电泳分离效果受到多种因素的影响，其中待分离生物大分子的性质是关键。比如，大分子的电荷量、大小和形状都会对其电泳迁移速度产生显著影响。一般来说，电荷量越大、直径越小且形状越接近球形的大分子，其迁移速度越快。
缓冲液的性质对电泳也有重大影响。缓冲液的pH值直接影响大分子的解离程度，进而影响其带电性质。当缓冲液pH值距离大分子等电点越远时，其净电荷量增加，电泳速度也随之加快。此外，缓冲液的离子强度也很关键。它需要保持在0.02－0.2之间，以确保电泳过程中大分子电荷的稳定性和缓冲液pH的稳定性。过高或过低的离子强度都会影响电泳速度。
电场强度是另一个重要因素。电场强度越大，电泳速度越快。然而，过高的电场强度会导致电流增大，增加电泳过程中的热量产生。电泳过程中电流所做的功大部分会转化为热能，导致介质温度升高，从而影响样品和缓冲离子的扩散速度，样品分离带加宽，甚至引起对流，导致待分离物的混合。
电渗现象也会影响电泳效果。电渗是液体在电场中的相对移动，由支持介质表面的带电基团引起。玻璃表面带负电时，会吸附溶液中的正电离子，形成向负极的电渗流。如果电渗方向与待分离分子电泳方向一致，则会加快电泳速度；反之，则降低电泳速度。
支持介质的筛孔大小同样会影响电泳迁移速度。在筛孔较大的介质中，大分子的迁移速度较快，而在筛孔较小的介质中，迁移速度较慢。因此，在选择电泳介质时，需根据待分离生物大分子的性质进行调整。
