三种蛋白染色方法在SDS_聚丙烯酰胺凝胶电泳中的应用_陈琳

三种蛋白染色方法在SDS 2聚丙烯酰胺凝胶电泳中的应用

陈　琳,张亚东,赵艳华,马　平,卜凤荣

(军事医学科学院野战输血研究所,北京　100850)

[摘要]　目的:比较S DS 2聚丙烯酰胺凝胶电泳(S DS -PAGE )中蛋白染色的3种方法。方法:将S DS 2PAGE 中的蛋白分别用银染、铜染和考马斯亮蓝染色,并对铜染或考马斯亮蓝染色后的蛋白进行相

应的复染。结果:快速银染法灵敏度最高,但操作步骤繁琐,染色时间约50min ;考马斯亮蓝染色灵

敏度最低,需染色和脱色,时间约为1h ;铜染灵敏度介于银染和考马斯亮蓝染色之间,但染色时间仅5min ,不需脱色,且可直接用考马斯亮蓝或快速银染法复染。结论:用S DS 2PAGE 进行蛋白检测时,铜染可作为蛋白快速分析的首选方法。[关键词]　电泳,聚丙酰凝胶;蛋白染色方法;蛋白质类;银染色[中图分类号]　Q503　　　　[文献标识码]A [文章编号]　100025501(2000)0420292202

Application of three kinds of staining methods for protein in SDS 2PAGE

CHEN Lin ,ZH ANG Ya 2dong ,ZH AO Yan 2hua ,MA ping ,BU Fong 2rong

(Institute of Field T rans fusion ,Academy of M ilitary Medical Sciences ,Beijing 100850,China )

[Abstract]　Objective :T o com pare three kinds of staining methods for proteins in S DS 2PAGE.Methods :The proteins in S DS 2PAGE were stained with coomassie brilliant blue staining ,copper staining and silver stain 2ing.Then the proteins were restained after coomassie brilliant blue staining or copper staining.R esults :The silver staining was the m ost sensitive ,the sensitivity of the copper staining was the former between that of silver staining and the coomassie brilliant blue staining.It took only five minutes to stain proteins with copper stain 2ing.A fter copper staining ,the proteins could be restained by silver staining or coomassie brilliant blue stain 2ing.Conclusions :C opper staining could be the first choice for rapid analysis of proteins in S DS 2PAGE.[K ey w ords]　electrophoresis ,polyacrylamide gel ;protein staining ;proteins ;silver staining

　　S DS 2PAGE 是Shapiro 于1967年建立的,经过不断的改进、完善,现在已广泛应用于蛋白质分析。它是在阴离子表面活性剂S DS 、还原剂DTT 和热的共同作用下,使蛋白质分子间非共价键和分子内二硫键打开并解聚成多肽链,S DS 覆盖蛋白质分子,使蛋白质能够根据分子大小带有相应的负电荷,使得蛋白质的电泳迁移率不受其原有电荷影响,而只与相对分子质量有关。因此通过S DS 2PAGE 可分离蛋白并测定蛋白质亚基相对分子质量和蛋白质纯度。电泳后蛋白染色是S DS 2PAGE 最基本的技术。目前染色方法很多,有碘染[1]、考马斯亮蓝染色、K Cl 染色、银染[2,3]、CuCl 2染色(铜染)[4]等,它们各有其优缺点。银染灵敏度高,但操作繁琐;考马斯亮蓝染色是常规的蛋白染色方法,但灵敏度低。本文比较了铜染、快速银染、考马斯亮蓝染色3种染色方法,并将

铜染应用于检测酵母中表达的蛋白。

1　材料与方法

1.1　材料

[收稿日期]　1999-11-25

[作者简介]　陈　琳(19-),女,四川合江人,实验师。

牛血清白蛋白(BS A )、丙烯酰胺(Sigma 公司产

品);十二烷基磺酸钠、甲叉丙烯酰胺(Serva 公司产品);酵母表达蛋白(本室制备);S DS 2PAGE 电泳装置(H oefer 公司产品)。1.2　方法1.2.1　S DS 2PAGE 板的制备　分离胶12%,浓缩胶5%。梳子厚度0.75mm 。将样品与等体积的2×S DS 凝胶加样缓冲液(100mm ol/L T ris ・Cl pH

2

92军事医学科学院院刊　2000年12月第24卷第4期Bull Acad M il M ed Sci ,Dec 2000;　V ol 24　N o 4　　

6.8,20%甘油,4%S DS ,200mm ol/L DTT ,0.2%溴酚蓝)混合,100℃变性5min ,上样,稳压90V ,电泳2h 。

1.2.2　凝胶染色

1.2.2.1　快速银染法　凝胶浸于固定液(30%乙

醇,10%乙酸)中,50℃固定2次,每次4min 。再转移至含0.5%戊二醛,0.1%硫代硫酸钠的30%乙醇20.4m ol/L 醋酸钠(pH6.0)溶液中,50℃温育8min 。水洗3次,每次3min 。加入0.1%银20.05%甲醛,40℃避光染色10min 。2.5%碳酸钠20.04%甲醛40℃显色。5%醋酸,50℃终止反应2min 。水洗并

于2%醋酸中保存。1.2.2.2　铜染法　凝胶浸于蒸馏水中数秒钟,0.3m ol/L CuCl 2振荡染色5min ,蒸馏水洗2～3min ,

长

期保存于蒸馏水中。

1.2.2.3　考马斯亮蓝染色　凝胶浸于染色液(0.25g 考马斯亮蓝R250溶于100ml 脱色液中,用What 2man 1号滤纸过滤除去不溶颗粒)中至少30min ,水洗,转入脱色液(水∶甲醇∶冰醋酸为45%∶45%∶10%)中45～60℃至完全脱色。

2　结果

定量牛血清白蛋白(BS A )经变性,进行S DS 2PAGE 。电泳后三块平行的电泳凝胶分别用考马斯亮蓝、0.3m ol/L CuCl 2和快速银染法染色,比较其灵敏度。结果如图1所示,银染灵敏度最高,考马斯亮蓝染色灵敏度最低,铜染灵敏度介于银染和考马斯亮蓝染色之间

。

图1　3种蛋白染色方法的结果

1～10孔BS A 加样量分别为0.1,0.05,0.025,0.01,0.005,0.0025,0.001,0.0005,0.00025,0.0001μg/孔;

A.考马斯亮蓝染色;

B.铜染法;

C.银染法

　　将酵母中表达的蛋白等量加入S DS 2PAGE 的5

个上样孔内,电泳后将凝胶小心顺泳道方向切成5条,其中3条用铜染,其余两条分别用考马斯亮蓝染色和快速银染法染色,同时将铜染后的两条凝胶再分别用考马斯亮蓝染色法和银染法复染,比较它们之间的差异。结果如图2所示,电泳凝胶铜染后用考马斯亮蓝复染与直接考马斯亮蓝染色显示的蛋白带无显著差别;铜染后用银染法复染与直接银染,凝胶中蛋白带也未见显著差别。

酵母表达的蛋白经S DS 2PAGE ,凝胶用考马斯亮蓝染色后再用银染法复染。结果如图3所示,经考马斯亮蓝染色后用银染法复染,可提高蛋白检测的灵敏度。

图2　SDS 2PAGE 凝胶铜染后复染与直接染色的比较

1.铜染后银染;

2.银染;

3.铜染后考马斯

亮蓝染色;4.考马斯亮蓝染色;5.铜染

3

92第4期　　　　　　　　　　　　陈　琳,等1三种蛋白染色方法在S DS 2聚丙烯酰胺凝胶电泳中的应用

图3　考马斯亮蓝染色及快速银染法复染结果

1.考马斯亮蓝染色后银染;

2.考马斯亮蓝染色

3　讨论

我们比较了S DS2PAGE的3种蛋白染色方法,其中银染的最小检出量为1ng/孔,铜染色为25ng/孔,考马斯亮蓝染色为50ng/孔。银染的灵敏度最高,而铜染灵敏度介于银染和考马斯亮蓝染色之间。将电泳凝胶铜染后再用考马斯亮蓝复染,结果表明,蛋白着色程度与单独用考马斯亮蓝染色无显著差别。用银染法复染结果类似。蛋白经S DS2PAGE,凝胶用考马斯亮蓝染色后可再用快速银染法复染,以提高染色的灵敏度。由于铜染整个过程仅需5 min即可显示蛋白带,而银染虽灵敏度很高,但操作过程繁琐,染色时间较长。考马斯亮蓝染色至少也需30min,且需脱色。相比之下,铜染简便、快速,可作为S DS2PAGE蛋白快速分析的有效方法。

[参考文献]

[1]　Lee KK,E llis AE.A novel method for specific visualisation of

serum albumin in polyacrylamide gels by iodine staining[J].

E lectrophoresis,1991,12(5):382.

[2]　Oakley BR,K irsch DR,M orris NR.A sim plified ultrasensi2

tive silver stain for detecting proteins in polyacrylamide gels [J].Anal Biochem,1980,105(2):361.

[3]　Biel H J,G ronski P,Seiler FR.Fast silver staining of poly2

acrylamide gels at elevated tem peratures[J].E lectrophoresis, 1986,7(5):232.

[4]　Lee C,Levin A,Branton D.C opper staining:a five minute

protein stain for s odium dodecyl sulfate2polyacrylamide gel

[J].Anal Biochem,1987,166(2):308.

(本文编辑　杨兆弘)

2001年亚太地区国际肿瘤生物学学术会议暨第五届全国肿瘤标志学学术会议

征　文　通　知

为了迎接21世纪肿瘤生物学新发展,中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会和中华医学会微生物与免疫学分会主办,中国国际科技会议中心协办的“2001年亚太地区肿瘤生物学大会(Asian2Pacific C on ference of Tum or Biology,2001)暨第五届全国肿瘤标志学学术会议”,将于2001年9月16至20日在北京召开。这是我国肿瘤生物学的盛会,会议将邀请国内外著名专家报告当今肿瘤基础与临床研究的最新成果与发展趋势。

1.会议主题　肿瘤分子生物学研究现状与未来。

2.征文内容

(1)基础部分:①病毒与肿瘤;②肿瘤抗原;③肿瘤相关基因(癌基因、抑癌基因、易感基因);④细胞凋亡与细胞分化;⑤细胞周期与信号传递;⑥基因工程和基因工程抗体;⑦细胞因子;⑧肿瘤耐药与逆转;⑨肿瘤转移与逆转;

λυ肿瘤标志基础研究。

(2)临床医学:①免疫治疗;②基因治疗;③细胞因子与细胞治疗(干细胞移植、树突状细胞);④传统医学治疗方法的应用;

⑤肿瘤综合治疗(放疗、化疗、综合手术与生物治疗);⑥肿瘤标志物在肿瘤诊断与治疗中的应用;⑦肿瘤现代治疗技术(γ2射线、α2射线、中子、超声波、低温、热疗、射频等新技术的临床评估)。

(3)现代肿瘤诊断、治疗新技术的临床应用:①生物信息处理;②生物芯片;③肿瘤标志检测的新技术、新方法;④组织、血清、基因和细胞库的建立和应用。

3.征文要求　论文与摘要(附中文对照)一律用英文撰写,论文2000～3000字(摘要500字左右),在标题下注明作者、单位、邮编。请用A4纸打印,摘要占A4纸的1/4面积,并附软盘,也可以电子邮件投稿。稿件经专家评审后,录用的摘要和优秀论文全文,将发表在由国际生物治疗学会(I ABT)主办的“International Journal of M odern Cancer Therapy”(ISS N102821479)杂志上,将适当收取版面费。不论稿件录用与否,恕不退稿,并请随稿件邮寄稿件处理费30元。

4.截稿日期　2001年5月31日(以邮戳为准)。

5.稿件邮寄地址及联系人　北京军事医学科学院基础医学研究所王红丽,邮编:100850;电话:010*********;Fax:66931773

E2mail:Lich@nic.bmi.ac.cn　　Web S ite:http://w w w.bio2tum or.org

中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会

2000年6月22日492军事医学科学院院刊　2000年12月第24卷第4期