能被消灭，称为“不完全吞噬”(Incomplete phagocytosis)，这种吞噬甚至对微生物起了保护和扩散的作用，因而，不会遭受药物及体液杀菌因素的危害。

另外，吞噬细胞对抗原的吞噬，还起着处理抗原物质的作用，抗原物质被吞噬细胞吞噬、处理后，将抗原决定基携带传递给淋巴细胞，特别是B淋巴细胞，或者是巨噬细胞的RNA与抗原决定基相结合，刺激B淋巴细胞系统产生抗体。

（二）炎症反应

病原微生物一旦突破皮肤或粘膜等屏障组织侵入体内，就会遇到固定的或游走的吞噬细胞的围歼，在病原微生物侵入的局部，就表现为炎症反应，局部血管扩张，血流减慢，中性粒细胞等吞噬细胞就被吸引至病原微生物存在的部位，对其进行吞噬。另外，在炎症区，还积聚着抗体等大量的体液防御因素，细胞死亡崩解后，释放出白细胞素(存在于中性粒细胞中的一种碱性多肽)、吞噬素(存在于中性粒细胞中的一种球蛋白)和溶菌酶(存在于组织液等中的一种低分子的不耐热的碱性蛋白质)等抗感染物质，以及由于发炎部位的糖原酵解作用，加强产生有机酸，特别是乳酸，这些都有利于杀死病原微生物。另外，炎症过程，还能减缓和抑制病原微生物向外扩散。

第三节  补体系统

    补体（complement，C）是存在于正常动物和人血清中的一组不耐热具有酶活性的球蛋白。

补体一词首先由Ehrlich提出，它是广泛存在于哺乳动物、鸟类、两栖类、鱼类等正常动物血清中，具有酶原活性的一组不稳定球蛋白，因为它可以补充抗体的作用，故名补体。这组球蛋白在一般情况下，除C1q外，在体液中均以非活动状态存在，当受“激活剂”作用后，方按一定顺序活化，发挥出一系列的生物活性。

一、补体的组成和性质

补体由9个成分12种血清蛋白质组成，以符号C表示。分别命名为C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8和C9；其中C1q、C1r、C1s四个亚单位组成。C1q分子如折扇状，由一个亚基和6个呈球形的外周亚基组成，每个C1q分子的分子量为40万；C1r由两条肽链组成，分子量18万；C1s为一条肽链，分子量为8.6万；C2分子量为11.7万，C2为两条肽链，分子量为18.5万；C4为三条肽链，分子量为24万；C5为两条肽链，分子量为18万；C6分子量9.5～12.5万；C7分子量为11~12万；C8由三条肽链组成，分子量为15.7万；C9分子量为7.9万。补体的各个成分都是球蛋白，主要是β球蛋白，只有四种不是β球蛋白，即C1s和C9是α球蛋白，C1q和C8是γ球蛋白。补体约占血清蛋白总量的10%，不因免疫而增加。

补体在动物体内的合成部位尚未完全了解，现已证明：C1在胃肠道上皮细胞，C2、4在巨噬细胞，C3、C6、C9在肝脏， C5和C8在脾脏合成，C7的合成部位目前不明了。目前，C1q、C1s、C2-4已能高度纯化，C1r及C3-9仅能部分纯化。

补体的性质很不稳定，如在0~10℃中，活性仅能保存3～4天，冰冻干燥后能较长期保存。许多理化因素，如紫外线照射、机械振荡、酒精、碱、醇、醚、氯仿、胆汁均可破坏补体。补体各成分的稳定性有差异，如C1、C2、C5、C8和C9经56℃30分钟其活性丧失，称为灭活（Inactivation）或灭能，但C3、C4、C6、C7不被56℃30分钟所破坏。

补体没有特异性，能与任何的抗原抗体复合物结合发生反应。近来研究表明，补体系统不仅是机体自身稳定和保护性反应的重要物质，而且也是导致机体免疫损伤的因素之一。

二、补体的激活途径

补体成分在血清里，有的类似酶原，以非活性状态存在，只有被激活后，才表现出生物活性。目前已经确定补体主要有两条激活途径，一为“经典途径”，另一为“旁路途径”。

（一）经典途径(Classtcal pathway)  又称传统途径或C1激活途径。IgG1、IgG2、IgG3及IgM等与抗原结合后，都是通过这个途径而激活补体的。

1．识别单位的活化  当抗原与抗体即E—A结合后，抗体的纹链区发生构型改变，免疫球蛋白由T宇型变为Y字型，使CH2处的补体结合点暴露出来，C1q能识别抗体上的补体结合点，并与之结合。由于C1q的构型发生改变，可澈活C1r和C1s；在Ca2+存活下，形成具有酯酶活性的C。在正常情况下，由Ca2+使补体C 1的三个亚单位聚合成一个大分子的复合物。

2. 激活单位在靶细胞膜上聚合  在Mg2+存在下，C将C4的α链分解成小碎片C 和大碎片C ，无活力的C 游离至液相中，C 可迅速的与细胞膜上的受体相合，未与细胞膜结合的C 则迅速失去结合力，蜕变为无活力的C4bi，C激活C4后再激活C2，它也分解为C和C两个碎片，C和细胞膜上的C 结合，形成有酶活性的C（C3转化本科，Convertase），参与下一步补体的活化反应。尚有一部分未结合的C迅速失去活性，蜕变为C2ai，C无生物活性游离至液相中。

C使C3为小碎片C和大碎片C，C游离至液相中，呈现过敏毒素和趋化因子的作用，C迅速与细胞膜上的C4b和C2a结合成C（C3转化酶），余下未结合的C3b，在血清中可裂解为C3c和C3d。

3. 攻膜单位聚合  C5在C的作用下，裂解为C和C，C游离至液相中，也呈过敏毒素和趋化因子的作用，C除与细胞膜结合外，还与C6、C7结合，形成一个三分子的复合物C（Trimolecular complex），此时细胞膜上出现超微结构的损伤，但没有生理功能的改变，接着一个C3分子（具有磷脂酶活性，phospholipase）与C567结合，6个C8分子与C9连接，则产生一个由10个分子共同组成的分子量高达100万的大分子集团，此时于红细胞膜上出现直径80～100Å的圆形小孔，无数小孔形成后，便可导致靶细胞中血红蛋白和盐类等  激活单位和攻膜单位处于活化状态的补体分子和各分子复合物都是非常不稳定的，

除非与靶细胞膜结合，否则很快蜕变，失去活性。因此，损伤作用只限于被抗体识别的靶细胞，而不能扩散到邻近的正常细胞，只要抗体的识别功能正常，就能保证补体有选择性地有效地攻击靶细胞，而不致损伤正常细胞。由小孔流出，外界的水分进入，整个细胞溶解。

（二）旁路途径(A1ternative pathway)又称替代途径或C3激活途径。研究发现，LPS、酵母多糖、眼镜蛇毒、海猪的IgG和人的IgA、D、E等均可绕过C1、C4、C2，直接激活C3，完成补体C3-9激活的连锁反应，这显著有别于上述的经典途径。

机体内由于有旁路途径激话补体的形式存在，就大大增加了补体系统的作用，扩大了非特异性和特异性免疫之间的连系。另外，还可以说明在传染免疫中，抗体未产生以前，机体即有一定的免疫力，其原因是LPS等激活物通过旁路途径先于经典途径激活补体，杀死细菌，发挥抗传染的功能。

三、补体活化的调节

补体活化后，产生地各种过量活性成分对机体是不利的，因此，补体系统的反应都是在生物反馈的严格控制下进行的，以补体的活化程度，保持补体的平衡。这种调节作用主要来自两个方面，一是补体系统内部的调节作用，另一是存在于血清内的灭活因子的抑制作用。

（一）补体系统内部的调节作用  C4、C3、C5活化后，均暴露出一个不稳定的结合部位，此部位在短期内，若不与细胞膜结合，则立即失去活性。另外，C2的亚单位极易自C及C上解离下来，失去活性，这些均可在一定程度上补体的活化过程。

 （二）补体抑制因子的调节作用  近年来发现，血清中存在多种补体抑制因子，可调节补体反应，主要有：C1脂酶抑制因子能抑制Cl脂酶对C4、C2的酶解作用，补体活化过程。C3b灭活因子可使C3b裂解为抗原性不同的C3c和C3d两个断片，此时C3b即失去活性。此外，还有C4b灭活因子，过敏毒素灭活因子(灭活C3a及C5a)和C8灭活因子等，均以不同的点，来调节补体的反应进程。

   四、补体的生物学作用

   补体是非特异性免疫的重要体液组成部分，主要的生物学作用是非特异地除去体内的抗原一抗体复合物。近些年来，大量的资料说明，补体的作用是多方面的，既参加抗体保护性的免疫应答和自身稳定功能，又可引起免疫病理损伤，在这些过程中，一般是通过补体激活后产生的各种活性物质引起的。

  （一）细胞的免疫溶解作用：补体活化后形成的攻膜复合体（MAC）可以溶解一些微生物、病毒、红细胞和有核细胞，这种作用称为细胞溶解。

  （二）细胞黏附：许多细胞都具有补体成分受体，这些受体称为CR1、CR2等。CR1是其中最重要的受体。嗜中性粒细胞、巨噬细胞、血小板及B细胞都有CR1，该受体结合C3b的能力强，结合C4b的能力弱。覆盖有C3b的颗粒结合到上述细胞的过程称为免疫黏附。

  （三）调理作用：C3b是补体系统中的主要调理素，C4b或C3bi也有调理活性，可起调理作用。

  （四）免疫调节：B细胞具有CR1受体，而T细胞却没有此受体。补体缺失会使抗体应答延迟，抑制抗体的产生，严重影响生发中心的发育和免疫记忆功能，由此推测CR1受体可能与免疫应答的调节有关，能起免疫调节作用。

  （五）炎症反应：补体系统在炎症反应中的主要作用是吸引白细胞到补体激活位点。嗜中性粒细胞与巨噬细胞在吞噬颗粒物质时释放的蛋白水解酶能激活补体C1或C3，从而显著增强炎症发展过程。过敏毒素C3a，C4a与C5a能下肥大细胞和血液中的嗜碱性细胞结合，诱导脱颗粒，释放组织胺和其他活性介质，以加强炎症反应。

（六）病毒中和：补体系统对病毒的感染性具有中和作用。一些病毒如反转录病毒、新城疫病毒等在没有抗体存在时，可活化补体旁路或经典途径。

（七）免疫复合物的溶解：

第四节  干扰素

    自1957年Isaacs等发现干扰索(Interferon，IFN)以来，迄今已有30多年的历史，国内外对其理化性质、作用特点及应用等进行了大量的研究工作，并取得了明显地进展。干扰素系生物细胞受干扰素诱生剂(如某些病毒、纫菌、po1yI：C、polyA：U、LPS、PHA及双股RNA等)作用后，产生的一类高活性多功能蛋白质，这类诱生蛋白质释放出来以后，除可使其他同种生物细胞获得抗病毒和抗肿瘤等多方面的能力外，对免疫活性细胞的功能还具有调节作用。

一、干扰素的理化性质

  IFN的分子量为2～10万，由150～160个氨基酸组成，含17种以上的氨基酸，不含核酸，所以不被DNA酶和RNA酶破坏，对蛋白质酶敏感，不被胰蛋白酶和木瓜蛋白酶破坏，不能透析，但能通过细菌滤器。对温度及pH值相当稳定，60℃1小时不被破坏，—20℃可长期保存，在pH值2以下时，α与β干扰素均稳定，但γ不稳定。

二、干扰素的分型

按IFN的抗原性不同，将病毒诱导产生的IFN(原称I型)分为α型(白细胞产生)和β型(成纤维细胞产生)，致敏淋巴细胞产生的(原称型)为γ型。α型又可分为20多个亚型，β型分为5个亚型，γ型只有1个亚型。

三、干扰素的特点

干扰素具有相对的细胞种属特异性，即由某一种属细胞产生的干扰素，只能作用于相同种属的其他细胞，使其获得“免疫力”。如鸡干扰素只对鸡细胞有保护作用，而对其他动物细胞则无保护作用；但也有例外，如猴干扰素除对猴有保护作用外，对人也有一定的保护作用，但效果差，只不过它们之间的种系关系比较接近，才有一些作用罢了。

干扰素的作用范围广泛，就目前所知，它具有以下的独特作用。

（一）对病毒的作用特点

（二）对肿瘤的作用特点

（三）对免疫活性细胞的作用特点

（四）对吞噬细胞的作用特点

第四章之一  特异性免疫

特异性免疫应答是动物在个体发育过程中，由于受抗原异物的刺激，而发展生成有针对性的免疫力，包括引起生成致敏淋巴细胞的特异性细胞免疫和产生抗体所表现出的特异性体液免疫。这种免疫应答生成的原因，是由于机体与入侵的病原微生物或其他各种抗原异物相互斗争，或因接种疫苗，或因无意接触外界抗原异物后，引起T细胞及B细胞发生免疫应答而生成的。

特异性免疫应答与非特异性免疫应答比较，它具有三个主要特点：①不能遗传给后代，它是在个体发育中，在非特异性免疫的基础上发展生成的，故属于后天获得性免疫。②具有严格的特异性，即它只对于引起其产生这种免疫力的同种抗原异物有对抗性，对于无关的抗原物质不起作用，故属于特异性免疫。③特异性免疫应答是在非特异性免疫应答的基础上建立起来的，也就是说，它需要非特异的体液因子及细胞因子相互配合协作，才能发挥更强大的免疫效能，既可表现免疫防护效果，又可引起免疫病理损害。

第一节  特异性免疫应答的形成的过程

在抗原刺激下，机体形成特异性免疫应答，不论细胞免疫或体液免疫，都有其共同的规律，一般分为三个阶段。

    一、识别阶段（recognition stage）  进入机体的外源性TD抗原，被抗原递呈细胞(APC)捕捉(随机或通过Fc受体结合抗体抗原复合物)、内吞、酶解成抗原肽(T细胞决定簇)，与MHC—Ⅱ分子结合成复合体，在MHC—Ⅱ下与相应辅助性T细胞(TH)的TCR识别结合，完成TH对抗原的识别。

    外源性TD抗原表位(B细胞决定簇)，可直接与相应B细胞的表面免疫球蛋白(SmIg)特异识别结合，完成B细胞对抗原的识别。

机体内靶细胞产生的内源性抗原肽(T细胞决定簇)，与MHC-I分子结合成复合体，在MHC-I的下与未活化的前体细胞毒性T细胞(P-Tc)的TCR识别结合，完成p-Tc对内源性抗原的识别。

二、反应阶段（reaction stage） 识别抗原后的TH、P-Tc和B细胞，在双信号的作用下，基因被激活，进行转化、增殖、分化，产生效应细胞功效应物质。第一信号是识别的抗原信号；TH、P-Tc的第二信号为APC上的配体（B7分子等）与T细胞表面受体（CD28分子等）结合，产生的协同刺激信号。在双信号作用下，TH转化，在IL-12诱导下增殖分化为TH1；在IL-4诱导下则增殖分化为TH2；P-Tc转化增殖Tc。TH2分泌的IL-4、IL-5、IL-10等，与B细胞膜上的相应受体结合，使Bc获得第二信号，增殖分化并进行免疫球蛋白（Ig）基因的类别转换，形成各类浆细胞，分泌IgM、IgG、IgA或IgE等抗体，存在于体液（血液、淋巴液、组织液）中。

识别抗原后的TH、P-Tc和B细胞，若只有抗原的第一信号，缺乏第二信号作用，即将发生凋亡，或成为“状态”。

三、效应阶段（effect stage） TH1再在同种抗原作用下，产生多种细胞因子，活化、招集大量单核巨噬细胞、白细胞，形成炎症反应，消除抗原；同时也造成炎症部位组织损伤。因机体再次接触抗原后，炎症反应一般在24h后发生，48-72h达高峰，故称为迟发型超敏反应（delayed type hypersensitivity，DTH）。因此，TH1在功能上是迟发型变态反应性T细胞（TDTH），旧称致敏淋巴细胞。

活化的效应Tc分泌穿孔蛋白、粒酶，表达FasL蛋白等，共同特异作用靶细胞使靶细胞溶解或凋亡。

TH1（TDTH）与Tc共同完成细胞免疫效应。

浆细胞产生的各类体液抗体，在补体、吞噬细胞、NK细胞等协同作用下，消除相应抗原，完成体液免疫效应。但在一定条件下，也可引起I、II、III型超敏反应，造成机体功能紊乱或组织损伤。

T和B细胞受抗原作用后，活化增殖过程中，分别将产生一些长寿的记忆细胞，保留于机体内，当同种抗原再次进入机体时，记忆细胞将迅速产生强烈的再次免疫应答。

TI抗原诱导的免疫应答过程比较简单。无需APC的递呈、TH的辅助，其表面重复排列的B细胞决定簇，直接与B细胞SmIg识别结合，导致多外同种TI抗原再次进入机体时，不发生再次免疫应答。

（一）Tc对靶细胞的杀伤  Tc对带有内源性抗原的靶细胞起特异杀伤、直接杀伤和重复杀伤作用，在抗病毒感染，抗肿瘤免疫中发挥重要作用。

Tc杀伤靶细胞的机制是：Tc通过TCR和靶细胞上在MHC—Ⅰ类分子控制下的内源性抗原特异结合，并在协同刺激分子的作用下分泌穿孔蛋白，使靶细胞膜发生不可逆性溶解，大量水分进入胞内，细胞质向外流失，细胞裂解；同时Tc表达粒酶和称为FasL的蛋白，引起靶细胞内的DNA酶活化，使DNA裂解，导致靶细胞凋亡。Tc完成对靶细胞的杀伤后保持完整，又可特异杀伤其他靶细胞，一个Tc细胞在数小时内可杀伤几十个靶细胞。

（二）TDTH释放细胞因子致炎症作用 TDTH受同种TD抗原作用后，释放许多具有生物学活性的可溶性蛋白质，旧称淋巴因子(1ymphokine，LK)，现统称细胞因子。LK是细胞免疫的重要介质，已发现50多种，以其生物学作用命名。多数LK非特异性地招集、活化单核巨噬细胞、白细胞，造成炎症反应，共同发挥消灭抗原的作用。

（三）细胞免疫的作用  细胞免疫在对胞内寄生病原体的抗感染方面具有重要作用。例如，胞内寄生菌(结核杆菌、布氏杆菌、马鼻疽杆菌等)，各种

第四章之二   抗体部分

第一节  抗体和免疫球蛋白的概念

    一、抗体的发现

抗体(antibody，Ab)是介导体液免疫的重要效应分子，是B细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的一种糖蛋白，主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异地结合，具有免疫功能。

10年德国学者von Behrong和日本学者北里用白喉杆菌或破伤风毒素免疫动物后，在其血清中发现一种具有中和毒素的物质，称之为抗毒素。这是在血清中发现的第一种抗体。

二、抗体的理化性质

免疫球蛋白包括抗体球蛋白和多发性骨髓瘤患者血清中出现的尚未证明有抗体活性的异常球蛋白。可见Ig与抗体是互相关联但又不完全相同的两个概念。抗体和免疫球蛋白的关系：Ig是化学结构的概念，抗体则是生物学功能的概念，所有的抗体都是Ig，而Ig并非全为抗体。

免疫球蛋白可分为分泌型(sIg)和膜型(mIg)。前者主要存在于血液及组织液中，具有抗体的各种功能；后者构成B细胞膜上的抗原受体。

第二节  免疫球蛋白的基本结构与功能

Ig分子根据其可溶性、电荷、大小、化学结构等理化特性及其免疫反应性可分为IgA，IgG，IgD，IgE和IgM五类。在电镜下，IgG为“Y”型分子。“Y”的臂可结合抗原。若用化学方法处理免疫球蛋白，使其摆脱二硫键的束缚，分子就被裂解成4条的多肽链。所有Ig都具有由四条肽链组成的基本结构，称为单体(抗体单位)，IgG为典型的单体。

Porter对血清IgG抗体的研究证明，Ig分子基本结构是由四个肽链组成的，二条较小的轻链和二条较大的重链，轻链与重链是由二硫键连接形成，分为氨基端(N端)，羧基端(C端)。

一、重链和轻链

任何一类天然免疫球蛋白分子均含有四条异源性多肽链，其中，相对分子质量较大的称为重链(heavy chain，H链)，而相对分子质量较小的为轻链(light chain，L链)。同一天然Ig分子中的两条H链和两条L链的氨基酸组成完全相同。

1、重链：两条相同的长链称为重链、简称H链。H链由450—550氨基酸组成，相对分子质量为50—75kDa。根据Ig重链恒定区氨基酸的排列顺序不同，免疫反应性就不同，据此可将血清中的Ig分成五大类：IgG，IgA，IgM，IgD，IgE，其相应的重链分别为γ、μ、α、δ和ε链。不同类的免疫球蛋白具有不同的特征，如链内和链间二硫键的数目和位置、连接寡糖的数量、结构域的数目以及铰链区的长度等均不完全相同。即使是同一类Ig其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目、位置也不同，据此又可将同类Ig分为不同的亚类(subclass)。

2、轻链：两条相同的短链称为轻链，简称L链，L链约由214个氨基酸组成，相对分子质量约为25kDa，根据L链免疫反应性不同，L链可分为两型，即κ型和λ型。根据λ链恒定区个别氨基酸的差异，又可分为λ1、λ2、λ3和λ4四个亚基(subtype)。同一天然的Ig分子上两条H链是同类，两条轻链是同型，五类Ig中，每一类Ig都可以有κ链或λ链，可以把Ig分成五类十型。

二、可变区和恒定区

通过分析不同免疫球蛋白重链和轻链的氨基酸序列，发现重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，其他部分氨基酸序列则相对恒定。免疫球蛋白轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V区)，分别占重链和轻链的1／4和1／2；而靠近C端氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constant region，C区)，分别占重链和轻链的3／4和1／2。

1、可变区：免疫球蛋白轻链靠近氨基端(N端)的1／2区段或重链靠近氨基端(N端)1／5—1／4区段的110个氨基酸的组成和排列顺序在不同Ig中差异很大，称为可变区，分别用VH和VL表示。

高变区(hypervariable region，HVR)：在VH和VL中，各有3个区域的氨基酸组成和排列顺序高度可变，称为高变区或互补决定区(complementarity determining region，CDR)，分别用HVRl(CDRl)，HVR2(CDR2)，HVR3(CDR3)表示。一般CDR3变化程度更高。VH的3个高变区分别位于29—31，49—58和95—102位氨基酸，VL的3个高变区分别位于28—35、49—56和91—98位氨基酸。VH和VL的3个高变区组成Ig的抗原结合部位，决定着抗体的特异性，负责识别和结合抗原，从而发挥免疫效应。其中重链在与抗原结合起重要作用。

骨架区：在V区中CDR之外区域的氨基酸组成和排列顺序相对不易变化，称为骨架区（framework region，FR)，对超变区的空间结构起维持作用。VH和VL各有4个骨架区，分别用FR1，FR2，FR3，FR4表示。

2、恒定区：免疫球蛋白除了可变区以外，轻链靠近羧基端(C端)1／2区段或重链靠近C端3／4—4／5区段氨基酸的组成和排列相对稳定，称为恒定区。分别用CH和CL表示，不同Ig的CL的长度基本一致；不同Ig的CH长度不一，有的包括CH1，CH2，CH3。有的包括CH1，CH2，CH3，CH4。同一种属的个体，所产生针对不同抗原的同一类别Ig，其C区氨基酸组成和排列顺序比较恒定，其免疫原性相同，但V区各异。

3、铰链区：位于CH1和CH2之间的非功能区，即位于Ig的Y形分子两臂和主干之间的区域，称为铰链区。富含脯氨酸，因此易伸展弯曲，易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶水解，并可通过变构有利于与不同距离的抗原决定簇结合。

铰链区的作用：

 （1）当VL，VH与抗原结合时，此区发生扭曲，使抗体分子上两个抗原结合位点更好地与两个抗原决定簇发生互补，利于抗体分子高变区与抗原决定簇吻合。

（2）Ag和Ab结合后，铰链区发生构型变化，使存在于CH2区补体结合位点暴露，使补体得以结合，显示出活化补体，结合组织细胞等生物学活性。

  三、功能区

  H链和L链上每隔90个氨基酸残基通过链内二硫键连接形成跨度有110个氨基酸的环形结构域称为功能区，H链有VH，CH1，CH2，CH3等4个或5个功能区。IgG，IgA，IgD的H链有4个功能区，IgM和IgE的H链有5个功能区。L链有VL、CL两个功能区。每个功能区，有特定的功能（例如VH和VL一起形成抗原结合点），这种结构类型是许多其他因子被称为Ig基因超家族的分子的共同特征，如MHC-I、II类分子、TCR、细胞间黏附分子（ICAM）等均具有这种环形结构域。

  功能区的主要功能：

（1）VH和VL抗原结合部位；

（2）CH1-3和CL Ig遗传标志所在；

（3）CH2（IgG），CH3（IgM）C1q结合部位（补体结合位点）；

（4）CH2—CH3(IgG) IgG可借该区主动通过胎盘由母体传给胎儿；

（5）CH3（IgG）FcγR结合部位；

（6）CH4（IgE）FcεR结合部位；

CH3（IgG）和CH4（IgE）两者具有与多种细胞结合的功能，不同的Ig结合不同的细胞，产生不同的免疫反应。

四、免疫球蛋白的其他成分

Ig轻链和重链除上述基本结构外，某些类别的Ig还含有其他辅助成分，分别是J链和分泌片。

1、连接链（joining chain，J链）：是一富含半胱氨酸的多肽链，由浆细胞合成，主要功能是将单体Ig分子连接为多聚体。2个IgA单体由J链相互连接形成二聚体，5个IgM单体由二硫键相互连接，并通过二硫键与J链连接形成五聚体。IgG，IgD和IgE常为单体，无J链。

2、分泌片（secretory piece，SP）：又称为分泌成分（secretory component，SC），是分泌型IgA分子上的一个辅助成分，为一种含糖的肽链，由黏膜上皮细胞合成和分泌，以非共价形式结合于IgA二聚体上，使其成分分泌型IgA（sIgA），并一起被分泌到黏膜表面。分泌片具有保护分泌型IgA的铰链区免受蛋白水解酶降解的作用，并介导IgA二聚体从黏膜下通过黏膜等细胞到黏膜表面的转运。

五、免疫球蛋白水解片段

在一定条件下，免疫球蛋白分子肽链的某些部分易被蛋白酶水解为不同片段。木瓜蛋白酶和胃蛋白酶是最常用的两种Ig蛋白水解酶，并可藉此研究Ig的结构和功能，分离和纯化特定的Ig 多肽片段。

1、木瓜蛋白酶水解片段

木瓜蛋白酶水解IgG的部位是在铰链区二硫键连接的2条重链的近N端，可将Ig裂解为两个完全相同的Fab段和一个Fc段。Fab段即抗原结合片段，相当于抗体分子的两个臂，由一条完整的轻链和重链的VH和CH1结构域组成。一个Fab片段为单价，可与抗原结合但不形成凝集反应或沉淀反应；Fc段即可结晶片段，相当于IgG的CH2和CH3结构域。Fc无抗原结合活性，是Ig与效应分子或细胞相互作用的部位。

2、胃蛋白水解酶片段

胃蛋白酶作用于铰链区二硫键所连接的两条重链的近C端，水解Ig后可获得一个F（ab’）2片段和一些小片段pFc’。 F（ab’）2是由两个Fab及铰链区组成，由于Ig分子的两个臂仍由二硫键连接，因此F（ab’）2片段为双价，可同时结合两个抗原表位，故与抗原结合可发生凝集反应和沉淀反应，而且，由于F（ab’）2片段保留了结合相应抗原的生物学活性，又避免了Fc段免疫原性可能引起的副作用，因而被广泛用作生物制品。如白喉抗毒素、破伤风抗毒素经胃蛋白酶消化后精制提纯的制品，因去掉Fc段而降低发生超敏反应。胃蛋白酶水解Ig后所产生的pFc最终被降解，无生物学作用。

第三节  免疫球蛋白的异质性

尽管所有的免疫球蛋白分子在结构上均由V区和C区组成，但不同抗原甚至同一抗原刺激B细胞产生的免疫球蛋白，在其特异性以及类型等诸方面均不尽相同，呈现出明显的异质性。免疫球蛋白的异质性可表现为：不同抗原表位刺激机体所产生的不同类型的免疫球蛋白分子，其识别抗原的特异性不同，其重链类别和轻链型别也有差异；不同抗原表位诱导的同一类型的免疫球蛋白(如IgG)，其识别抗原的特异性不同。导致免疫球蛋白异质性的因素包括内源性因素和外源性因素。

一、免疫球蛋白的类型

Ig根据其H链免疫反应性的差异分为类、亚类，根据L链差异分为型、亚型。在同一个体中可以存在各种类型、不同数量的Ig。

1、类：在同一种属所有个体内，根据重链C区抗原特异性的差异，将重链分为5类，即λ-链、μ-链、α-链、δ-链、ε-链，相应的免疫球蛋白分别为IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。

2、亚类：同一类Ig，根据重链免疫反应性以及二硫键的数目和位置不问，又可分为若干个亚类。IgG有G1，G2，G3，G4四个亚类；IgA有A1，A2两个亚类；IgM有IgMl和IgM2两个亚类；IgD和IgE尚未发现亚类。

3、型：在同一种属所有个体内，根据Ig轻链C区抗原表位的差异，可将Ig轻链分为κ和λ，与此对应的免疫球蛋白分为κ和λ型。

4、亚型：同一型Ig中，根据轻链C区N端氨基酸排列的差异，又可将Ig分为亚型。例如λ链190氨基酸为亮氨酸时，称OZ（+）；为精氨酸时，称OZ（-）。

二、外源因素所致的异质性—免疫球蛋白的多样性

自然界存在的外源性抗原数目繁多，包括蛋白质、多糖、脂类等。每一种抗原分子的结构又十分复杂，含有多种不同的抗原表位。含多种不同抗原表位的抗原则激机体免疫系统，导致免疫细胞的活化，产生多种不同特异性的抗体。理论上，每一种抗原表位可诱导产生一种特异性抗体。因此，这些抗原可刺激机体产生的抗体的总数是巨大的，包含针对各种抗原表位的许多不同抗原特异性的抗体，以及针对同一抗原表位的不同类型的抗体。多样性抗原的存在是导致免疫球蛋白异质性(即具有不同的抗原识别特异性)的外源因素，是免疫球蛋白异质性的物质基础。抗体的这种异质性，反映出机体对抗原精细结构的识别和应答。

三、内源因素所致的异质性—免疫球蛋白的血清型

免疫球蛋白既可以与相应的抗原发生特异性结合，其本身又可以激发机体产生特异性免疫应答，即免疫球蛋白也具有免疫原性，它之所以具有免疫原性是由于其分子中包含多种不同的抗原表位。免疫球蛋白分子上有三类不同的抗原表位，分别为同种型、同种异型和独特型抗原表位。那么采用血清学方法，可将Ig分为相应的血清型。

第四节 各类免疫球蛋白的主要特性与免疫学功能

一、IgG

IgG是人和动物血清中含量少最高的免疫球蛋白，占血清免疫球蛋白总量的75%～80%。IgG是介导体液免疫的主要抗体，多以单体形式存在。它主要由脾脏和淋巴结中的浆细胞产生，大部分（45%～50%）存在于血浆中，其余存在于组织液和淋巴液中。IgG是惟一可以通过人（兔）胎盘的抗体，因此在新生儿的抗感染中起着十分重要的作用。IgG有四个亚类，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。IgG是动物自然感染和人工主动免疫后，机体所产生的主要抗体，它能调理、凝集和沉淀抗原，具有抗菌、抗病毒、抗毒素等免疫活性，在抗肿瘤免疫中，其作用也是不可缺少的；此外，它是引起II型、III型变态反应及自身免疫病的抗体，在肿瘤免疫中体内产生的封闭因子可能与IgG有关。

二、IgM

IgM是动物机体初次体液免疫反应最早产生的免疫球蛋白，其含量仅占血清免疫球蛋白的10%左右，主要由脾脏和淋巴结中B细胞产生，分布于血液中。IgM由5个单体组成的五聚体，又称为巨球蛋白。与IgG相比，IgM在体内产生最早，但持续时间短，因此不是机体抗感染免疫的主力，它在感染免疫的早期起着十分重要的作用，也可通过检测IgM抗体进行疫病的血清学早期诊断。IgM具有抗菌、抗病毒、中和毒素等免疫活性，它是一种高效能的抗体，其杀菌、溶菌、溶血、促进吞噬（调理作用）及凝集作用均比IgG高。IgM也有抗肿瘤作用，在补体参与下同样可介导对肿瘤细胞的破坏作用。此外，IgM可引起II型和III型变态反应及自身疫病而造成机体的损伤。

三、IgA

IgA以单体和二聚体两种分子形式存在，单体存在于血清中，称为血清型IgA，占血清免疫球蛋白的10%～20%；二聚体为分泌型IgA，是由呼吸道、消化道、泌尿生殖道等部位的黏膜固有层中的浆细胞所产生的。

分泌型IgA对机体呼吸道、消化道等局部黏膜免疫起着相当重要的作用，特别是对于一些经黏膜途径感染的病原微生物，黏膜免疫功能就显得十分重要，若动物机体呼吸道、消化道分泌液中存在这些病原微生物的相应的分泌型IgA抗体，则可抵抗其感染，因此分泌型IgA是机体黏膜免疫的一道“屏障”。

四、IgE

IgE是以单体分子形式存在，其重链比γ链多一个功能区（CH4），此区是与细胞结合的部位。IgE的产生部位与分泌型IgA相似，是上呼吸道和消化道黏膜固有层中的浆细胞所产生的，在血清中的含量甚微。IgE是一种亲细胞性抗体，其Fc片段中含有较多的半胱氨酸和蛋氨酸，这与其亲细胞性有关，因此IgE易于与皮肤组织、肥大细胞、血液中的嗜碱性粒细胞和血管内皮细胞结合。结合在肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的IgE与抗原结合后，能引起这些细胞脱粒，释放组织胺等活性介质，从而引起I型过敏反应。IgE在抗寄生虫感染中具有重要的作用，诱导过敏反应，真菌感染后可诱导机体产生大量的IgE抗体。

五、IgD

IgD很少分泌，在血清中的含量极低，而且极不稳定，容易降解。IgD主要作为成熟B细胞膜上的抗原特异性受体，是B细胞的重要表面标志，而且与免疫记忆有关。有报道认为IgD与某些过敏反应有关。

第五节 动物的免疫球蛋白

    所有哺乳动物都具有4类主要的免疫球蛋白，即IgG、IgM、IgA和IgE。在所有种类动物中，每一类免疫球蛋白的基本特性没有明显的差异，但在其亚类和同种异型上存在一定的差异。                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                

第五章 变态反应

高等动物或人类有时会发生一种异常增高的免疫反应，导致生理功能紊乱或组织损伤，称之为变态反应。变态反应的机理仍属于免疫应答范畴，但是反应过程、反应强度和反应结果不同。防治变态反应的方法主要是避免接触变应原，利用药物减轻变态反应症状，也可起到治疗作用。

第一节 概念

变态反应是机体对某些抗原物质发生的一种可导致生理功能紊乱或组织损伤的异常免疫反应。常表现为免疫反应的异常增高，多发生于再次接触同种抗原的时候。变态反应，也称过敏反应或超敏反应，引起变态反应的物质称为变应原或超敏感原，其中包括完全抗原、半抗原或小分子的化学物质等，如病原微生物、寄生虫（原虫、蠕虫）、异种血清、组织蛋白、化学药品以及某些饲料等。根据变态反应中所参与的细胞、活性物质、损伤组织器官的机制和产生反应所需时间等，Coombs和Gell(1963)将变态反应分为Ⅰ至Ⅳ4个型，即：过敏反应型(Ⅰ型)、细胞毒型(Ⅱ型)、免疫复合物型(Ⅲ型)和迟发型(Ⅳ型)。其中前3型是由抗体介导的，共同特点是反应发生快，故又称为速发型变态反应；Ⅳ型则是细胞介导的，称为迟发型变态反应。尽管近年来有些学者提出了一些新的分型方法，但还未被广泛接受，上述分型至今仍是国际通用的方法。其实，临床所观察到的变态反应，往往是混合型的，而且其反应强度可因个体的不同而有很大差异。

第二节 变态反应的发生过程

变态反应的发生一般可分为致敏阶段和发敏阶段。

一、致敏阶段：指机体初次接触某种抗原后，免疫活性细胞增殖分化为致敏淋巴细胞或浆细胞，并由后者产生特异性抗体的过程。一般需10-21d。

二、发敏阶段：指机体再次接触同一抗原时，抗原作用于相应的致敏淋巴细胞，使之释放出多种淋巴因子或与相应的过敏抗体发生特异性结合，而出现异常反应的过程。为期约几分钟或2-3d。

变态反应的发生决定于两方面的因素：一为机体的免疫机能状态，另一为抗原的性质和进入机体的途径等，而主要决定于前者。变态反应不同于正常免疫反应的特点在于个体差异较为明显。某些个体即使接触极微量的变应原，也可发生强烈的变态反应。这被认为是这些个体对那种过敏原具有特应性，此外也似乎存在着一种特应性的遗传因素。

第三节 Ⅰ型变态反应（速发型变态反应）

Ⅰ型变态反应是临床上最常见的一种变态反应。致敏机体在再次接触变应原时，反应立即出现，故亦称速发型变态反应。反应局限于某一种组织或为全身性，反应程度不一。属于此类反应的有过敏性休克、支气管哮喘、枯草热、荨麻疹以及食物、药物、花粉和虫螫性过敏等。参与过敏反应的成分有变应原（过敏原）、IgE抗体、肥大细胞和嗜碱性粒细胞和IgE Fc片段的受体（FcεR)。

一、变应原：引起过敏反应的抗原是多方面的，从化学组成上看，包括异种蛋白质及半抗原性质的药物。前者如异种血清、昆虫螫咬的毒液（如蜂毒）、生物提取物（花粉、胰岛素、肝素、脑垂体后叶素提取物）、疫苗和寄生虫，以及某些食物如蘑菇、鱼贝类、牛乳、鸡蛋等；后者如抗生素、阿司匹林、有机碘、汞制剂等，还有一些性质不明的物质如尘埃、油漆等。

蛋白质类变应原可直接致敏动物，若为小分子半抗原药物，则必须在进入体内后，与蛋白质结合才具有变应原性。例如青霉素过敏，该药进入体内后可与体内蛋白质结合成青霉素噻唑蛋白，成为变应原。

变应原可经注射、吸入、食入、皮肤接触或虫咬等多种途径进入体内。

二、IgE

IgE在寄生虫(尤其是肠道蠕虫)免疫中具有重要作用，也是介导I型变态反应的抗体。IgE是一种亲细胞性的过敏性抗体，其重链的恒定区有CH4，是与肥大细胞和嗜性粒细胞上的IgE Fc受体(FcεR)结合的部位。

IgE的半衰期只有2.5d，但一旦与肥大细胞结合，则可延至12周。IgE的另一特性是热稳定，56℃经0.5h处理的IgE，其Fc端结合受体的能力可丧失，但其Fab端结合抗原的活性仍保持。根据这一特性可与结合肥大细胞的IgG抗体加以区别。

尽管分泌性IgA是肠道寄生虫免疫的主要成分，但是在IgA不能消除寄生虫时，IgE能使致敏的肥大细胞释放介质，提高IgG和补体等局部浓度，并激活补体系统；同时也使嗜酸性和中性粒细胞等向炎症区域迁移。在IgA缺陷的动物往往过敏反应性高，可能与此有关。

当抗原进入机体，经抗原递呈细胞和TH细胞的作用，静止的B细胞被活化，增殖并分化成分泌IgE的浆细胞。分泌的IgE能通过Fc端与局部的肥大细胞结合，与IgE结合的肥大细胞即为致敏细胞。未被结合的IgE则进入循环系统，与其他组织器官中的肥大细胞或嗜碱性粒细胞结合。

动物实验表明，IgE的产生受到TH细胞和Ts细胞的调节。正常大白鼠在用DNA—佐剂免疫后的5-10d就可产生IgE抗体，其滴度逐渐升高，约在以后的6周内又恢复至原来水平。被摘除胸腺或经辐射处理的小鼠，其IgE水平明显增高，而且在血清中的时间延长；如被动接受经致敏的淋巴细胞，则可恢复至正常水平和缩短存在时间。但是在上述情况下，IgG和IgM水平不受影响。

三、肥大细胞和嗜碱性粒细胞  

肥大细胞含有大量的膜性结合颗粒，分布于整个细胞浆内，颗粒内含有药理作用的活性介质，可引起炎症反应。此外，大多数肥大细胞还可分泌一些细胞因子，包括IL—1，IL—3，IL—4，IL—5，IL—6，GM—CSF，TGF—β和TNF—α，这些细胞因子可发挥多种生物学效应，因此肥大细胞与机体的很多生理学、免疫学和病理学过程有关。

四、致敏过程和反应机理

1、致敏阶段：当变应原第一次进入到机体时，刺激机体产生IgE。IgE具有亲细胞性，其Fc片段能与组织中的肥大细胞和血液中的嗜碱性粒细胞上的Fc受体结合，而让Fab片暴露于外。此时机体便处于致敏状态，这种致敏状态通常于第一次接触抗原后2周开始形成，可维持半年至数年。

2、反应阶段：变应原再次进入致敏状态的动物体时，可与肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的IgE结合。一个变应原分子可与两个IgE结合，而使细胞表面的IgE分子互相连接，形成搭桥状，从而改变细胞膜的稳定性，激活细胞内的酶系统，促使细胞内的嗜碱性颗粒被释放，脱出的颗粒又受到细胞外酶的催化作用，使颗粒内的各种活性介质（包括组织胺、缓慢反应物质A（SRS-A）、前列腺素、舒缓激肽、5-羟色胺等）游离出来，产生各种生物效应。

以上活性介质作用于相应的效应器官，可导致平滑肌收缩、毛细血管扩张、血管通透性增强、腺体分泌增多等反应。如反应发生在皮肤则引起荨麻疹、皮肤红肿等；发生在胃肠道，则引起腹痛、腹泻等；发生在呼吸道，则引起支气管痉挛，出现呼吸困难和哮喘；若全身受到影响，则表现血压下降，引起过敏性休克，甚至死亡。如图示：

第四节  Ⅱ型变态反应（细胞毒型）

一、Ⅱ型变态反应机制

Ⅱ型变态反应又称为抗体依赖性细胞毒型变态反应。Ⅱ型变态反应的特征是特异性抗体（IgG或IgM）与吸附在靶细胞（红细胞、白细胞、血小板）上的抗原结合，引起细胞凝集或在补体作用下使细胞溶解、损伤或被单核细胞吞噬，在临床上表现为溶血性贫血（黄疸）、白细胞减少或血小板减少等。在此过程中抗体的Fc端与补体系统的Clq或其他吞噬细胞的Fc受体结合，另一端则与抗原结合，起到桥梁和启动作用。这同机体在识别和清除病原微生物的过程是一致的。

补体系统在免疫反应中具有双重作用：一是通过经典和旁路途径溶解被抗体结合(致敏)的靶细胞；二是补体系统的一些成分能调理抗体—抗原复合物，促进巨噬细胞吞噬病原菌。在Ⅱ型变态反应中，吞噬细胞溶解细胞同溶解病原菌的生理作用是相同的。在大多数病原菌，被吞噬进入细胞后，进一步在胞内溶酶体的酶、离子等因子的作用下致死并消化；但如果靶细胞过大，吞噬细胞不能将其包入细胞内，则将胞内的活性颗粒和溶酶体释放，从而使周围的宿主组织细胞受损伤。

本型变态反应的变应原可以是受侵害细胞本身的表面抗原，如血型抗原。人或动物在血型不合的情况下输血，受血者血清中的天然抗体可与输入血细胞结合引起溶血反应。另外，因胎儿红细胞渗漏进母畜血流导致的新生动物溶血症亦属此类。变应原也可以是外来的，如药物和侵入机体的病原体（或某些成分），可结合到宿主细胞上导致Ⅱ型变态反应。如图示：

二、临床表现及疾病

1、输血反应：人至少有15种血型系统，了解最多的是ABO系统。各种动物也有其血型系统，如输入血液的血型不同，就会造成输血反应，严重的可导致死亡。这是因为在红细胞表面存在着各种抗原，而在不同血型的个体血清中有相应的抗体，这些被称为天然抗体，通常为IgM。当输血者的红细胞进入不同血型的受血者的血管，红细胞与抗体结合而凝集，并激话补体系统，产生血管内溶血；在局部则形成微循环障碍等。

其实在输血过程中，除了针对红细胞抗原，还有针对血小板和淋巴细胞抗原的抗体反应，但因为它们数量较少，反应不明显。

2、新生畜溶血性贫血：这也是一种因血型不同而产生的溶血反应。以新生骡驹为例，有8%-10%的骡驹发生这种溶血反应。这是因为骡的亲代血型抗原差异较大，所以母马在妊娠期间或初次分娩时易被致敏而产生抗体。这种抗体通常经初乳进入新生驹的体内引起溶血反应。这与人因RhD血型而导致的溶血反应是类似的。所以，在临床上初产母马的幼驹发生的可能性较经产的要小。

3、由药物引起的Ⅱ型变态反应

4、传染病的Ⅱ型变态反应

第五节  Ⅲ型变态反应（免疫复合物型）

一、Ⅲ型变态反应机制

引起本型号变态反应的变应原除异种血清外，还有微生物、寄生虫和药物等。参与反应的抗体属沉淀性抗体，主要为IgG和IgM。在抗原与抗体接触后，由于抗原中度过剩，形成中等大小的免疫复合物，但仍为可溶状态，不易被吞噬细胞吞噬清除，又不能通过肾小球滤孔排出，因而较长时间循环于血液中。此种可溶性免疫复合物可沉积于多种器官，如心脏、肾脏及关节部位的血管壁基底膜、肾小球基底膜和关节滑膜等处，或向毛细血管壁外渗出，然后进一步激活补体，引起组织、细胞的溶解和坏死，使基底膜及其他支持组织遭到破坏。免疫复合物还可使肥大细胞脱粒，释放活性介质，引起局部炎症、小血管周围炎症或使小血管遭受机械阻塞，影响周围组织的血液供应，导致局部组织的病理损伤。因此，Ⅲ型变态反应又称为血管炎性反应。

本型反应的机制是由存在于循环中或组织间隙的免疫复合物激活了补体，并吸引嗜中性粒细胞释放溶酶体酶，导致组织损伤和炎症反应。与Ⅰ、Ⅱ型变态反应不同，本型抗体是在血循环或体液中与抗原结合，而不是在靶细胞上结合。临床上显著的Ⅲ型变态反应与免疫复合物的大量形成有关。如图示：

第六章 抗感染免疫

机体抗感染免疫包括特弄性免疫和非特务性免疫。非特异性免疫因素有皮肤与黏膜等屏障结构、补体和干扰素等组织和体液中的抗微生物物质及吞噬细胞和自然杀伤细胞。特异性免疫有体液免疫和细胞免疫。抗胞外菌感染以体液免疫为主，抗胞内菌感染以细胞免疫为主。抗病毒免疫中体液和细胞免疫都重要，预防病毒病再传染，主要靠体液免疫，而病毒病的恢复主要依靠细胞免疫。对寄生虫感染的免疫和其他病原体一样，也表现为体液免疫和细胞免疫。

抗感染免疫是动物机体抵抗病原体感染的能力。根据不同的病原体可将其分为抗细菌免疫、抗病毒免疫、抗真菌免疫、抗寄生虫免疫等。抗感染免疫包括先天性免疫和获得性免疫两大类。

感染是指病原体侵入机体，在体内繁殖，释放出毒素、酶，或侵入细胞组织，引起细胞组织乃至器官发生病理变化的过程。这一过程同时也交织着机体的特异性免疫应答和非特异性防御功能。当非特异性免疫不能阻止侵入的病原体生长、繁殖并加以消灭时，机体对该病原体的特异性免疫即逐渐形成，这就大大加强了机体抗感染的能力，直到感染终止。

第一节 抗细菌免疫

病原细菌侵入动物机体后，首先遇到的非持异性免疫机能的抵抗，其中以细胞吞噬和炎症反应为主。随后特异性免疫产生，两者协同，共同把病原菌消灭。

吞噬细胞能吞噬侵入的细菌，在有特异性抗体及补体存在下，由于吞噬细胞表面有C3和IgG的Fc受体，因此可使病原菌、抗体、补体、吞噬细胞发生免疫调理和免疫粘连反应，从而促进和加强吞噬作用。通过皮肤粘膜的病菌侵入组织后，一般是中性粒细胞首先从毛细血管游出，集聚到病菌部位，大部分病菌可被吞噬消灭。未被吞噬的剩余病菌，则经淋巴管到达附近淋巴结，在淋巴结内又受到许多吞噬细胞的吞噬。淋巴结的这种“过滤作用”，在机体防御机能上占重要地位。一般只有毒力强、数量多的病原菌，才不能被阻挡而侵入血流或其他脏器。在血液、肝、脾、骨髓等处的吞噬细胞，仍可继续进行吞噬和杀灭。

炎症反应是机体与致病因子(包括病原菌)相互作用而产生的一种反应过程。炎区除出现组织受损病变外，尚有抗御致病因子并使受损组织修复的一系列抗损伤反应。因此，炎症本质主要是防御性的。

炎症反应除因血管壁通透性增加，血浆成分渗至组织间隙形成渗出液外，大量的吞噬细胞游出并集中炎症区。葡萄球菌、链球菌等病原菌，以及组织溶解产物(尤其是多肽)均有较明显的阳性趋化作用。当发生炎症时，补体系统的某些成分被激活，所产生的多种生物活性物质可以增加血管通透性、吸引中性粒细胞等。此外，组织损伤时产生的蛋白酶也能激活补体系统而引起上述变化。

炎症反应早期，渗出液呈碱性，炎性细胞以中性粒细胞为主。之后，可能是糖酵解之故，乳酸积聚，渗出液pH下降，则巨噬细胞成为主要细胞。炎症渗出物中的乳酸、补体、抗体等虽有抑制病原菌作用，但主要抗感染作用是吞噬细胞的吞噬作用。

一、急性细菌性感染的免疫

急性细菌性感染多属细胞外细菌的感染，如巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等所致的感染。急性细菌感染时，无荚膜的病原菌易被宿主体内吞噬细胞吞噬消灭；有荚膜细菌在感染初期能抵抗吞噬，但有机体产生特异性抗体时，可通过调理作用而将其消灭掉。当然，无荚膜的病原菌也可通过调理作用，而促进吞噬细胞的活性。补体参与时，则抗体的调理作用更强。

在病变主要由外毒素引起的急性细菌性感染中，特异性抗毒素有直接的中和作用，外毒素和抗毒素复合物最终被吞噬细胞消毁、消除。当强毒性的外毒素被中和后，病菌本身就易被体内的抗菌免疫力消毁而使感染终止。

在肠道感染病原菌的免疫中，局部分泌型IgA抗体的抗粘附作用有重要功能。

在急性细菌性感染中，也可有细胞免疫的产生，但不如在慢性细菌感染中重要。

二、慢性细菌性感染的免疫

慢性细菌性感染多为细胞内细菌感染，如结核杆菌、布氏杆菌、李氏杆菌等细胞内寄生菌而引起慢性感染。在这类感染中，细胞免疫起决定性作用，而体液免疫作用不大。当这些病原菌侵入机体后，—般先由中性粒细胞吞噬，但不能被杀灭，反而在其中繁殖并被带至体内深部。

中性粒细胞仅有数天寿命，一旦死亡破溃，病菌随之散播。一般无特异性免疫机体中的巨噬细胞，也不能将吞入病菌消灭，因而它们仍能在巨噬细胞内繁殖。直至机体产生了特异性免疫，巨噬细胞在其他因素协同下，才逐步将病菌杀死消火。当致敏的T细胞接触到含病菌的巨噬细胞或散在胞外的病菌时，则释放出许多细胞因子，使巨噬细胞集聚于炎区，并激活其功能，促进和加速胞内菌的杀灭，从而感染告终。

第二节 抗病毒免疫

病毒通常由一种或几种蛋白质构成的衣壳包裹，有些病毒还覆盖有囊膜，囊膜多为来自宿主细胞的脂蛋白。机体的免疫系统接受这些蛋白刺激后可产生免疫应答，保护机体。抗病毒感染的免疫机制与病毒在宿主体内扩散、复制和感染的方式有关。病毒扩散和感染方式主要有细胞外、细胞内和核内3种。

当病毒侵入动物机体后，能否引起感染；感染的过程和结局如何，这不仅取决于病毒的性质，而且更大程度上取决于动物机体的防御体系和免疫功能。

一、机体对病毒感染的先天性免疫

抗感染免疫包括先天性免疫和获得性免疫两大类。先天性免疫是由机体的正常组织细胞和体液成分来完成的，不需要特异性免疫细胞和抗体参与的机体防御能力，包括种属免疫或遗传免疫以及机体的表面屏障、血—脑屏障、血—胎屏障、吞噬细胞的吞噬作用以及正常体液和组织免疫成分等，均属非特异性免疫。

1、种属免疫或遗传免疫

不同种类的动物对于同一病毒有着不同的抵抗力或敏感性。即使同一种动物的不同品种或品系，甚至不同的个体，往往也对某一特定病毒呈现不同的敏感性或抵抗力。对于种属免疫或遗传免疫的机制，大多数学者认为是由于细胞膜上缺乏特异性的病毒受体而引起的，因机体的细胞缺乏某些病毒的受体，使病毒不能吸附到动物细胞上，从而阻止病毒的增殖。另外，即使病毒能够吸附和侵入这些细胞，仍不能增殖，这可能是因为病毒不能利用宿主细胞的基质、能源和细胞器进行病毒大分子的合成。

2、吞噬和吞饮

吞噬作用是动物机体的一个重要防御机能，在病毒性感染中起着重要作用。吞噬作用是多形核白细胞和单核—巨噬细胞等少数几种细胞的独特性能。吞饮作用则是机体内所有细胞都具有的正常机能。吞饮时，细胞膜发生折叠，包围黏附在细胞上的液滴或颗粒，形成空泡，在胞浆中进行吞噬。吞饮过程可能是细胞摄取营养物质的一种手段。血液中病毒的消除，主要依靠单核—巨噬细胞系统的巨噬细胞，还有遍布于全身的血窦、淋巴间隙以及其他部位的吞噬细胞也参与抗病毒感染。巨噬细胞病毒感染的作用取决于其阻止病毒在细胞内复制的能力。

吞噬细胞特别是巨噬细胞在抗病毒感染中的作用机制是十分复杂的，并且可能随病毒种类和动物机体的生理和免疫状态等因素的不同而不同。此外，还发现一些现象：①病毒粒子越大，越易被吞噬细胞吞噬（饮）；②巨噬细胞吞噬（饮）和破坏病毒—抗体复合物，比其吞噬（饮）和破坏单纯病毒粒子容易而且迅速；③吞噬(饮)过程可激发溶酶体大量产生酶类等。

3、宿主年龄和生理状态

机体对病毒的易感性与年龄有关，机体的营养状态影响皮肤和黏膜的屏障作用。

4、屏障作用

完整的皮肤、黏膜是抵抗病毒感染的第一道防线。皮肤汗腺分泌的汗液含乳酸，皮脂腺分泌脂肪酸，可有效防止病毒与易感细胞的接触。呼吸道黏膜上皮细胞的纤毛颤动可以防止直径5—10nm或更大的颗粒进入下呼吸道。鼻腔分泌物和唾液中含有脂多糖能使某些病毒灭活，酸性胃液可以杀死多种微生物。血—脑屏障能阻挡病毒自血流进入中枢神经系统。另外，血—胎屏障对保护胎儿的健康发挥着极大的作用。

5、干扰素和其他细胞因子

干扰素是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，其活性的发挥又受到细胞基因组的调节和控制，涉及RNA和蛋白质的合成。干扰素具有显著的抗病毒作用，是早期中断病毒复制，阻止病毒扩散的重要因素。

6、其他细胞因子

除了干扰素以外，机体内还存在有大量的其他细胞因子，它们在调节机体的免疫功能和抵抗病毒感染中发挥着重要的作用。

二、与B细胞和T细胞相关的抗病毒免疫

1、体液免疫

动物机体在受到病毒感染后，体液中可出现相应的特异性抗体。抗体具有重要的抗感染作用，给动物被动地输入抗体，可预防或治疗病毒性感染。在抗病毒免疫中起主要作用的是IgG、IgM和IgA。病毒感染后最先出现的是IgM，一般在感染后2—3d开始出现在血清中；当再次受相同抗原刺激，抗体急剧增加，主要以IgG为主。

  （1）中和抗体：抗体与病毒相互作用后，病毒的感染性降低或消失。抗体中和病毒以及最后破坏病毒的效能，决定于抗体的种类、抗体量与病毒量的比率以及宿主细胞如何处理病毒—抗体复合物等多种因素。一般来说，中和抗体能够中和胞外病毒，但不能进入细胞，中和胞内病毒。

中和抗体的作用机理尚不完全清楚，但多数学者认为与以下几点有关：①中和抗体与病毒结合后，通过立体构型改变而抑制病毒吸附和穿入细胞，从而使病毒丧失感染性；②抗体和病毒抗原凝集而形成大分子复合物，作为调理素，促进巨噬细胞对病毒粒子的吞噬和降解；③抗体可以与感染细胞表面的病毒抗原结合，通过激活具有抗体受体的细胞（如K细胞、多形核淋巴细胞和巨噬细胞）破坏病毒粒子。

  （2）血凝抑制抗体：表面含有血凝素的病毒感染机体后，体液中即出现可抑制智力凝现象的抗体。IgM、IgG均有血凝抑制抗体的活性，IgA则无此活性。乙型脑炎病毒、流感病毒等的血凝抑制抗体也能中和病毒的感染。血凝抑制抗体可能具有病毒中和作用，也可能没有病毒中和作用。

  （3）补体结合抗体：这种抗体由病毒内部抗原或病毒表面非中和抗原所诱发，不能中和病毒的感染性，但可发挥调理作用，增强巨噬细胞的吞噬功能。补体结合抗原多为可溶性抗原，有种属特异性而无型特异性，检测补体结合的抗体可协助诊断病毒性疾病。

对于抗体在抗病毒感染方面的作用尚有几点重要强调：首先，抗体只在病毒感染的早期才具有保护作用；其次，一般情况下，将纯化的抗体转移给试验动物使之获得抗病毒免疫较为困难；第三，某种抗体的体外中和能力可能与其体内的保护作用很少相关或不相关。总之，抗体是抗病毒免疫的重要成分，但却不能消除所有病毒的感染作用。

2、细胞免疫

在病毒感染中，特别是在病毒核酸整合于宿主细胞遗传物质以及病毒呈现细胞至细胞方式传播的情况下，由于病毒接触不到体液抗体，体液免疫作用不明显，细胞免疫就成为最主要的免疫因素。

虽然抗体有中和病毒的能力，但一般来说细胞免疫在抗病毒感染中起着重要的作用。因为病毒进入宿主细胞后，体液免疫的抗体分子因不能进入其内而使作用受到，这时主要依赖细胞免疫发挥作用。参与抗病毒感染的细胞免疫主要有：①被抗原致敏的细胞毒T细胞能特异性地识别病毒和感染细胞表面的病毒抗原，杀伤病毒或裂解感染细胞；②致敏T细胞（Td）释放淋巴因子，或直接破坏病毒，或增强巨噬细胞吞噬或破坏病毒的活力，或分泌干扰素抑制病毒的复制；③杀伤细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒（ADCC）作用；④在干扰素激活下自然杀伤细胞识别和破坏异常细胞。

三、病毒逃逸机体免疫反应的方式

病毒逃逸机体免疫反应的机制有：①通过抗原变异或产生大量血清型不同的病毒株，如流感病毒和鼻病毒；②通过抑制免疫应答：某些病毒可以感染免疫系统导致特异性免疫抑制，如人免疫缺陷病毒和鸡网状内皮增生病病毒能抑制机体免疫应答；③通过诱导免疫耐受：大多是由于先天或幼龄感染后导致部分免疫耐受，如巨细胞病毒、恒河猴病毒、风疹病毒、乙肝病毒等先天或新生儿期感染等；④通过免疫选择和抗原改变：有实验发现，对免疫监视敏感的病毒被消灭，而不敏感的病毒存活下来，这种现象称为免疫选择。

病毒逃逸免疫应答，既是造成病毒持续感染的重要原因，也是病毒保持其致病性的一种方式，最常见的最隐藏在细胞内：①将病毒基因整合进宿主细胞染色体；②使感染细胞膜上的病毒抗原表达减少，如亚急性硬化性全脑炎病毒；③以特殊方式潜伏于细胞内，如恒河猴病毒、水痘带状疱疹病毒。

小鼠在发生脉络丛性脑膜炎（HCMV）感染时可通过影响MHCI类分子提呈抗原的多重病毒特异性基因功能的表达，逃避MHCI类分子的免疫性控制。这些病毒基因并非病毒复制所必需，它们的共同特性是能使细胞膜上MHCI类分子缺失，从而使细胞毒T淋巴细胞不能识别感染细胞，而使病毒得以增殖。

四、病毒引起的免疫病理

机体的免疫反应在清除病毒感染过程中也可引起组织的免疫损伤，这种现象称为免疫病理。在某些病毒感染过程中，这种免疫损伤比病毒本身引起的组织损伤更为严重。病毒引起的免疫病理产生机制和实例见表8-1

表8-1 病毒免疫病理产生机制和实例

在抗感染免疫过程中，由于各种病原微生物的性质以及致病机理不同，机体对其免疫反应也各有特点。

一、抗胞外菌免疫

胞外菌通常引起急性侵袭性感染，主要的致病性胞外菌有革兰氏阳性球菌中的葡萄球菌、链球菌，革兰氏阴性球菌中的脑膜炎球菌和淋球菌，革兰氏阴性杆菌（如肠道细菌中的志贺氏菌、霍乱弧菌、致病性大肠杆菌）以及某些革兰氏阳性杆菌（特别是厌氧菌，如梭状芽孢杆菌属的细菌）。抗胞外菌感染免疫是一种抗体、补体、溶菌酶和吞噬细胞相互协同的以体液免疫为主的免疫反应。

1. 天然免疫  抗胞外菌的天然免疫主要是通过中性粒细胞、单核细胞和组织中巨噬细胞的吞噬作用而实现的。吞噬过程发生之前，细菌必须首先附着于吞噬细胞膜的表面。细菌与吞噬细胞接触后，吞噬细胞伸出伪足并将细菌包绕形成吞噬体。接着吞噬体离开细胞的边缘部并向胞浆中部移动，当遇到溶酶体时，两者融合成为吞噬溶酶体。溶酶体中含有的多种酶类和杀菌物质，如水解酶、酸性磷酸酶和髓过氧化物酶等，即可对细菌进行杀灭。

细菌抵抗细胞吞噬和消化的能力是其毒力的重要决定因素。当机体缺乏特异性抗体时，补体系统的激活，对消灭细菌也有着重要的作用。在无抗体存在时，革兰氏阳性菌的胞壁肽聚糖或革兰氏阴性菌的脂多糖均可激活补体替代途径。脂多糖能刺激巨噬细胞、血管内皮细胞等产生TNF-α、IL-1、IL-6及趋化因子，诱发局部炎症以清除病菌。细胞因子中的IL-12能诱导辅助性T细胞（Th1）的分化和活化细胞毒性T细胞与天然杀伤细胞，从而在天然免疫和获得性免疫的协调中起重要作用。

2.免疫调理作用  有些毒力较强的细菌，因为有荚膜多糖和其他表面结构（表9-2），可以抵抗吞噬。这就需要抗体、补体等介导的免疫调理作用来增强吞噬细胞对这类病菌的吞噬降解。

表8-2 病菌的抗吞噬表面因子

动物的中性粒细胞和单核—巨噬细胞的细胞膜上还具有C3b受体。在有补体存在时，细菌与所有能结合补体的抗体（IgG或IgM）形成的复合物均能发挥免疫调理作用。

（2）免疫粘连介导的免疫调理作用：动物体内的红细胞、血小板和某些淋巴细胞的表面均具有C3b受体。免疫粘连是指抗原—抗体复合物激活补体以后，通过C3b黏附到红细胞或血小板的表面，使抗原—抗体复合物成为较大的复合物，使其更易被体内网状内皮系统的细胞及其他吞噬细胞吞噬消灭。

（3）通过清除细菌产物的封闭活性起调理作用：葡萄球菌A蛋白（SPA）对IgG的Fc片段有较强的非特异性亲和力，如果SPA与结合在细菌表面的抗体Fc片段结合后，就会抑制抗体或补体介导的免疫调理作用。如果用抗SPA的抗体与SPA结合，抗体或补体介导的免疫调理作用就不会受到相应的抑制。

3. 溶菌或杀菌作用  未被吞噬的病菌通常被抗体、补体和溶菌酶介导的杀菌作用所杀灭。抗体和补体共同介导的溶菌现象主要见于革兰氏阴性菌所致的感染，如霍乱弧菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌等。

溶菌酶是一种碱性蛋白质，在有机体内分布很广，尤以乳汁、唾液、泪液、肠液以及吞噬细胞的溶酶体颗粒内含量丰富，而组织中含量很少。溶菌酶不仅能够辅助革兰氏阴性菌的溶解，而且在没有抗体存在的情况下也能够溶解革兰氏阴性菌，而革兰氏阳性菌对抗体和补体共同介导的溶菌作用具有一定的抵抗力。

4. 对病菌繁殖的抑制  抗体对细菌繁殖的抑制作用是指特异性抗体同相应的病菌结合后，可以通过抑制细菌重要的酶系统或代谢途径而抑制病菌的生长繁殖。例如，大肠杆菌能产生一种肠鳌素，它能与中性粒细胞特殊颗粒内的乳铁蛋白竞争铁，以供细菌生存之需，但是特异性抗体却能抑制肠鳌素的这种作用，使与抗体结合的病菌生长受到抑制，且容易被中性粒细胞所杀死。

感染系指病原体侵入机体，在体内繁殖，释放出毒素和酶，或侵入细胞组织，引起细胞组织以至器官发生病理变化的过程。这一过程同时也交织着机体的免疫应答和非特异防卫功能。当非特异性免疫不能阻止侵入的病原体生长繁殖并加以消灭时，对该病原体的特异性免疫即逐渐形成，这就大大加强了机体抗感染的能力，使感染向有利于机体的方向转化，直到感染中止。感染与免疫的关系有时是极为复杂的，感染激发免疫，免疫中止感染。但有时感染可以抑制免疫，导致继发性感染的发生，而抗感染免疫本身也可导致组织损伤，引起免疫病理过程。

一、抗细菌感染免疫

（一）细菌抗原和细菌感染的致病机理

细菌一般以释放毒素或借侵入和增殖引起宿主细胞的物理性破坏而致病。决定细菌致病力的主要因素是侵袭力和毒素。

1. 侵袭力  侵袭力是指病原菌突破机体的防御屏障，在体内定殖、繁殖和扩散的能力与侵袭力有关的因素包括以下几个方面：

 定殖  细菌感染的首要条件是能在一定部位定殖，牢固黏附于黏膜上，以抵抗黏液的冲刷、呼吸道纤毛运动及肠蠕动等清除作用。革兰氏阴性菌的菌毛、革兰氏阳性菌的脂磷壁酸及某些细菌的外膜蛋白等均可发挥黏附作用。

繁殖扩散  某些致病菌在体内产生一些具有侵袭性的酶，从而引起繁殖扩散。如致病性链球菌和葡萄球菌产生的透明质酸酶，能分解结缔组织中的透明质酸，从而使细菌得以通过组织扩散；溶血性链球菌产生的链激酶，可激活血浆纤溶酶原使之转变为纤溶酶，促进细菌和毒索扩散；某些细菌通过其分泌蛋白水解酶的作用，侵入细胞组织;一些细菌分泌胶原酶和弹性蛋白酶，以破坏结缔组织中的胶原纤维和弹性纤维等。

抗吞噬或逃避宿主的防御机制：

 (1)借助英膜及类英膜物质抵抗春噬细胞6t各噬杀6  如肺炎双球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏苗等均可产生糖被胺(8I邵ocalyx)英脂以抵抗吞噬作用》

 (2)通过自茁胞壁特殊6构抵抗各噬自胞d6各噬作g  如结核分支杆茵虽然能被E噬细胞吞噬，但由于其细胞壁含有蜡质等特殊结构，能抵抗细胞内障解，进而在巨噬细胞中增殖并随这些细胞散布到全身各处；酿肋链球菌可通过其细胞壁M蛋白抵抗吞噬细胞的吞噬作用。

 (3)通过分泌毒素或蛋白酶等物质，抑制吞噬细胞的吞噬作用或直接杀伤吞噬细胞  如大肠杆菌、结核分支杆菌、绿脓假单胞菌等均能分泌一种抑制噬中性白细胞吞噬作用的因子：溶血性巴氏杆菌分泌的毒素，能杀死反刍动物肺泡巨噬细胞和绵羊淋巴细胞；链球菌溶血素能裂解噬中性白细胞等。

 (4)有些细菌可通过抗原伪装或抗原变异，或分泌蛋白酶降解兔疫球蛋白，或通过脂多糖(LPS)、外膜蛋白、荚膜及S层的作用等方式逃避机体的免疫应答  如致病性金黄色葡萄球菌通过产生血浆凝固酶，使血浆纤维蛋白原转变为纤维蛋白，从而使凝固的血浆沉积于菌体表面或病灶周围，保护细菌不被吞杀或机体免疫机制所识别；金黄色葡萄球菌还可以通过A蛋白与IgG的Fc片段结合，阻止免疫球蛋白与巨噬细胞表面受体的结合，以抑制调理吞噬作用；伤寒沙门氏菌通过Rck基因阻止攻膜复合体(MAC)插入细菌外膜，从而抵抗补体介导的溶菌作用；流感嗜血秆菌能产生水解IgA的蛋白酶，肺炎链球菌、绿脓假单胞菌能产生破坏IL-2的蛋白酶等。

(二)毒素  细菌毒素按其来源、性质和作用等的不同，可分为外毒素和内毒素。

外毒素  是某些病原菌在生长繁殖过程中产生的对宿主细胞有毒性作用的可溶性蛋白质。许多革兰氏阳性菌如破伤风杆菌、炭疽杆菌、肉毒梭菌、葡萄球菌、链球菌等，以及部分革兰氏阴性菌如大肠杆菌、霍乱弧菌、铜绿假单胞菌、气单胞菌等均能产生外毒素。外毒素毒性极强，只需极小量即可致动物死，同时具有高度的组织特异性。按其作用机理可分为细胞毒素、神经毒素和肠毒素3大类。多数外毒素由A，B两种亚单位组成，A亚单位为毒性单位，B亚单位为结合单位，A亚单位需要B亚单位协助才能进入靶细胞内，继而发挥其毒性作用。外毒素具有良好的免疫原性，可刺激机体产生高滴度的抗毒素。

（细菌的主要结构成分是细胞浆和细胞膜。绝大多数细菌的细胞膜之外覆有细胞壁，有些细菌还包有一层荚膜；有些还有鞭毛和菌毛，它们都是重要的细菌抗原。细菌细胞浆为含有酶和核蛋白的复杂混合物，其中很多具有抗原性。但因为它们位于细菌内部，在刺激免疫反应方面通常不如外表抗原重要。细胞壁在革兰氏阳性细菌大部分是蛋白质，在革兰氏阴性细菌是多糖—脂类—蛋白质结构。革兰氏阴性细菌的细胞壁抗原是有毒的（通常称为内毒素），总称为O抗原。细菌荚膜可以为多糖或蛋白质。细菌鞭毛由蛋白质构成，因此抗原性很强，称为H抗原。另一类重要的细菌抗原是外毒素，它们是由革兰氏阳性细菌细胞浆分泌的蛋白质。外毒素的免疫原性很强，易于被抗毒素中和。

细菌感染引起疾病的机理有多种，一般说他们或者释放毒素，或者通过侵入和繁殖，引起宿主细胞物理性破坏。细菌的毒素可分为两类，一类是从细菌内部分泌出来的外毒素，如破伤风毒素、白喉毒素等；一类是从革兰氏阴性细菌细胞壁得来的内毒素，如沙门氏杆菌的内毒素。细菌感染有细胞外和细胞内之分。细胞外感染是指某种病原菌，如葡萄球菌、链球菌、巴氏杆菌、炭疽杆菌等，它们在吞噬细胞之外繁殖，引起急性感染。它们大多具有能抵抗吞噬细胞的表面结构和酶，如荚膜、溶血性链球菌的粘蛋白、伤寒杆菌的Vi抗原、金色葡萄球菌的凝血浆酶等。另外，还有一类细胞外菌，它们的侵袭力很弱，但能产生毒力很强的外毒素，所致疾病主要由外毒素毒性作用所致，如破伤风、白喉等。

细胞内感染是指某些细菌如结核杆菌、布氏杆菌、鼻疽杆菌等，在被吞噬后能抵抗吞噬细胞的杀菌作用，它们在吞噬细胞内能长期生存，甚至繁殖，不仅可利用吞噬细胞作为运输工具散布到其他部位，还可逃避体液因子和药物的作用。此类感染多为慢性感染。）

细菌感染的发病机理不同，机体抗感染的特异性免疫机理也不同。机体抗细菌感染免疫的主要机理见表

表7-1 抗菌免疫机理的分类

对细胞外细菌感染的免疫以多形核白细胞的吞噬作用以及抗体和补体的调理吞噬作用和溶菌作用为主。以毒素致病者则以抗毒素的中和作用为主。从特异性免疫的角度来看，抗御胞外菌侵袭主要依靠体液免疫。

1. 溶菌或杀菌作用  未被吞噬的细菌通常被体液中的杀菌因素所杀灭。血清中的杀菌活性主要由抗体、补体和溶菌酶介导。抗体与细菌表面抗原结合后，可以激活补体，引起和溶血反应一样的细胞膜的损伤。但对很多革兰氏阴性细菌来说，这一作用还不足以杀灭和溶解它们，如果同时结合溶菌酶作用，破坏细菌表层的粘多糖，则补体的作用能直接达到细胞膜上，导致细菌溶解。

一些革兰氏阴性菌及其产物，如多糖内毒素，能通过备解素途径激活补体而不需要抗体参加，此旁路途径为抵抗细菌感染提供了早期（抗体产生以前）的防御能力。

2. 调理吞噬作用

对有荚膜的细菌，抗体直接作用于荚膜抗原，使其失去抗吞噬能力，易被吞噬细胞所吞噬和消化。对无荚膜的细菌，抗体作用于O抗原，通过IgG的Fc段与巨噬细胞上的Fc受体结合，以促进其吞噬活性。与细菌结合的抗体（IgG和IgM）又可活化补体，并通过活化的补体成分C3与巨噬细胞表面的C3受体结合，也可增加其吞噬作用。

3. 中和作用

细菌的外毒素和有致病作用的酶均可被相应的抗体（抗毒素）所中和而失去活性。外毒素都由A、B两个亚单位组成。B亚单位负责与细胞受体结合，A亚单位则是毒素的活性中心。A亚单位必须靠B亚单位才能进入细胞发挥作用。毒素和细胞结合后可分解为A、B两个片段，它们有各自的抗原决定簇，抗毒素血清是毒素分子各部位特异性抗体的混合物。天然毒素的A亚单位的抗原决定簇位于深层，不易刺激机体产生抗体，因此，抗毒素的作用主要是阻止毒素与宿主感受细胞上的受体结合。受体与抗毒素可竞相与毒素相结合，如毒素首先与细胞受体结合，则抗毒素的作用无法使其逆转。因此，掌握抗毒素的剂量和应用时机，在毒素性疾病的治疗中具有重要作用，如破伤风、白喉、肉毒中毒等疾病及时和合理地使用抗毒素治疗都是十分有效的。

粘膜表面的分泌性IgA在阻止细菌吸附于上皮细胞，在粘膜抗感染中起着重要作用。如肠道致病性大肠杆菌带有的K88或K99等菌毛抗原，能使菌体粘附于肠绒毛上皮而致病。K88或K99抗体则可阻止肠道致病性大肠杆菌对肠绒毛上皮的粘附，从而保护仔猪免于致死性黄痢的感染。

不少病原菌的致病因素不是单一的。因此，免疫防御机制也往往是综合性的，即多因素联合作用。如炭疽杆菌是一个典型的细胞外侵袭菌，它既具有侵袭性因子—荚膜，又能分泌外毒素。抗毒素免疫虽然对本病有保护作用，但由于此种免疫功能形成较迟，对有荚膜的炭疽杆菌来说，吞噬细胞不能其侵袭和产生毒素。因此，对没有免疫的动物来说，炭疽感染常招致急性死亡。疫苗通常用不形成荚膜的而能产生毒素的菌株制造，即炭疽芽胞苗。由于该菌株不带荚膜，吞噬细胞在其毒素的产生还没有达到危险水平以前就控制了细菌的生长，而产生的毒素刺激了抗毒素的产生，使动物获得了对再次攻击的免疫力。

就抗体的保护作用来说，在调理吞噬作用中，IgM的作用大于IgG500—1000倍；在补体介导的溶菌作用中，IgM的作用比IgG大100倍。因此，在初次免疫反应期间，体液中IgM的量虽然较少，但以其质的优越弥补了量的不足，在感染的早期可提供有效的保护作用。

（三）细胞内细菌感染免疫

在兽医上重要的胞内菌有布氏杆菌、结核杆菌、李氏杆菌和马鼻疽杆菌等。某些棒状杆菌和沙门氏菌亦为胞内菌。对这些病原体的防御主要依靠细胞免疫，体液免疫起的作用不大。死菌苗对此类病原体常不能引起足够的保护性免疫。被动输入抗血清也不能获得良好的保护力。这是因为胞内菌寄居在细胞内，仅当细菌自细胞内释出而又未被吞噬细胞吞噬以前的片刻，抗体和其他体液因子才起作用。

显然，对此类病原体的抵抗能力主要来自细胞介导免疫。在正常情况下，未免疫动物的巨噬细胞不具有杀死此类病原体的能力。感染动物的巨噬细胞在感染后约10天左右就获得了此种能力，免疫的巨噬细胞在形态和生理上都发生显著的改变，细胞增大，代谢增强。这些变化本身是一种获得性细胞介导免疫的表现。在接触细菌抗原（可能是核糖核蛋白抗原）后，致敏T细胞放出多种淋巴因子武装或活化了巨噬细胞。此类巨噬细胞的反应相对来说是非特异性的。特别是李氏杆菌感染时，这些活化的巨噬细胞能杀灭多种通常对巨噬细胞有抵抗力的细菌。因此，单核细胞增多性李氏杆菌病康复的动物往往对结核病的抵抗力也显著增强。

对结核杆菌的免疫是抗胞内菌免疫的典型。结核菌无毒素，其致病力与细菌在单核巨噬细胞中存活和增殖的能力有关。原发感染可由呼吸道或消化道侵入，感染灶一经建立，细菌就繁殖和扩散，结核菌可在巨噬细胞内迅速繁殖，并且传播给其他巨噬细胞，还可经淋巴管或血流散播至全身，这一时期称为无免疫期。

感染后数周内，T细胞被致敏活化，释出淋巴因子，大量巨噬细胞被淋巴因子武装和活化，大量结核杆菌被活化的巨噬细胞所杀死，感染被控制。这一时期被称为免疫溶解期。最后是稳定期，恒定数量的活菌存在于巨噬细胞内。巨噬细胞看来有抑菌能力，可阻止细菌生长，但不能消除感染，从而导致长期的潜伏感染。此期没有任何临床表现，往往持续终生。

然而在一定情况下，如老年、激素治疗、虚弱性疾病使免疫功能低下时，结核可重新活动起来。活动性结核可以转而抑制宿主的免疫系统。结核菌的很多成分均有抑制宿主免疫因子的作用。如索状因子可抑制白细胞移动，刺激肉芽的形成；高分子脂类和蜡质能对抗补体和巨噬细胞的杀菌作用；蜡质D可引起过敏反应等。因此，重症的结核患者多表现细胞免疫的显著抑制，可测定出细胞免疫指标低下，不出现迟发型变态反应。

T细胞对结核的致敏通常是用对结核菌抗原的皮肤迟发型变态反应为指标。皮试抗原已有几种不同制品，其中两种产品应用最广，一为旧结核菌素（OT），一为纯化蛋白衍生物（PPD）。OT试验阳性是衡量是否感染结核的良好指标，但不一定反映对感染有免疫性。这是因为：①动物可对结核菌素脱敏以至皮试转阴，但仍保留其免疫性；②从未接触过结核菌的动物，某些抗原可使其对OT表现阳性，但并不赋予其对结核感染的免疫性；③结核抗原能用于诱导对结核的特异性免疫，而不产生迟发型变态反应。

另一方面，由于活动性结核患者经常表现细胞免疫功能抑制，OT皮试呈假阴性，所以OT阴性，并不排除活动性结核的存在。

卡介苗（BCG）已证明对结核免疫十分有效，动物接受疫苗后可出现OT阳性，但它与强毒结核菌不同，最终可从体内排除，皮肤反应可以消失。但这种结核菌素反应转阴并不说明免疫消失，疫苗提供的保护仍可保持。

二、抗真菌感染免疫

真菌的致病作用，包括能在侵入部位建立局部性感染如皮霉所致的皮肤、角质、被毛感染，或能广泛侵袭引起全身性感染，真菌在体内主要依靠顽强的增殖力及产生破坏性酶及毒素破坏易感组织。真菌侵入，如果机体的防御机能不健全或受到抑制时，则导致慢性经过，于局部形成肉芽肿及溃疡性坏死，并可产生迟发型变态反应。

真菌感染后，可遭受机体非特异性和特异性免疫力的防御。

 （一）非特异性免疫作用  完整的皮肤及黏膜可抗御真菌侵犯，皮肤分泌的脂肪酸有抗真菌的作用；阴道分泌的酸性分泌物也有抑制真菌的作用。真菌一旦进入体内后，可经旁路途径激活补体，吸引嗜中性粒细胞至感染部位，对入侵真菌行使吞噬作用；但粒细胞不能完全吞噬侵入的真菌，真菌尚能在细胞内增殖，刺激组织增生，引起细胞浸润，形成肉芽肿。小的真菌片段或孢子可由巨噬细胞或NK细胞吞噬杀灭。

（二）特异性免疫作用  真菌在深部感染中，由于真菌抗原的刺激，可以产生特异性抗体及细胞免疫予以对抗，其中以细胞免疫力较为重要。致敏淋巴细胞遇到真菌时，可以释放细胞因子，招引吞噬细胞和加强吞噬细胞消灭真菌，产生迟发型变态反应。

  总之，对真菌免疫的了解，较之对细菌和病毒免疫还相差甚远，对它的免疫机理只是略知大概。

  三、抗寄生虫感染免疫

  寄生虫的结构、组成和生活史比微生物复杂得多，因此宿主对寄生虫感染的免疫反应也是多种多样，有多种表现形式，早期的研究者认为，寄生虫的免疫原性不良，抗原性很弱，其实不然，多数寄生虫是有充分抗原性的，但在对寄生生活的适应过程中，它们发展了许多使其在免疫应答的存在下得以生存的机制，也就是大部分寄生虫在长期进化中，都获得了逃避宿主免疫应答的机制，如某些寄生虫产生免疫抑制作用，或者改变自身抗原性，或者自身吸附宿主的血清蛋白，或红细胞抗原呈抗原隐蔽状态等等。所以，对寄生虫感染的免疫和其他病原体一样，也表现为体液免疫和细胞免疫。

 （一）对原虫的免疫  原虫是单细胞动物，其免疫原性的强弱取决于入侵宿主组织的程度。例如，肠道的痢疾阿米巴原虫，只有当它们侵入肠壁组织后，才激发抗体的产生。引起弓形体病的龚地弓形体，在滋养体阶段，其寄生性几乎完全没有种的特异性，能感染所有哺乳动物和多种鸟类。

1. 非特异性免疫防御机制  抵抗原虫的非特异性免疫机制尚不十分清楚，但通常认为这种机制在性质上与细菌性和病毒性疾病中的机制相似。种的影响可能是最重要的因素，例如路氏锥虫仅见于大鼠，而肌肉锥虫仅见于小鼠，两者都不引起疾病；布氏锥虫、刚果锥虫和活泼锥虫对东非野生蹄兽不致病；但对家养牛毒力很大。这种种属的差异可能与长期选择有关，由动物的遗传性能决定对原虫病的抵抗力。在这方面，研究得最透彻的就是镰刀状细胞贫血病。

2. 特异性免疫防御机制  大多数寄生虫具有完全的抗原性，当它适应寄生生活时，逐渐能形成抵抗免疫反应的机制，故而能赖以生存。原虫既能刺激机体产生体液免疫，又能刺激细胞免疫应答。抗体通常作用于血液和组织液中游离生活的原虫，而细胞免疫则主要针对细胞内寄生的原虫。

 抗体对原虫作用的机制与其他颗粒性抗原相类似，针对原虫表面抗原的血清抗体能调理、凝聚或使原虫不能活动；抗体和补体以及细胞毒性细胞一起杀死这些原虫。有的抗体(称抑殖素ablastin)能抑制原虫的酶，从而使其不能增殖。

龚地弓形体和小泰勒焦虫的免疫应答主要为细胞介导免疫。因为这些原虫为专性细胞内寄生，所以抗体与补体联合作用能消灭体液中的游离原虫，但对细胞内的寄生虫则很少或没有影响，对细胞内的原虫是由细胞介导的免疫应答加以破坏，其机理与结核杆菌的免疫应答相类似。

某些原虫病，加球虫病，其保护性免疫机制尚不十分清楚。鸡感染肠道寄生的巨形艾美耳球虫产生对感染有保护作用的免疫力，这种免疫力能抑制早侵袭期的滋养体在肠上皮细胞内的生长。免疫鸡血清中能检出巨形艾美耳球虫的抗体，免疫鸡的吞噬细胞对球虫孢子囊的吞噬能力增强。

（二）对蠕虫的免疫  蠕虫是多细胞动物，同一蠕虫在不同的发育阶段，既可有共同的抗原，也可有某一阶段的特异性抗原。高度适应的寄生蠕虫很少引起宿主强烈的免疫应答，它们很容易逃避宿主的免疫应答，所以如果这种寄生虫引起疾病，则这种疾病是很轻微的或不显临床症状的。只有当它们侵人不能充分适应的宿主体内，或者有异常大量的蠕虫寄生时，才会引起急性病的发生。

1. 非特异性免疫防御机制  影响蠕虫感染的因素多而复杂，不仅包括宿主方面的因素，而且也包括宿主体内其他蠕虫产生的因素。巳知存在种类和种间的竞争作用。这种竞争作用使蠕虫之间对寄生场所和营养的竞争，对动物体内蠕虫群体的数量和组成起着调节作用。

宿主方面影响蠕虫寄生的因素包括寄主的年龄、品种和性别。性别和年龄对蠕虫寄生的影响与激素有很大关系。动物的性周期是有季节性的，寄生虫的繁殖周期往往与宿主的繁殖周期相一致。例如，母羊粪便中的线虫在春季明显增多，这与母羊产羔和开始泌乳相—致。另外，遗传因素对蠕虫的抵抗力也有较大影响。

2. 特异性免疫防御机制  蠕虫在宿主体内以两种形式存在：一是以幼虫形成存在于组织中；二是以成虫形式寄生于胃肠道或呼吸道。虽然针对蠕虫抗原的免疫应答能产生常规的IgM，IgG和IgA类抗体，但参与抗蠕虫感染的免疫球蛋白主要是IgE。分叶核白细胞(PMN)、巨噬细胞和NK细胞可能参与对蠕虫的免疫，但主要的防护机制似乎是由嗜酸性粒细胞和肥大细胞介导的(这两种细胞表面都有与IgE结合的Fc受体)。在许多蠕虫感染中，血内IgE抗体显著增高，可以呈现I型变态反应，出现嗜酸性粒细胞增多、水肿、哮喘和荨麻疹性皮炎等。由IgE引起的局部过敏反应，可能有利于驱虫。蠕虫感染动物时，嗜碱性粒细胞和肥大细胞向感染部位集聚，当该虫抗原与吸附于这些细胞表面的IgE抗体相遇时，脱颗粒而释放出的血管活性胺，可导致肠管的强烈收缩，从而驱出虫体。除IgE外，其他免疫球蛋白也起着重要的作用。如嗜酸性粒细胞也有IgA受体，并曾显示当这些受体交联时释放它们的颗粒内容物。在脱颗粒时，嗜酸性粒细胞释放出效力强大的拮抗性化学物质和蛋白质，包括阳离子蛋白、神经毒素和过氧化氢，这些可能也有助于造成蠕虫栖息的有害环境。蠕虫感染通常使免疫系统朝向Th2应答，产生IgE，IgA以及TH2细胞因子和趋化因子。TH2细胞因子IL—3，IL—4和IL—5以及趋化因子对嗜酸性粒细胞和肥大细胞有趋化性。

细胞免疫通常对高度适应的寄生蠕虫不引起强烈的排斥反应。但其作用也是不可忽视的，致敏T淋巴细胞以两种机制抑制蠕虫的活性：

第1，通过迟发型变态反应将单核细胞吸引到幼虫侵袭的部位，诱发局部炎症反应。

第2，通过细胞毒性淋巴细胞的作用杀伤幼虫，在组织切片中可以看到许多大淋巴细胞吸附在正在移行的线虫幼虫上。

总之，各种病原体进人动物机体后，机体将发动一切抗感染免疫机制，以抵抗病原的感染，最大限度地保护自身组织器官不受外来病原的破坏。

第七章  抗原抗体反应

    抗体与相应抗原在体内或体外都能发生特异性结合，并根据抗原的性质，反应的条件和参与反应的因素等，表现出各种各样的反应，将其统称为免疫反应。在体内发生的免疫反应，主要是排斥异物，维持机体的正常生理平衡；在体外发生的免疫反应，又分体液免疫反应和细胞免疫反应，因为实施体液免疫反应，一般均采用血清进行，所以也称为血清学反应。

     血清学反应具有严格的特异性和较高的敏感性，因此可以利用抗原或抗体中已知放任何一方，去检查未知的另一方，作为传染病的辅助诊断或微生物的鉴定。本章所介绍的抗原一抗体反应，系指血清学反应。

第一节  概述

    一、血清学反应的一般规律

  （一）抗原与抗体的结合具有特异性  如破伤风抗毒素只与破伤风毒索相结合，不能与肉毒毒素结合。当有共同抗原成分存在时，则可出现交叉(类属)反应，如马流产沙门氏菌菌体抗原不仅能与抗马流产沙门氏菌血清结合，也熊与抗绵羊流产沙门氏菌血清和抗鼠伤寒沙门氏菌血清结合，同样绵羊流产沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌也能与抗马流产沙门氏菌血清结合，只不过反应强度轻微罢了。

   （二）抗原与抗体是分子表面的结合  抗原与抗体的结合虽然相当稳定，但却是表面的结合，而且是可逆的，二者仍可分开，如将二者分开后，抗原或抗体的性质仍不改变。如细菌与相应抗体在试管中出现凝集，被凝集的细菌不一定死亡，若培养仍可生长；又如毒素与相应抗毒素结合后，毒性虽被中和，但经稀释或冻融后，使二者分离，则毒素又可重现毒性。

   （三）抗原与抗体是按一定的分子比例结台  抗体除IgM具有10个结合点(10价)，分泌型IgA有4个结合点外，一般抗体均含有2个结合点(即2价抗体)。抗原则根据其分子的大小，含有10～50个结合点不等，有的甚至超过200个结合点。当抗原抗体比例最适合时，结合最充分，形成的复合物最多，反应最明显，结果出现的最快，此称为等价带。如果二者比例不合适，如抗体过剩时，就有多余的未被结合的抗体游离于上清液中，不能形成大的网格状结构，只能形成小分子的复合物，则不出现肉眼可见的反应，此称为抗体过剩带。同样，当抗原过剩时，就有多余的末被结合的抗原游离于上清液中，也不能形成大的网状结构，只能成为小分子复合物，因此也不能出现肉眼可见的反应，称此为抗原过剩带。

     在做试管定量凝集反应时，如果前面的几支试管不出现凝集，是由于抗体过剩引起的，称为抗体过剩带或前凝集带，简称前带现象。后面的几支试管不出现凝集，是由于抗原过剩所致，称为抗原过剩带或后凝集带，简称后带现象，这种现象是正常的。

    在做试管定量沉淀反应时，前面的几支试管不出现反应，是由于抗原过剩引起的，称为抗原过剩带或前沉淀带，简称前带现象。后面的几支试管不出现反应，是由于抗体过剩引起的，称为抗体过剩带或后沉淀带，简称后带现象。

由上可见，同是前带现象，对凝策反应来说，是由抗体过剩引起的；对沉淀反应来说，是由抗原过剩引起的。

（四）抗原与抗体反应可分为两个阶段  第一阶段为抗原与抗体的特异结合阶段，反应发生快，于几秒钟至几分钟即可完成，但无可见反应出现。第二阶段为抗原与抗体反应的可见阶段，表现为沉淀、凝集、补体结合、溶解、粘连或排斥等，这一反应阶段有两个特点，一是反应进行较慢，需要几分钟、几十分钟或更久，若参加反应的抗原为简单半抗原，或者抗体是不完全抗体，或者抗原与抗体的比例不合适，则不出现可见反应，其二是受电解质、温度、酸碱度等因素的影响。实际上，以上两个阶段往往是重叠的，不能严格的分开。

 （五）抗原与抗体反应具有高度的敏感性  抗原与抗体反应不仅具有高度的特异性，而且还有高度的敏感性，不仅可用于定性，还可以检测极微量的抗原或抗体，其敏感程度大大的超过当前所应用的化学方法，其敏感性视反应的种类而不同。

二、影响抗原、抗体反应的因素

（一）电解质  适当浓度的电解质能降低抗原抗体结合物表面的阴电荷，失去相互排斥的能力，呈现沉淀或凝集反应。常用的电解质是氯化钠，最适浓度为0.85～0.9％，如无电解质存在，则不出现可见反应。在补体结合反应或溶血反应时，在稀释液中加入少量的Ca2+和Mg2+，能加强补体活性。

（二）温度  反应的温度与反应速度有密切关系，温度高时，反应速度加快，一般常放在37℃水浴箱或恒温箱中感作，放水浴箱中时，箱中的水面勿高出试管内液面，以利试管内液体的对流，增加抗原与抗体间的接触。反应温度超过56℃时，反应速度往往降低，温度升高到56—60℃时，抗原一抗体的结合物易发生解离。

  有些反应如病毒性补体结合反应等也可在4℃条件下进行，反应速度虽减缓，但作用完全，显得更为敏感些。

 （三）pH值  大多数抗原抗体反应的最适宜氢离子浓度为pH值6—8。当pH值降至3左右，到达或接近细菌抗原的等电点时，即便没有抗体存在，也可引起非特异性的酸凝集。在pH值2．5以下时，则可引起抗原一抗体复合物解离。

  （四）杂质异物  反应中如存在有与反应无关的蛋白质、类脂质、多糖等非特异性物质时，往往会抑制反应的进行，或引起非特异性反应。

第二节  抗原抗体反应的类型

按照反应的性质，可将血清学反应分为；凝聚性反应如凝集反应和沉淀反应等，有补体参与的反应如溶菌反应、溶血反应、补体结合反应、单扩散溶血反应、团集反应、免疫粘连红细胞凝集反应；与活体有关的中和试验如毒素一抗毒素中和反应、病毒一抗病毒血清中和反应；标记抗体技术如荧光抗体、酶标记抗体、同位素标记抗体、铁蛋白标记抗体等。上述血清反应，在近十余年来，凝聚性反应和标记抗体技术发展很快，其应用范围越来越广，已成为微生物学和免疫学领域研究的重要工具。

一、凝集反应

细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在电解质参与下，经过一定时间，抗原颗粒互相凝集成肉眼可见的小团块，称为凝集反应。参与反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素；就抗体的性质来说，主要是IgG和IgM。近些年来，为提高反应的敏感性，已由经典的直接凝集反应发展为有载体参与的间接凝集反应，它可用于可溶性抗原一抗体系统的检测。 

1．直接凝集反应  颗粒性抗原与凝集素直接结合，并呈现肉眼可见的凝集现象。按其操作方法有试管法、玻板法及玻片法三种，前两种系定量试验，通过检测血清中的抗体滴度，达到诊检布氏菌病等传染病的目的；后一种系定性试验，用标推诊断血清鉴定未知细菌。

2. 间接凝集反应  将可溶性抗原(抗体)先吸附于一种与免疫无关的、、一定大小的惰性颗粒状物体(裁体颗粒)表面上，制成所谓的固相抗原(抗体)，然后与相应抗体(抗原)作用，在有电解质存在的适宜条件下，载体即可发生明显地凝集，从而可显著地提高检测的敏感性，反应中的颗粒性载体起着“放大器”的作用。通常将这类血清反应称为间接(或被动)凝集反应。常用的载体有红细胞、聚苯乙烯乳胶、炭粉等。所以间接凝集反应根据所用载体的不同，又可分为间接红细胞凝集反应、间接乳胶凝集反应和间接炭凝集反应等。如果先将可溶性抗原与被抗体混合，间隔一定时间后，再加入抗原致敏的红细胞，因标本中的抗体已被先加入的抗原结合，抗原致敏的红细胞则不能再与被检标本中的抗体发生凝集现象，此称为间接红细胞凝集抑制试验。

间接凝集反应具有特异、敏感、快速、简便、使用方便等优点，故在抗原、抗体及激素、酶等的检测中，已广泛应用。

3．协同凝集反应   99％以上的金黄色葡萄球菌的细胞壁上均含有A蛋白，其含量因菌株不同而相差悬殊。Forsgren和Sioquist于1966年提出，SPA可与人和大多数哺乳动物血清(两栖类、爬虫类、鱼类除外)中IgG的Fc片段发生非特异性结合，因为它不是抗原—抗体的结合，故将此种结合称为“假免疫反应”。Ig分子的Fc片段与金黄色葡萄球菌上的A蛋白结合后，Fab片段则暴露于外，并保持原来正常抗体的活性，当与特异性抗原相通时，便可发生结合，形成肉眼可见的小凝集块，此即所谓的协同凝集反应。该反应除保持标记抗体原来的特异性外，还具有更高的敏感性，不但可使颖粒性抗原，而且也能与可溶性抗原在2分钟内出现清晰的凝集现象。这种凝集反应属于反向间接凝集的范畴，不仅可以省去红细胞鞣酸化的麻烦，而且可以免去抗体纯化的手续，因SPA只能与IgG结合，所以它对免疫血清起着天然的纯化作用。

此外，也可从培养物中将SPA提出，以其替代第二抗体，进行ELISA或IFA等试验。    

目前国内已用此反应对流乙脑炎病毒、流感病毒、炭疽杆菌、链球菌、红斑丹毒丝菌、猪巴氏菌、沙门氏菌及钩端螺旋体的鉴定及分型。

4.  抗球蛋白凝集反应   作为抗体的免疫球蛋白分子对抗原来说，具有高度的特异性，同时它又具有良好的抗原性。应当注意的是，抗体球蛋白的抗原决定基只与该抗血清的动物来源有关，而与抗体的特异性无关，如用猪制备的IgG，不管是抗猪丹毒血清的IgG，还是正常猪血清的IgG，它们的抗原性完全相同，所以用正常猪血清免疫兔或羊所获得的兔抗猪或羊抗猪的IgG血清，即抗球蛋白血清，亦即抗体，它对只要是猪的或羊的IgG都有反应，不管是抗猪瘟IgG，抗猪丹毒IgG，抗羊布病IgG，还是正常猪或羊血清的IgG。

抗球蛋白血清消除在后述的间接荧光抗体染色法、酶联免疫收附试验间接法等技术中广泛应用外，还可直接用于下述的抗球蛋白试验。

机体受抗原刺激后，除产生完全抗体外，在免疫后期也可产生不完全抗体，它属于IgG、IgA或IgM。因为不完全抗体的体积小，长度短(250A)，只能与一个抗原的决定基结合，而不能同时再与另外一个抗原的决定基结合，因此不出现肉眼可见的凝集反应。Coombs等首先根据“抗体存在于球蛋白，球蛋白本身注入异种动物也是抗原”的原理，把产生不完全抗体的正常动物血清球蛋白，注射到异种动物体内，使之产生抗球蛋白抗体，将抗球蛋白抗体加到抗原与不完全抗体的复合物中，使它构成桥梁形式，从而出现直接可见的凝集反应，故这种反应也称为桥梁凝集反应。又因为这种反应是由Coombs等首先建立的，故也称为Coombs抗球蛋白凝集试验如图示。

二、沉淀反应

细菌外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等可溶性抗原与相应抗体结合，在电解质存在下，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应的抗原，可以是多糖、蛋白质或类脂等，由于抗原分子较小，单位体积内所含的量多，与抗体结合的总面积大，故在作定量试验时，为了不使其过剩，通常稀释抗原，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。参与沉淀反应的抗原称沉淀原，抗体称沉淀素。

沉淀反应可分为在液体中进行的液相沉淀反应（包括环状沉淀反应与絮状沉淀反应）和在琼脂凝胶中进行的固相琼脂扩散沉淀反应；琼脂扩散沉淀反应与电泳技术结合，又发展为免疫电泳、对流电泳和火箭电泳技术等，这些方法已在免疫化学研究中广泛地被应用。 

1．环状沉淀反应  往最小试管内先加入已知的诊断血清，然后小心地加入待检抗原于血清表面，成为分界清晰的两层，1分钟至数分钟后，于两层液面交界处出现白色沉淀环为阳性反应，否则为阴性反应。

在兽医临床上常用本反应协助诊断炭疽病。这个试验最先是由意大利学者Ascoli氏在1902年建立的，所以，也叫Ascoli氏反应。该反应的特异性较差。

在法医学上，常用本反应鉴别沾在衣服、纸张、墙壁、刀子等上面的微量血迹。为了证实它是人血、鸡血、狗血或羊血等，常采用环状沉淀反应作测定。试验时，将高效价的抗人、抗鸡、抗狗或抗羊等免疫血清分别加往反应管中，再用生理盐水洗下上述待检血迹溶液作为抗原，分别重叠于加有上述免疫血清的上面，如果和抗鸡免疫血清出现白色沉淀环，其他各管和对照管均阴性，则证明该血迹为鸡血。其他也如此。

此外，还可用此试验鉴别肉类的真伪，检查媒介昆虫的吸血习性等。

2．絮状沉淀反应   将抗原与相应抗体在试管内或凹玻片上泥匀，经过一定时间，如出现肉服可见的絮状或颗粒状的不溶性沉淀物，为阳性反应，如诊断梅毒的康氏反应及用标准类毒素测定抗毒素血清效价的絮状试验等。

3．琼脂扩散沉淀反应   所用琼脂凝胶含水量达99％左右，能允许分子星在20万以下物质自由通过，而多数抗原和抗体的分子量均在20万以下，故能在琼脂凝胶中自由扩散，当二者在琼脂凝胶中相遇，便在最适比例处产生沉淀物，因为沉淀物的分子较大，不能往外扩散；故形成肉眼明显可见的沉淀带，称为琼脂扩散沉淀反应。

琼脂扩散沉淀反应根极其扩散的方向，有单向扩散和双向扩散；根据抗原抗体二者是一方扩散，还是双方扩散，又有单扩散和双扩散之别。因此在实践中，琼脂扩散沉淀反应就有单向单扩散、单向双扩散、双向单扩散和双向双扩散4种类型。其中以双向单扩散和双向双扩朗应用范围较广，前者用于抗原定量或诊断鸡马立克氏病等，后者检测马传贫及分析抗原成分等。

4．免疫电泳  是将琼脂电泳和双向琼脂扩散结合起来，用于分析抗原组分的一种定性方法。试验时，先将待检抗原样品放在琼脂板的小孔中进行电泳，然后再于琼脂板上挖一横槽，加入已知相应的免疫血清，两者经一定时间的相互扩散后，在最适比例处形成沉淀弧，根据弧的数量、位置、外形等，即可分析样品中所含的成分及其性质。

 5．对流免疫电泳   将免疫血清置于靠近琼脂板正极的孔内，待检抗原置于靠近负极的孔内。通电后，由于待检的可溶性蛋白质抗原在碱性环境中(pH值8．6的巴比妥缓冲液中)带负电，则向正极呈直线移动；抗体为球蛋白，分子较大，移动较慢，同时受琼脂电渗的影响，则向负极移动，当二者在比例最适宜处相遇时，便形成白色沉淀线。可用本试验检测鼻疽、水貂阿留申病，或检查血清中的胎甲球蛋白，以诊断肝癌。

三、有补体参加的反应

补体是机体非特异性免疫的重要体液因素，分散存于体液内，在被激活以前，并不表现免疫活性，当与抗原和抗体的复合物结合时，便被活化，从而导致一系列的免疫反应。有补体参与的血清反应，可大致分为两类：一类是补体被激活后，直接引起的反应，如溶血反应、溶菌反应、免疫粘连红细胞凝集反应等，其中的溶血反应常作为补体结合反应中是否有游离补体存在的指示系统。另一类是补体与抗原抗体复合物结合后，不引起可见反应，但可用指示系统测定补体是否已被结合，从而间接地检测反应系统中是否存在抗原抗体复合物，如补体结合反应等。

（一）溶解反应  带有抗原的靶细胞与相应抗体结合后，如为无核细胞一红细胞则被溶解，如为有核细胞一肿瘤细胞，则被杀死，细菌则介于二者之间，少数被溶解，但多数则被杀伤而失去活力。它又包括以下两种反应，即溶血反应与溶菌反应。如红细胞与相应抗体结后合，在有电解质存在时，红细胞可被凝集，但当红细胞与特异性抗体（溶血素）结合后，在有补体存在时，则红细胞被溶解，此现象称为溶血反应，此反应通常用来作为补体结合反应中的指示系统。但当输血发生错误，血型不符时，在受者体内也能发生溶血反应。

若抗原为某些细菌，当与相应抗体结合后，在有补体存也的情形下，有时可发生溶菌反应。它是构成特异性免疫的保护性反应。

（二）补体结合反应  以是否溶血为标志，间接测定补体是否被待检的抗原一抗体复合物所消耗的一种反应，称为补体结合反应。如果不溶血称为补体结合反应阳性；发生溶血，则称为补体结合反应阴性。    

1．原理和基本方法  本反应包括两个系统，一为被检系统(溶菌系统)，包括已知的抗原(或抗体)、被检的抗体(或抗原)和补体；另一为指示系统(溶血系统)，包括绵羊红细胞和溶血素。操作时，先将被检系统的抗原、抗体及补体滴加于试管中，作用一定时间，然后加入指示系统，继续作用一定时间后，观察结果。如果不发生溶血，即为补体结合反应阳性，表示被检系统的抗原与抗体相对应，二者特异性结合后，消耗完了补体，故不溶血。反之，若出现溶血，则为补体结合反应阴性，表示被检系统中的抗原与抗体不相对应，或者二者缺少一个，补体未被消耗，故当加入绵羊红细胞和溶血素后，补体便被指示系统中的抗原抗体复合物结合，从而发生溶血反应如图示。

2．应用  由于补体结合反应具有高度的特异性和敏感性，虽然操作繁杂，目前在医疗实践中，应用仍然很广。

（1）用己知抗原诊断传染病  在兽医临床上常用于鼻疽、牛肺疫、布氏菌病、钩端螺旋体病、流行性乙型脑炎及锥虫病等的诊断。

（2）用已知抗体鉴定未知抗原  如流行性乙型脑炎病毒的鉴定和口蹄疫病毒的分型等可按此原则进行。

（三）固相补体结合反应  系根据直接补体结合反应的原理设计而成，只不过用琼脂糖凝胶代替生理盐水作介质实施反应，即将鼻疽抗原、被检血清与补体等量混合，放温箱中感作1小时后，取混合物满加于顶先制备好的含溶血素致敏绵羊红细胞的琼脂糖凝胶盘的相应孔中，与此同时，每份血清并须作一个不加抗原的对照孔，再置恒温箱中感作3小时，然后根据每份血清对照孔与试验孔之间发生的溶血环直径差的大小确定结果，凡在0.5mm以上者，判为鼻疽阳性。

（四）单扩散溶血反应   又称固相溶血试验，根据抗原与相应抗体相遇形成免疫复合物，通过传统途径激活补体，可以使绵羊红细胞发生溶血，其溶血程序与特异抗体滴度成正比的原理设计而成。即取用鼻疽抗原致敏的绵羊红细胞加入融化的琼脂糖凝胶中，混合均匀，浇注制成致敏的反应盘，打孔，随后将被检血清和补体等量混合后，加入到含抗原致敏的红细胞琼脂糖凝胶反应盘的孔中，于室温下感作3～4小时，阳性者，在孔的周围发生明显的溶血环，其直径在8.1mm以上。

（五）团集反应  此试验的原理与直接补体结合反应基本相同，只是以加热灭活的正常牛血清（称为团集素）替代补反中的溶血素，以新鲜马血清代替海猪血清为补体进行。试验时，将试验系统和指示系统先后加于试管中感作一定时间后，如果被检血清中没有与书籍抗原相应的抗体存在，绵羊红细胞则在新鲜马血清（补体）存在的条件下，可被团集素团集呈红色片状物，沉于反应管底部，为阴性反应。如果试验系统中有与已知抗原相应的抗体存在，则将新鲜马血清中的补体消耗掉，指示系统中的红细胞则不被团集，此为阳性反应。

  团集反应可用于鼻疽和牛肺疫等传染病的诊断。

（六）免疫粘连红细胞凝集反应   抗原—抗体复合物与补体的前四种成分C1、C4、C2、C3依次结合后，可形成抗原抗体—C复合物，被活化的C能与具有免疫粘连受体的指示细胞（如动物白细胞、血小板及灵长类的红细胞，也可用人的O型红细胞）发生粘连作用，这个试验系统极敏感，只要有少量的抗原—抗体复合物存在，就可通过补体系统的作用，使指示细胞发生肉眼可见的凝集。

  本试验，多作已知抗体检测分子量在几十万以上的巨分子蛋白质抗原，尤其是对病毒、类病毒最敏感，其敏感性比琼扩大1万倍，比对流电泳大500倍，比补反大40倍，检测的抗原如系颗粒性的，红细胞可粘附在它的周围，于显微镜下观察呈花瓣状。

  四、免疫标记技术

  免疫标记技术是指用荧光素、酶、放射性同位素、SPA、生物素—亲和素、胶体金等作为示踪物，对抗体或抗原标记后进行的抗原抗体反应，并借助于荧光显微镜、射线测定仪、酶标检测仪等精密仪器，对试验结果直接镜检观察或进行自动化测定。该法可以在细胞、亚细胞或分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定。因此，免疫标记技术在敏感性、特异性、精确性及应用范围等方面远远超过一般血清学方法。

  根据试验中所用标记物和检测方法不同，免疫标记技术分为免疫荧光技术、免疫酶技术、放射免疫技术、SPA免疫检测技术、生物素—亲和素免疫检测技术、胶体金免疫检测技术等。

 （一）免疫荧光技术：

  1. 原理  将具有荧光特性的荧光材料联结到提纯的抗体分子上，制成荧光抗体，荧光抗体同样保持特异性结合抗原的能力。当抗原与荧光抗体结合，在荧光显微镜下观察，即可对待检的抗原进行定性和定位测定。常用的荧光材料是异硫氰酸荧光素。

  2. 荧光抗体染色方法

（1）直接法：常用于检测病变组织中细菌、病毒抗原。即将荧光素直接标记在待检抗原的抗体上。此法的优点是简单、特异，缺点是检查每种抗原均需制备相应的特异性荧光抗原，且敏感性低于间接法。

（2）间接法：用荧光素标记抗球蛋白抗体（简称标记抗抗体）。试验分两步，首先将阳性抗体（第一抗体）加在待测抗原标本上，作用一定时间后，洗去未结合的抗体；然后滴加标记抗抗体，如果第一步中的抗原抗体已发生结合，此时加入的标记抗抗体就和已固定在抗原上的抗体分子结合，形成抗原—抗体—标记抗抗体复合物，并显示特异性荧光。此法的优点是敏感性高于直接法，而且只需制备一种荧光素标记的抗球蛋白抗体，就可用于检测同种动物对多种不同抗原的抗体系统。但缺点是间接法有时会产生非特异性荧光。

（二）免疫酶技术：

  免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶的高效催化作用相结合。

  该法的原理是将特定的酶联结于抗体分子上，制成酶标抗体，抗原抗体特异性结合，并通过酶对底物的高效催化作用而显色，从而对抗原（或抗体）进行定性、定位、定量测定。常用酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。常见的免疫酶技术有以下几种：

  1. 免疫酶组化染色技术  免疫酶组化染色技术与荧光抗体染色法基本相同，但每加一层，均需于37℃作用30min，然后以PBS反复洗涤3次，以除去未结合物。该法主要用于抗原的定性、定位测定。

（1）直接法：与荧光抗体的直接法相似。病理组织经冰冻切片或石蜡切片后，加酶标抗体染色标本，PBS冲洗，然后浸于含有相应底物和显色剂的反应液中，通过显色反应检测抗原抗体复合物的存在。本法优点是不需特殊的荧光显微镜设备，且标本可长期保存。

（2）间接法：同荧光抗体的间接法。标本用相应的阳性抗体染色后，PBS冲洗，再加入酶标记的抗球蛋白抗体，然后经显色显示抗原—抗体—抗抗体的存在。

（3）抗抗体搭桥法：本法不需事先制备标记抗体，是利用抗抗体既能与反应系统的抗体结合，又能与抗酶抗体结合（这两种抗体必须是同源的）的特性，以抗抗体做桥连接抗体和抗酶抗体。先加抗体（如兔抗血清）使之与标本上的抗原发生特异性结合，然后加抗抗体（羊抗兔血清）与抗体结合，再加既能与抗抗体结合又能与酶结合的兔抗酶抗体，随后加入酶，最后用底物显色。此法的优点是克服了因与抗体交联引起的抗体失活和标记抗体与非标记抗体对抗原的竞争，从而提高了敏感性；但抗酶抗体与酶之间的结合多为低亲和性，冲洗标本时易被洗脱，使敏感性降低。

（4）杂交抗体法：将特异性抗体分子与抗酶抗体分子经胰酶消化，使成双价F（ab）2片段，将这两种抗体的F（ab）2片按适当的比例混合，在低浓度的乙酰乙胺和充氮条件下，使之进一步裂解为单价Fab片，再在含氧条件下使其还原复合。经分子筛层析后，即可获得25%～50%的杂交抗体。这种杂交抗体分子含有两个抗原决定簇，一边能与特异性抗原结合，另一边能与酶结合。因此，不需事先准备标记抗体。试验时含抗原的标本直接用杂交抗体和酶处理，即可浸入底物溶液中，进行染色反应。本法步骤少，操作简便，但杂交抗体不易制备。

  2. 酶联免疫吸附试验  是将抗原或抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶染色，底物显色后用肉眼或酶联免疫测定仪判定结果的一种方法。因本法特异性高，敏感性强，不需特殊设备，一次可检测大批标品，48h出结果等优点，是当前发展最快、最容易，试剂盒也应用最广的一项新技术。

（三）放射免疫技术

（四）SPA免疫检测技术

（五）生物素—亲和素免疫检测技术

（六）胶体金免疫检测技术

第八章  免疫学在兽医学中的应用 

免疫学的理论和技术在生命科学中应用十分广泛。在兽医学中主要应用于动物传染病的免疫预防、诊断和治疗。兽医生物制品（Veterinary biological product）是按免疫学原理，利用微生物或其代谢产物研制和生产的预防、诊断、治疗传染病的生物制剂。兽医生物制品主要包括疫苗，诊断液和免疫血清。

第一节 兽医生物制品的概念、类型、特点及用途

    一、兽医生物制品的概念

    兽医生物制品(veterinary biological product)是利用微生物或其代谢产物研制和生产的用于预防、诊断、治疗传染病的生物制剂。兽医生物制品主要包括疫苗、诊断液和免疫血清。

  （一）疫苗(vaccine)  动物获得对某种传染病的免疫力可以通过4种途径：即天然主动获得，人工主动获得，天然被动获得和人工被动获得。其中最重要的途径是给动物人工接种疫苗，经过动物机体主动免疫应答获得免疫力。其次是给母畜母禽人工接种疫苗，幼畜从母畜的初乳(幼禽从卵黄)获得母源抗体，被动免疫。

用于给动物进行人工主动免疫的生物制品总称为疫苗。习惯上又将细菌、螺旋体、霉形的疫苗称为菌苗，病毒制的苗称为疫苗，细菌外毒素制的苗称为类毒素。

2、疫苗的种类

    疫苗已有200多年的历史，从弱毒疫苗至细胞疫苗然到分子水平疫苗的发展过程。目前已知的疫苗概括起来为活疫苗、死疫苗、代谢产物和亚单位疫苗，以及生物技术疫苗。其中生物技术疫苗包括基因工程重组亚单位疫苗、合成肽疫苗、抗独特型疫苗、基因工程重组活载体疫苗、基因缺失疫苗以及核酸疫苗等。

三、疫苗的特点和用途

（一）活疫苗：包括弱毒疫苗和异源疫苗两种。

 1、弱毒疫苗：是目前生产中使用的最广泛的疫苗种类，免疫期长、不用佐剂、疫苗毒力弱但保持着抗原性，不影响动物产品的品质。

 2、异源疫苗：是用具有共同保护性抗原的不同病毒制备成的疫苗。活疫苗使用会出现异种微生物或同种强毒污染的危险，经接种途径人为地传播疫病。

（2）灭活疫苗

灭活疫苗亦称死疫苗，是病原微生物经理化方法灭活后，仍然保持免疫原性，接种后使动物产生特异性抵抗力的疫苗。灭活疫苗的缺点是接种量大、免疫期短、需加入佐剂，优点是使用安全、易于保存。目前所使用的灭活疫苗有组织灭活疫苗、油佐剂灭活疫苗和氢氧化铝胶灭活疫苗等。

（3）提纯的大分子疫苗

  1、多糖蛋白结合疫苗

     多糖蛋白结合疫苗是指将多糖与蛋白载体结合制成疫苗，多糖抗原转变成为T细胞依赖性抗原，能诱导产生IgG和记忆淋巴细胞。

     2、类毒素疫苗

     类毒素疫苗是将外毒素经甲醛脱毒使其失去致病性而保留免疫原性的制剂。

     3、亚单位疫苗

     此类疫苗是从细菌或病毒粗抗原中分离提取某一种或几种具有免疫原性的生物学活性物质，除去免疫不必需的“杂质”，从而使疫苗更为纯净。

    基因重组亚单位疫苗：是用DNA重组技术，将编码病原微生物保护性抗原的基因导入原核细胞(如大肠杆菌)或真核细胞(如鸡胚成纤维细胞，CHO细胞)，使其在受体细胞中高效表达，分泌保护性抗原肽链。提取保护性抗原肽链，加入佐剂即制成基因工程重组亚单位疫苗(recombinant subunit vaccines)，又称为生物合成亚单位疫苗。

第二节 免疫学诊断

       一、慢性传染病的免疫学诊断

      布氏杆菌病、鸡白痢等慢性传染病，患病动物血清中存在特异抗体，定期采血，用诊断抗原，通过凝集反应，检出特异性抗体阳性的个体，称为定期检疫。有些动物，第一次检查，血清抗体结果可能不明显，列为可疑，这时可以过一段时间（半个月）后再次抽血检查，若抗体水平有明显提高，也可做出明确诊断，这种试验称为双份血清试验。

有些慢性传染病，则可用变应原做迟发型号变态反应试验进行检测。例如结核病，可定期给动物皮肤或眼结膜囊的结核菌素试验，检出患畜。

 二、对急性传染病的免疫学诊断

急性传染病发病争，有的甚至来不及产生典型症状，病畜已死亡，诊断时常以诊断抗体直接检查病料中存在的病原（抗原），或先分离培养病原，再用诊断抗体鉴定病原。

第3节 免疫预防

对动物，尤其是大群饲养动物的传染病应“防重于治”，采取“综合预防”措施，其中重要的一项是做好疫苗接种。为保证疫苗免疫的效果，应注意如下几个方面：

一、熟悉疫苗

疫苗种类多，各有优缺点。各种疫苗各有预防的疾病，针对的血清型，适用动物、品种、年龄，各有保存条件、保存期、接种剂量、途径，免疫期等。平时要注意了解、熟悉各种疫苗。应用时应切实遵照各种疫苗的说明操作。

3、选择疫苗

选择疫苗的原则是：

（4）本群或本地区的动物已有过流行，或受到威胁、可能发生流行的传染病，应选择相应疫苗，进行接种预防。对当地从未发生也不可能有流行的传染病，不必引进疫苗来接种，尤其不要引入那些毒力较强的疫苗或强毒苗，例如鸡的传染性喉气管炎强毒肛擦苗，这样将会引进并传播病原。即使引用弱毒苗或死苗，也将使以后发生的可疑疫病时的血清学诊断复杂化。

（5）对应该接种的疫苗也要根据动物品种、年龄、疫病流行情况，病原的血清型等选择合适的疫苗。

三、免疫程序

免疫程序是指一个乃至一群动物生长过程中应该接种的各种疫苗的最适计划。免疫程序必须根据本群动物或本地区疫病流行规律、动物品种、年龄、母源抗体水平，接种疫苗后抗体维持情况，动物健康状况，生产规律，疫苗种类、性质、免疫途径、剂量等因素综合考虑，科学制订。通常各种合法疫苗都有使用说明，国家各级动物防疫部门尤其对各种重大动物疫病的疫苗免疫程序都有指导，最好对饲养的动物群建立免疫监测制度，根据监测的母源抗体变化情况，疫苗免疫后的抗体变化情况对免疫程序做科学调整。

四、检查免疫效果

1、动物方面  母源抗体或前次免疫的抗体水平还很高时接种疫苗，抗体与疫苗结合，相互起消除作用；营养不良或处于应激状态，免疫应答功能降低；患过损伤免疫系统的疾病，对疫苗丧失免疫应答；已潜伏感染强毒，接种弱毒疫苗后起激发作用等。

2、疫苗方面  疫苗中残存或污染强毒；疫苗的血清型与现场病原的血清型不符；疫苗质量差或过期失效；或活菌苗接触过抗菌药或消毒药，被大量杀死。例如，有人在临用时不正确地用酒精或用消毒剂去消毒接种疫苗的注射器，又如给刚大量注射抗菌素或服抗菌药的动物，接种活菌苗；此外是动物漏接种疫苗或接种方法不当，没有真正接种到疫苗或接种剂量不足。

3、环境方面  卫生不良，存在毒力强大的病原微生物。

第四节 免疫治疗

  一、高免血清及免疫球蛋白的制备及应用

  给传染病病畜注射抗病原的高免血清或病愈动物的血清，能起到治疗作用。

高免血清是由动物多次抗原注射后，体内产生大量抗体，当抗体含量达到高峰时，经采血、分离而制得高免血清，可用于传染病的治疗及紧急预防。血清必须在病初期进行注射，注射量要大，经多次注射才能获得良好效果。为了避免发生血清病及过敏反应，增强免疫疗效，目前已推广应用纯化的免疫球蛋白。

  免疫球蛋白是将高免血清中的免疫球蛋白经过盐析（饱和硫酸铵）沉淀，再通过离子交换层析柱，经浓缩而得到的提纯免疫球蛋白（IgG）。用纯化免疫球蛋白治疗，用量少而能达到良好效果，减少副作用。在诊断中采用纯化的IgG，可以提高诊断的特异性。

  二、单克隆抗体

  单克隆抗体是从一个细胞经无性繁殖而来的具有同一基因型的细胞群体。其概念是：由一个克隆化的淋巴细胞杂交瘤细胞株所产生的高度同质性的抗体，称为单克隆抗体。一个天然抗原刺激动物B细胞所产生的抗体，是由多克隆细胞产生的，其抗体的化学成分、结构不同，如有IgG、IgA、IgM、IgE、IgD五大类；前三类又有不同型或亚型，每一次克隆产生的抗体也不相同，所以说由一个动物制备出的抗体是高度的异质性抗体，是抗体的“大杂烩”。欲制造同质性的抗体，必须用单克隆细胞，而淋巴细胞杂交瘤技术是制取同质性抗体的理想方法。它是用两种细胞杂交，即一个是免疫小鼠的脾脏中的B细胞，它能产生特异性抗体，但不能无地传代繁殖；另一个是骨髓瘤细胞，它能无地传代繁殖，但不能产生抗体。两种细胞杂交后获得的后代细胞既能产生特异性抗体，又能无地传代繁殖，再经单克隆化，由单克隆化杂交瘤细胞产生的抗体，就是单克隆抗体。淋巴细胞杂交瘤生产单克隆抗体的过程如图：

单克隆抗体目前应用于制备标准诊断血清及治疗用的高效价血清，同时应用于免疫机制的探讨及抗原决定簇的研究。