杂环类药物的含量测定

本节选择上述常用的五类杂环药物中的典型药物，从其化学结构、理化特性等方面，讨论药物结构与含量测定的关系。简介常用含量测定方法的原理、条件及其应用特点。

（一）非水溶液滴定法

1．基本原理

采用非水溶液滴定法测定本类药物时，上述所列药物除了尼可刹米、地西泮和氯氮卓等，以游离碱的形式供分析外，多数为盐酸盐和硫酸盐。这些盐类的滴定过程，实际上是一个置换滴定，即强酸滴定液置换出与游离碱结合的较弱的酸。其反应原理可用下列通式表示：

式中BH+·A-表示游离碱类盐；HA表示被置换出的弱酸。由于被置换出的HA的酸性强弱不同，因而对滴定反应的影响也不同。当HA酸性较强时，反应不能定量完成，根据化学反应平衡的原理，必须采取措施，除去或降低滴定反应产生的HA的酸性，使反应顺利地完成。因此，必须根据不同情况采用相应的测定条件。

2．一般方法

取经适当方法干燥的供试品适量（其量一般以消耗标准液约8ml为度），加冰醋酸10ml~30ml（必要时可温热使溶解，放冷）。若供试品为氢卤酸盐，应再加5%醋酸汞的冰醋酸溶液3ml~5ml，用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定至终点，并将滴定结果用空白试验校正。

3．问题讨论

（1）适用范围  本法主要用于Kb＜10-8的有机碱盐，如有机酸盐、氢卤酸盐、磷酸盐、硫酸盐、盐及有机酸碱金属盐类的含量测定。

（2）酸根的影响  本类药物盐中被置换出的无机酸类，在醋酸介质中的酸性以下列排序递减：

高氯酸＞氢溴酸＞硫酸＞盐酸＞

若在滴定过程中被置换出的HA，其酸性较强，则反应将不能进行到底，如测定杂环类药物氢卤酸盐时，由于被置换出的氢卤酸的酸性相当强，影响滴定终点，不能直接滴定，需要进行处理。一般处理方法是加入定量的醋酸汞冰醋酸溶液，使其生成在醋酸中难解离的卤化汞，以消除氢卤酸对滴定的干扰与不良影响：

2B·HX  +  Hg(Ac)2  → 2B·HAc  +  HgX2 

当醋酸汞加入量不足时,可影响滴定终点,而使测定结果偏低,但过量的醋酸汞(1～3倍)并不影响测定结果。

（3）滴定剂的稳定性  本类药物的非水溶液滴定法所用的溶剂为醋酸，具有挥发性，且膨胀系数较大，因此温度和贮存条件都影响滴定剂的浓度。若滴定样品时与标定高氯酸溶液时的温度不一致，而且温差未超过10℃时，应将高氯酸滴定液的浓度用下列公式加以校正：

式中：0.0011为冰醋酸的体积膨胀系数，t0为标定时的温度，t1为滴定时的温度，N0为t0时高氯酸滴定液的浓度，N1为t1时高氯酸滴定液的浓度。

若滴定样品时与标定高氯酸溶液时的温差超过10℃时，则应重新标定。

（4）终点指示方法  非水溶液滴定法的终点确定，常用电位法和指示剂法。中国药典收载的本类药物大多采用结晶紫指示剂指示终点，少数采用电位法指示终点。

4．应用实例

（1）游离弱碱性药物测定  吡啶类、苯并二氮杂卓类药物，临床上多以游离碱状态作为药用，如异烟肼、尼可刹米、地西泮及氯氮卓等。基于这些药物分子结构中氮原子的弱碱性，可用非水溶液滴定法直接测定其含量。由于这些药物的碱性强弱不同，因此测定时所采用的溶剂、指示剂及其指示终点的方法也不尽相同。其测定方法及其主要条件见表8-7。

（2）氢卤酸盐类药物测定  吩噻嗪类药物，临床上使用的多为其盐酸盐，如盐酸氯丙嗪、盐酸异丙嗪、盐酸氟奋乃静、盐酸硫利达嗪等。喹啉和托烷类药物，临床上使用的也有其盐酸盐和氢溴酸盐，如盐酸环丙沙星、氢溴酸东莨菪碱等。当这些药物溶于冰醋酸时，由于氢卤酸在冰醋酸中酸性较强，对测定有干扰，必须先加入过量的醋酸汞冰醋酸溶液，使其形成难以电离的卤化汞，而氢卤酸盐药物，则转变成可测定的醋酸盐。然后再用高氯酸滴定液滴定，并可获得满意的结果。本类药物的测定方法见表8-8。

（3）硫酸盐类药物测定  硫酸是二元酸，在水溶液中能完成二级解离，生成SO42-，但在非水介质中，只显示一元酸解离为HSO4-，即只供给一个H+，所以硫酸盐类药物在冰醋酸中，只能滴定至硫酸氢盐，因此可以用高氯酸滴定液直接滴定。采用非水溶液滴定法，以高氯酸滴定液直接滴定硫酸盐类药物时，需注意本类药物的化学结构，正确判断反应的摩尔比，才能准确地计算出试验结果。现以硫酸阿托品和硫酸奎宁为例，简述其测定方法的基本原理与操作。

1）硫酸阿托品测定：阿托品为碱性较强的一元碱药物，因而硫酸阿托品的化学结构式可以简写为(BH+)2·SO42 -，用高氯酸直接滴定时的反应式为：

(BH+)2·SO42-  +  HClO4  →  (BH+)·ClO4-  +  (BH+)·HSO4-

因此，可根据1mol的硫酸阿托品消耗1mol高氯酸的关系计算其含量。

2）硫酸奎宁测定：奎宁为二元碱，其中喹核碱的碱性较强，可与硫酸生成盐；而喹啉环的碱性极弱，不能与硫酸成盐，而保持游离状态。当用高氯酸直接滴定硫酸奎宁时，1mol的硫酸奎宁消耗3mol的高氯酸。其反应式如下：

(C20H24N2· H+)2SO4  +  3HClO4 → 

(C20H24N2· 2H+)·2ClO4-  +(C20H24N2· 2H+)·HSO4-·ClO4-

中国药典和USP(24)都采用此法测定硫酸奎宁和硫酸奎尼丁的含量。

3）硫酸奎宁片的测定：硫酸奎宁片剂碱化处理，生成奎宁游离碱，然后再用高氯酸标准溶液直接滴定。此时1摩尔的硫酸奎宁可消耗4摩尔的高氯酸，因此片剂分析的滴定度与原料药分析的滴定度不同。

（4）盐的测定  在冰醋酸介质中酸性不强，滴定反应可以进行完全。但是具有氧化性可以破坏指示剂使其变色，使指示剂无法指示终点。因此采用非水溶液滴定法测定盐时，一般不用指示剂法而用电位法指示终点。

（5）磷酸盐与有机酸盐  磷酸与有机酸在冰醋酸介质中酸性极弱，不影响滴定反应的定量完成，可以按常规方法直接滴定。

（二）铈量法

铈量法是药物分析中常用的氧化还原方法之一，但上述所列各类药物中，仅有硝苯地平和吩噻嗪类药物可采用此法进行含量测定。基于这些药物具有还原性，在酸性介质中可以用硫酸铈滴定液直接滴定。前者用邻二氮菲指示剂指示终点；后者利用药物自身的颜色变化指示终点。

1．硝苯地平的测定  基本原理  硝苯地平的测定原理，可用下列反应式表示：

终点时，微过量的的Ce4+将指示剂中的Fe2+氧化成Fe3+，使橙红色配合物离子呈淡蓝色或无色配位化合物离子，以指示终点的到达。

2．吩噻嗪类药物的测定  基本原理是利用吩噻嗪类药物被硫酸铈滴定时，先失去一个电子形成一种红色的自由离子，达到化学计量点时，溶液中的吩噻嗪类药物均失去两个电子，而红色消褪，借以指示终点。此法也可采用电位法或永停法指示终点。其反应简式如下：

（三）比色法

1．酸性染料比色法

（1）基本原理  在适当的介质中，碱性药物（B）可与氢离子结合成阳离子（BH+），而一些酸性染料，如溴百里酚蓝、溴酚蓝、溴甲酚紫和溴甲酚绿等，可解离成阴离子（In -）。上述的阳离子与阴离子定量地结合成有色络合物（BH+In -）离子对，可以定量地被有机溶剂提取，在一定波长处测定该溶液有色离子对的吸收度，即可以计算出碱性药物的含量。其反应平衡简式如下：

也可将呈色的有机溶剂经碱化（如加入醇制氢氧化钠），使与有机碱结合的酸性染料释放出来，测定其吸收度，再计算出碱性药物的含量。

（2）影响因素  酸性染料比色法的影响因素较多，如水相的pH，酸性染料的种类和有机溶剂的种类与性质都影响测定结果。现分别简单讨论之。

1）水相最佳pH值的选择：本法中水相的pH选择极为重要，只有选择合适的pH使有机碱性药物均成阳离子（BH+），而同一pH条件下，酸性染料电离足够的阴离子（In -），阴阳离子才能定量生成离子对，并完全溶于有机溶剂中，而过量的染料完全保留在水相中，才能保证定量的测定。

从上述平衡简式可知，如pH过低，抑制了酸性染料解离，使In-浓度太低，而影响离子对的形成；如pH过高，有机碱药物呈游离状态，使离子对的浓度也很低。因此，选择一个最佳pH值应使有机碱药物和酸性染料全部以BH+和In-状态存在，是酸性染料比色法至关重要的试验条件。其选择方法一般根据有机药物和酸性染料的pK值，以两相中分配系数而定。

2）酸性染料及其浓度：可用于本法的酸性染料较多，而所选用的酸性染料，不但能与有机碱药物定量地结合，而且生成的离子对在有机相中溶解度大，染料在有机溶剂中不溶或很少溶解；同时要求生成的离子对，于其最大吸收波长处有较高的吸收度。常用的酸性染料有溴麝香草酚蓝、甲基橙、溴甲酚绿等。中国药典中，托烷类药物含量测定，所选用的酸性染料为溴甲酚绿。

酸性染料的浓度，一般认为对测定结果影响不大，只要有足够量即可。增加酸性染料的浓度 可以提高测定的灵敏度。但如果浓度太高，则易产生严重的乳化层，且不易去除，往往影响测定结果。

3）有机溶剂的选择：应选择对有机碱药物与酸性染料形成的离子对提取率高，不与或极少与水混溶，或能与离子对形成氢键的有机溶剂作为溶剂。常用的有机溶剂有氯仿、二氯甲烷、二氯乙烯、苯、甲苯、四氯化碳等。其中以氯仿最为常用，是理想的溶剂。氯仿能与离子对形成氢键，提取率较高，选择性好，在水中溶解度小，且混溶的微量水分易于除去。其次是二氯甲烷、二氯乙烯、苯等。

4）水分的影响：在提取过程中，严防水分混入有机溶剂中，一则水相中有过量的有色酸性染料，而影响测定结果；二则水分的混入使氯仿混浊，而影响比色测定。一般多采用加入脱水剂，或经滤纸过滤的方法，除去混入的水分。

另外，酸性染料中有杂质混入提取的有机相中，使测定结果受到干扰。为了获得准确结果，可在加入供试品之前，将缓冲液与酸性染料的混合液先用所选用的有机溶剂提取，以便除去酸性染料中的有色杂质。

（3）应用示例  中国药典用本法测定含量的药物有硫酸阿托品片、氢溴酸东莨菪碱片和氢溴酸山莨菪碱片等。现仅介绍氢溴酸东莨菪碱片的含量测定。

2．钯离子比色法

基本原理是利用吩噻嗪类药物，在适当pH值溶液中可与金属钯离子形成有色络合物（反应式见本章第四节的鉴别试验），借以进行比色测定。如丙嗪、氯丙嗪、异丙嗪，在pH2±0.1的缓冲溶液中，可与钯离子（Pd2+）形成红色络合物。10min后呈色完全，呈色可稳定2h左右，并在500nm波长附近具有最大吸收，最适宜的测定范围为50-250μg。

本法可选择性地用于未被氧化的吩噻嗪类药物的测定。因为钯离子只与未被氧化的硫共价，当硫原子已被氧化为亚砜或砜时，则不与钯离子呈色，因此可利用空白试验对照的方法，消除本类药物中的氧化物的干扰。

（三）紫外分光光度法

本章所列举的五类药物，原料药仅奥沙西泮采用本法，而其他药物的制剂或片剂均匀度与溶出度的测定均采用本法。其测定原理是基于这些药物具有紫外特征吸收光谱，在其最大吸收波长处测定吸收度，利用百分吸收系数（ ）计算；或与对照品溶液同时测定，计算含量。现介绍几种不同类型的应用实例。

1．直接分光光度法

供试品不需要提取分离，溶于适当的溶剂中即可进行含量测定。

（1）奥沙西泮的测定  （2）盐酸异丙嗪片的测定 

（3）盐酸异丙嗪注射液的测定

1）测定波长的选择：盐酸异丙嗪注射液处方加有维生素C作抗氧剂，可还原异丙嗪红色自由基氧化产物，从而防止异丙嗪氧化变色，其反应机理如下： 

采用紫外分光光度法测定时，因维生素C在盐酸异丙嗪最大吸收波长249nm处有吸收，干扰注射液的测定。因此，不能选用249nm作为盐酸异丙嗪注射液的测定波长。而选用299nm波长测定盐酸异丙嗪注射液的含量时，维生素C在此波长处则不产生干扰。

2）测定方法：精密量取本品2ml，置100ml量瓶中，用盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置另一100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，于1cm吸收池中，在299nm的波长处测定吸收度，按C17H20N2S·HCl的吸收系数（ ）为108计算，即得。

2．萃取后分光光度法

盐酸氯丙嗪注射液的含量测定，除了上述采用选择299nm波长直接分光光度法消除处方中维生素C的干扰外，还可以利用萃取后分光光度法进行测定。

（1）测定原理  利于盐酸氯丙嗪在碱性介质中，氯丙嗪转化为游离碱，被有机溶剂乙醚定量提取，然后将氯丙嗪的乙醚提取液，用盐酸溶液提取，使氯丙嗪再转化为盐酸氯丙嗪，在254±1nm波长处进行测定。经过两次萃取使盐酸氯丙嗪与注射液处方中其他组分得到了分离，以消除对测定的干扰，使测定结果更准确。

（2）测定方法  精密量取本品适量（约相当于盐酸氯丙嗪100mg），以盐酸液（0.1mol/L）稀释至500ml。分取上述溶液5ml，置分液漏斗中，加水20ml，加氨水呈碱性，用乙醚振摇提取4次，每次25ml。合并乙醚液，用水洗涤2次，每次10ml，合并洗液，用乙醚20ml提取，弃去洗液。合并前后两次得到的乙醚液，分四次用盐酸液(0.1mol/L)萃取，每次25ml。合并酸液，并稀释成0.0005%浓度的溶液。以盐酸液（0.1mol/L）作空白，用分光光度计在254±1nm波长处进行测定，以盐酸氯丙嗪 为915，计算供试品中盐酸氯丙嗪的量，即得。

3．萃取-双波长分光光度法

4．二阶导数分光光度法

（四）气相色谱法

气相色谱法是一种有效的分离技术，它具有分离效果好、灵敏度高、选择性好、用样量少和分析速度快等特点，特别适合组分比较复杂的供试品中微量有机药物及其代谢物的分离测定。由于绝大多数药物极性较大，不易气化，或者对热不稳定，因此该法在药物分析中的应用不如高效液相色谱法多。现以硫酸阿托品片和人血浆中硝苯地平的气相色谱法为例，简述该法在杂环类药物分析中的应用。

（六）高效液相色谱法

高效液相色谱法，在杂环类药物的含量测定中，应用越来越广泛，其中80%以上是采用反相高效液相色谱法。利用本法可以十分有效地分离和测定本类药物及其分解产物。USP（24）收载的本类药物有数十个品种采用本法测定，而本章典型药物在我国药典仅用于地西泮注射液的含量测定。

1．反相高效液相色谱法

反相高效液相色谱法，是指流动相的极性大于固定相极性的色谱方法。在本法中常采用化学键合相作为固定相，即在硅胶表面，利用硅醇基的活性与有机硅烷反应，使硅烷基键合在硅胶表面，如键合为十八烷基时，则形成常用的十八烷基硅烷键合硅胶（ODS）。在硅胶表面引入硅烷基形成的固定相极性很弱，而流动相系统，多采用水-甲醇或水-乙腈系统，极性较强。在反相色谱中，极性强的组分在分离时先流出柱子，极性弱的组分后流出柱子，因此适合于共存组分极性差异较大样品的分析。

2．离子对高效液相色谱法

离子对色谱法，是离子对提取与色谱技术相结合的产物，可用于分析呈离解状态的药物，如有机酸类或有机碱类。离子对色谱法是将待测组分的反离子加入到流动相中，与呈离解状态的药物作用，生成可逆的离子对化合物。