
简单重复序列(Simple Sequence Repeat,SSR)是一种微卫星DNA,其核心序列由1至6个碱基组成,其中最常见的是双核苷酸重复,如(CA)n和(TG)n。SSR具有高度多态性,主要来源于串联重复单位数目的不同。通过设计微卫星序列两端的互补序列引物,利用PCR扩增技术扩增微卫星片段,再通过凝胶电泳分离PCR产物,根据片段大小确定基因型并计算等位基因频率。在真核生物中,存在许多2-5个碱基的简单重复序列,称为“微卫星DNA”。这些序列两端的序列高度保守,可设计双引物进行PCR扩增,揭示其多态性。
SSR具有以下优点:检测到的是单一的多等位基因位点;微卫星呈共显性遗传,可鉴别杂合子和纯合子;所需DNA量少。在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时,必须知道重复序列两端的DNA序列信息。如不能直接从DNA数据库查寻,则需对其进行测序。
根据SSR核心序列排列方式的不同,可分为三种类型:完全型(核心序列不间断重复)、不完全型(在核心序列之间有3个以下的非重复碱基,但两端连续重复核心序列重复数大于3)和复合型(两个或两个以上串联核心序列由3个或3个以上连续非重复碱基分隔开,连续核心序列重复数不少于5)。完全型是SSR标记中应用较多的一种类型。
SSR广泛分布于各种真核生物的基因组中,大约每隔10~50kb就存在一个SSR。在植物中,平均每23.3kb有一个SSR;双子叶植物中的SSR数量大于单子叶植物,前者两个SSR之间的平均间距为21.2kb,后者为.6kb;核DNA中的SSR数量多于细胞质DNA中的SSR,绝大多数单碱基重复型及2碱基重复型SSR存在于非编码区,3碱基重复型多位于编码区。
微卫星的利用价值在于其核心序列重复数不同,等位SSR位点可呈现出多态性(SSLP,简单序列长度多态性)。大多表现为共显性遗传,有的表现为显性遗传。由于SSR DNA两侧序列(离开20bp以上)表现出保守特征,所以可设计出上下游PCR引物,扩增出包含SSR的DNA序列。微卫星分析常用于:遗传图谱构建;种质鉴定;遗传多样性分析;标记辅助选择;基因定位;数量性状基因座分析;系谱分析;亲源关系鉴定等。
SSR引物的来源包括:借鉴其他近缘种序列;通过筛选文库、测序开发自己的SSR引物;通过核酸数据库查询,从已有序列中搜寻包括SSR的序列并设计引物。
SSR分析实验的主要技术环节包括:提取DNA;PCR扩增;电泳及显色;电泳胶板带型的照相、记录;数据分析处理。PCR产物分离的电泳方法主要有:高浓度琼脂糖电泳;变性聚丙烯酰胺序列胶电泳;非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。由于扩增的片段短,基因间的差异小,通常使用分辨率高的聚丙烯酰胺凝胶电泳。考虑到在非变性胶上会出现人为假象,如导致SSR杂合子中出现3-4条带,而不是正常的2条带,从而干扰等位位点统计,建议在SSR分析中均采用变性胶电泳。