1. 免疫组化技术是分子生物学中不可或缺的技术之一，它通过免疫学原理揭示组织切片中的大分子物质定位和含量。
2. 免疫组化的核心原理包括酶标记、荧光和胶体金等。为了有效解决实验中常见的问题，如无染色、高背景和非特异性染色，需要精确匹配试剂、优化孵育条件以及改进预处理工艺。
3. 取材与固定是免疫组化实验的基础步骤，必须选择适当的材料并确保固定液的温度控制在37℃过夜或60℃ 1-2小时，以防止样本脱落。
4. 脱蜡过程需要耐心，使用二甲苯分三次处理，每次10分钟，然后逐渐降至70%酒精。内源性过氧化酶的抑制是关键步骤，通常使用3%H2O2处理，同时用0.5%高碘酸处理气泡。
5. 抗原修复是确保目标蛋白有效暴露的重要步骤，可以选择酶、高压热或微波热修复，使用柠檬酸盐或EDTA修复液。
6. 封闭步骤非常关键，通常使用5%BSA或血清，确保一抗与二抗的同源性匹配。一抗的孵育温度根据抗体类型选择4℃或37℃，二抗与SABC孵育时间为37℃ 30分钟。
7. 显色过程选择DAB，现用现配，严格控制反应时间以保证结果的准确性。复染与返蓝使用Mayer苏木素、碱性溶液和DAPI染核，增强样本对比度。
8. 脱水透明化处理中，使用二甲苯两次，封片时选择中性树胶，结合抗荧光衰减或水溶性封片，保护样本。
9. 对照实验是确保实验可靠性的关键，必须包括阳性、阴性和空白对照，以验证实验结果和试剂性能。
10. 对照实验可以帮助观察蛋白在不同区域的表达，如CA家族抗原、MCA、CR在细胞质-膜型的表达，或S-100、HMB45等在细胞核-质型的定位。
11. 量化分析是提高实验精确度的关键，可以通过40倍光镜下计数阳性着色细胞的比率，或利用ImageJ进行灰密度分析，确保结果的准确性。
12. 评分法结合染色程度和阳性范围，为实验结果赋予量化标准。若想了解更多关于IHC的问题与技巧，可以参考《IHC/IF实验课堂》直播课，由博士德专家为您揭开实验背后的科学秘密。这是一份全面且详尽的IHC实验指南，助您从新手到专家，步步为营，解锁免疫组化的无限可能。
