酶活力测定实验的分析与思考

作者：彭二雄

来源：《中学生物学》2017年第02期

        2016年高考生物新课标乙卷选择题第三题在生物教学论坛和QQ群中引发了生物教师的热烈讨论。许多教师对题干中“除酶外所有试剂已预保温”的表述表示不解，也有部分教师对各选项中的操作顺序表示质疑，甚至有个别教师直言题干信息不明确需要修改才会更规范。在参与讨论的过程中，笔者对该题进行了分析与思考。

        考题再现：若除酶外所有试剂已预保温，则在测定酶活力的实验中，下列操作顺序合理的是（ ）

        A. 加入酶→加入底物→加入缓冲液→保温并计时→一段时间后检测产物的量

        B. 加入底物→加入酶→计时→加入缓冲液→保温→一段时间后检测产物的量

        C. 加入缓冲液→加入底物→加入酶→保温并计时→一段时间后检测产物的量

        D. 加入底物→计时→加入酶→加入缓冲液→保温→一段时间后检测产物的量

        参：C。

        1 明确题目要求，确定实验目的

        本题是一道考查酶活力测定的题目，要求选择出实验的合理操作顺序，该实验目的是测定酶活力。许多教师受教材中实验影响，往往会自主地将实验转化成“温度对酶活力的影响”或“pH对酶活力的影响”。这种定势转化是导致许多教师错误分析题干信息的重要原因。

        酶活力也称酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。酶活力的大小常用酶在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率表示，即单位时间内底物（或反应物）的消耗量，或单位时间内产物（或生成物）的生成量。由于底物浓度可以影响酶促反应速率，且实验中底物往往是过量的，而底物减少量占比太小则难以准确测定，因此在实际酶活力测定时一般以产物的增加量为准。酶促反应速率很快，一旦底物与酶混合，反应就会快速发生，所以计时必须从酶与底物接触的那一刻开始，由此可以排除A、D选项。

        2 实验操作中的问题探讨

        根据酶促反应动力学原理，酶促反应速率易受底物浓度、抑制剂、激活剂、温度和pH等多种因素的影响。酶活力测定必须控制在一定的条件下进行，而且必须保证实际的实验过程中相关条件的相对稳定。因此，如何保证适宜而稳定的温度和pH条件以最大化地降低误差，是实验操作最核心的要求。

        2.1 在反应前控制温度和pH

        不同条件下的酶促反应速率不同，对酶活力的测定一般是在酶的最适条件下进行的。因此，为了排除温度、pH等无关变量的干扰，反应之前必须控制实验条件尽可能达到酶的最适温度和最适pH的适宜环境，以保障酶促反应的正常进行，保证酶活力测定的准确、有效。由此该题中对试剂预保温的处理——提前对除酶外的所有试剂预保温是为了控制温度这一无关变量，以尽量排除温度变化对酶促反应速率的影响。同样也需提前控制pH，所以得在底物和酶混合之前添加缓冲液。由此可再排除B选项，答案便只能是C选项。

        2.2 不提前对酶进行预保温的原因

        生物实验强调“单一变量原则”和“等量原则”，因此许多教师认定为了避免温度等无关变量对实验的干扰，必须要在反应前对酶和底物进行相同的处理。因此，虽然之前的分析已经能够选择出正确答案，但大多数教师仍存疑虑：为什么不在反应前将酶和所有试剂一起保温呢？

        理论上，对酶和其他试剂同时进行相同的温度和pH控制是完全合理的。但以下问题也是需要考虑的：对酶提前预保温，温度对酶活性会有影响吗？预保温后的“酶”和需要测定酶活力的“酶”的活性还是一样的吗？因此，为了保证被测定的酶活力是未受干扰的，在反应之前不对酶进行包括预保温在内的任何处理是更有必要的。从操作层面讲，加入少量的酶对反应体系的温度影响不大，而同步的保温操作可以将加酶对温度的影响降到最低。

        2.3 加酶后继续保温的原因

        实验条件不仅需适宜还必须稳定。虽然已提前进行了预保温，但是加酶的操作以及反应时间的延长都会引发温度的变化，反应发生（与加酶同时发生）后的保温措施可以有效防止这种温度波动。缓冲液能够很好地长时间维持pH的相对恒定，因此无需反复添加。

        3 实验操作顺序的确定

        综合以上分析，合理的操作顺序应该是：对除酶外的所有试剂预保温（创设适宜条件，控制无关变量）→加缓冲液（创设适宜条件，控制无关变量）→加底物→加酶（反应发生）→保温（防止温度波动的干扰），并计时（与反应开始同步）→检测产物的量。

        4 对该题的进一步思考

        从该实验可以看出，生物学有着极其严密和复杂的逻辑系统的。只是这种逻辑体系缺乏数学或物理学的精准专业术语和符号，生物学逻辑往往是系统性和非线性（甚至是具有一定概率性）的。

        不像一般化学反应中反应速率与反应物浓度成正比，酶促反应速率往往受到底物的反馈抑制而呈现明显的非线性关系（如图1所示），这也是常用酶促反应初速率（V0）来代表酶活力的原因。温度对酶促反应速率的影响既有适度升高温度增强反应底物动能来提高反应速率的直接影响，也有通过温度改变酶活力对反应速率的间接影响。正是这种复杂的非线性关系，酶活力测定实验一方面要模拟机体温和的酶促反应条件（适宜的温度和pH），另一方面又要避免真实机体内随时发生的环境微变化对酶活力的调节作用（相对稳定的温度和pH），所以该题目C选项所表述的操作顺序或许不是最科学、最经济的测定方法，却是最符合实际、最真实有效的测定途径。

        参考文献：

        [1] 王镜岩等主编.生物化学（上册）[M].北京：高等教育出版社，2002.9：335，336.

        [2] （美）黑姆斯等著.王学敏，焦炳华译.精要速览系列：生物化学[M].北京：科学出版社，2010.8：72，73，73.