细胞工程知识点

1、细胞工程：以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。

2、细胞工程的应用：

1) 动植物快速繁殖技术：植物组织培养、人工种子、试管动物、克隆动物

2) 新品种的培育：细胞融合、细胞水平的重组

3) 细胞工程生物制品：单克隆抗备、疫苗生产

4) 细胞疗法与组织修复：

2细胞工程理论基础

1、细胞全能性：每个活的体细胞都具有像胚性细胞那样，经过诱导能分化发育成为一个新个体的潜在能力，并且具有母体的全部的遗传信息。

2、细胞分化：指细胞在形态、结构和功能上发生差异的过程。

3、细胞的脱分化：在一定营养和刺激因素作用下,具有特定结构与功能的植物组织的细胞被诱导而改变原来的发育途径,逐步失去原来的分化状态,细胞特性消失,转变为具有分生机能的细胞,并进行活跃的细胞,这一过程称为去分化。 

3细胞工程技术

1、实验室条件：组成：准备室、无菌间、操作间、培养室、分析室。

2、无菌技术、显微技术、细胞观察与分析、细胞分离、细胞保存与复苏

（1）细胞保存方法  传代培养保存法 低温冷冻保存法(低温、超低温保存)    液体固化的方式（形成冰晶、形成无定型的玻璃化状态）

  玻璃化指液体转变为非晶态（玻璃态）的固定化过程，在此状态时，水分子没有发生重排，不产生结构和体积的变化，因此不会由于机械或溶液效应造成组织和细胞伤害，化冻后的细胞仍有活力。

 冷冻方法（缓慢冷冻法、快速冷冻法 预冷冻法包括逐级冷冻和两部冷冻）

细胞复苏按一定复温速度将细胞悬液由冻存状态恢复到常温的过程。

复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。

细胞培养和代谢：

1、细胞培养：模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。

2、细胞培养的操作方式：分批式培养、流加式培养、半连续式培养、连续式培养、灌流式培养。

3、分批式培养（植物细胞培养）：分批式培养过程的环境随时间变化很大，可分为延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期等五个阶段。

4、流加式培养(适合植物）：随着营养物质的不断消 耗，不断地向系统中补充新的营养成分，使细胞进一步生长代谢，直到整个培养结束后取出产物。

5、半连续式培养（动物细胞）：定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出。

6、连续式培养：该模式是将细胞接种 于一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。

7、灌流式培养：灌流式培养是把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产

8、物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基。（动物细胞）

9、代谢工程：通过某些特定生化反应的修饰来定向的改善细胞的特性，或是利用重组DNA技术创造新的化合物。它是利用基因工程或是分子生物学技术、将生物技术内的代谢路径改变，通常改变生体内化学反应的酶。代谢工程技术目前以微生物利用为主，改变工业微生物的代谢路径，生产所需要的化学物质，如抗生素。

10、逆代谢工程：是一种采用逆向思维方式进行代谢设计的新型代谢工程。就是先在异源生物或相关模型系统中，通过计算或推理确定所希望的表型，然后确定该表型的决定基因或特定的环境因子，然后通过基因改造或环境改造是该表型在特定的生物中表达。

植物人工繁殖

11、植物组织培养： 是指在无菌条件下，将离体的植物器官（如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等）、组织（如花药组织、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞、生殖细胞等）、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生质体等培养在人工配置的培养基上，给予适当的条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽，或者长成新的完整植株的一种实验技术。也称植物离体培养或试管培养。

12、植物组织培养再生植株的途径：

1）.器官发生途径：离体培养的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程

2）体细胞胚发生途径：从体细胞产生胚状体的过程

13、植物组织培养的问题：玻璃化、褐化问题、微生物污染问题。

14、玻璃化问题解决方案：

1）利用固体培养基,增加琼脂浓度，选择适当的碳源,提高培养基中蔗糖含量，从根本上降低培养基中的渗透势,造成细胞吸水阻遏,减少培养基中植物材料可获得的水分；

2）采用通气性好的封口材料如纱布、脱脂棉等代替聚乙烯塑料膜作为封口材料,可降有效低培养容器内部环境的相对湿度,减轻有害气体的积累,使植物光合作用顺畅。

3）非受伤的物理和化学协迫可以增加乙烯的合成。乙烯促进叶绿素分解及细胞的畸形发展。乙烯处理破坏膜的结构，解离细胞壁，细胞内积累有少量纤维素及泡状物质。

4）培养基中BA浓度和培养温度与玻璃化成正相关，BA浓度越高或培养温度越高，玻璃苗比率越大。选择搭配合适的激素,适当降低培养基中ＢＡ的浓度均可减轻玻璃苗的出现。通过培养条件(温度和光照)减少玻璃苗的发生。适当低温处理可消除玻璃化，提高光照强度,适当延长光照时间,充分利用自然光照也可以减低玻璃苗的发生频率。

5）在培养基中减少或除去ＮＨ4ＮＯ3，附加活性炭、青霉素、聚乙烯醇(ＰＶＡ)、Ｃａ、赤霉素(ＧＡ)及多效唑(ＰＰ333)等,减少继代培养的次数等措施均可降低观赏植物组培过程中玻璃苗的发生。

15、褐变解决途径：、

1）选取适宜的外植体

2）选择适宜的培养条件

3）细胞筛选和预处理

4）使用抑制剂（Vc、柠檬酸、巯基乙醇、谷胱甘肽、DTT等）

5）使用吸附剂（活性炭、PVP等）

16、 微生物污染问题防治措施：

1）改进外植体消毒方法

2）反复检查培养物是否污染

3）使用抗生素（用两性霉素B 、青霉素、链霉素 ）

17、人工种子三部分：人工种皮外层，保护胚状体中的水分免于丧失和防止外部力量冲击；人工胚乳，含有必需的营养成分和某些植物激素；胚状体或芽。

18、极性现象：由细胞的电场方向决定的。因为电场方向决定着细胞内的物质分配，这些物质包括无机盐类、蛋白质、核糖核酸等一些带电荷物质。同时，生长素的梯度、pH梯度、渗透压大小、机械压、光照等都能使细胞形成电场，特别是膜上和Ca2+结合的蛋白质带有净的电荷，它在细胞内电场的建立中起着非常重要的作用。

19、植物激素的作用：

(1)由IAA 和一些CTK的组合对愈伤组织根和芽的诱导。

(2)由IAA和GA3（赤霉素）在维管组织分化中的相互作用。

(3)由IAA对茎中皮层和髓组织内以及愈伤组织内维管束的诱导。

(4)茎组织对IAA的反应有不定根的发生。

(5)由GA3、IAA和乙烯对开花的诱导和性别的控制 。

20、细胞分化的机制：

1）细胞分化基因表达的主要调节发生在转录水平，而不是翻译水平。

2）调节细胞中转录过程的因素是非组蛋白,组蛋白使基因转录过程关闭，非组蛋白使部分基因转录过程打开。

21、植物胚胎培养：对植物的胚及胚器官（如子房、胚珠）进行离体无菌培养、使其发育成幼苗的技术。包括：成熟胚培养、幼胚培养、子房培养、胚乳培养和试管受精等。

22、植物脱毒方法：

1）物理法：高温处理、低温处理

2）化学法：利用嘌呤和嘧啶类似物、氨基酸、抗生素等化学药品处理患病植物来抑制植物体内病毒的复制。

3）生物学方法：茎尖培养、微体嫁接法、通过愈伤组织培养、珠心培养法、花药培养脱毒。

动物人工繁殖

1、体外受精：是指将哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。

2、试管动物培育过程：

（1）精子采集与体外获能、卵子采集与成熟培养。

（2）体外受精

（3）胚胎体外培养

（4）胚胎移植

（5）体外发育、出生

3、胚胎移植：是指将受精卵或发育到一定阶段的胚胎移植到与供体同时发情排卵、但未经配种的“受体”母畜输卵管或子宫的技术。

4、人工受精：将采集的精子注入发情处理的母体内完成受精过程。

5、人工受精繁殖动物的意义：

1）提高优秀种公畜的利用率

2）加速品种改良

3）家畜配种不受时间和地域

4）大幅度减少种公畜的饲养数量

5）克服公母畜体型悬殊和种间交配困难

6）防止疾病传播

7）有利于提高母畜的受胎率

5、人工授精技术3个环节：采精、精液处理和输精。

6、细胞核移植克隆动物的技术路线：

1）核供体细胞的准备

2）受体细胞的去核

3）细胞核移植、激活

4）重组胚的培养与移植

5）核移植后代的鉴定

7、胚胎冷冻保存方法：程序冷冻法、玻璃化冷冻法。

主要的冷冻损伤机制包括: 一溶液效应造成化学损伤二是细胞内结冰造成物理损伤三是细胞渗透压异常损伤。

冷冻保护剂：渗透型冷冻保护剂属于细胞内液抗冻保护剂：甘油、二甲亚砜

非渗透型冷冻保护剂葡萄糖、二糖（蔗糖）、三塘（棉子糖）、聚乙烯吡咯烷酮、清蛋白                    注：  抗冻蛋白

8、精子冷冻保存方法：常温保存、低温保存、冷冻保存

9、卵母细胞保存：玻璃化冷冻法、一步冷冻法、超快速冷冻法

细胞重组与细胞融合

1、细胞质工程：是研究真核细胞的核-质关系以及细胞器、细胞质基因转移的技术。

2、细胞质融合：也叫细胞杂交，是使用人工方法使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。

3、细胞质融合方法：

1）生物法：病毒诱导细胞融合

2）化学法：聚乙二醇诱导、脂质体法

3）物理法：电融合诱导法

4、病毒诱导细胞融合的优缺点：优点：操作简单、成本低。缺点：要提前大量培养病毒，并且灭活后才能作为融合剂使用，操作繁琐，而且一旦灭活不充分，病毒可能感染操作者与亲本细胞

5、聚乙二醇介导的细胞融合优缺点：优点：融合成本低，无需特殊设备；融合产生的异核率较高；融合过程不受物种的。缺点：融合过程繁琐，聚乙二醇可能对细胞有害。

6、点融合诱导法的优缺点：优点：融合率高、重复性和可操作性强。缺点：可能会造成不可恢复的细胞损伤。

新品种的培育

1、体细胞杂交：是指将不同来源地体细胞融合并使之分化再生，形成新品种的技术。

2、多倍体育种的方法：

1）化学方法：一些化学物质可以阻止卵母细胞第二极体生物释放或细胞而产生多倍体。常用的化学物质有：细胞松弛素、秋水仙素、聚乙二醇等。

2）物理方法：主要包括温变激变、机械创伤、辐射、水静压法和高盐高碱法等、

3）生物法：指体细胞杂交，利用染色体加倍个体和为加倍个体杂交繁殖多倍体后代，常与物理化学法结合使用。

3、雌核发育：精子经过处理使用其核不参与受精卵卵球的发育，胚胎的发育仅在母体遗传的控制下进行的一种发育方式。

4、雄核发育：卵细胞不受精，卵核消失，或卵细胞受精前失活，由精核在在卵细胞内单独发育成单倍体，因此只含有一套雄配子染色体。、

5、雌核发育存在的问题：人工雌核发育的后代成活率较低，有的个体还有雌雄间性的特征。

6、.植物离体受精：指体外无菌条件下培养未受精的子房、胚珠和花粉、使花粉萌发进入胚珠完成受精的技术。包括离体传粉和体外受精两类。

7、胚胎嵌合：将两枚胚胎细胞 (同种或异种动物胚胎)融合共同发育成为一个胚胎为嵌合胚胎。将该胚胎移植给受体，妊娠产仔，如该仔畜具有以上两种动物胚胎的细胞称之为嵌合体动物。 

植物细胞代谢产物制备

1、植物细胞悬浮培养的生物反应器分为两大类：

1）机械搅拌式生物反应器

2）气升式生物反应器：鼓泡式生物反应器、转鼓式生物反应器

2、细胞固定化培养：是指游离的细胞包埋在支持物内部或表面进行培养的一门技术。

3、植物细胞固定化培养的优点：

1）细胞经包埋后所受的剪切力损伤减少，维持细胞的稳定性，适合脆弱的植物细胞的培养，同时也利于采用传统生物反应器的大规模培养。

2）悬浮细胞体系中的细胞密度比较高时会因粘度增加引起传质困难。固定化细胞培养系统中细胞密度远高于悬浮培养，但不会改变培养液流体性质，利于传质。

3）大多数植物次级代谢产物合成生长停止后才大量合成。采用固定化培养可以将细胞生长与产物合成分成两个阶段。

4、固定化培养方法：吸附固定法、共价结合法、包埋法、交联法。

5、固定化培养生物反应器：

1）采用合适的机械搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、鼓泡式生物反应器等进行培养。

2）也可将细胞直接吸附或包埋在特殊设计的生物反应器内的介质表面或内部进行培养：如中空纤维生物反应器。

6、看护培养：用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续和增值。这块愈伤组织被称为看护组织。

7、饲养层培养：把处理过的无能力或很慢的细胞来饲养所需要的细胞，使其和生长。

8、两步培养法：非生长偶联型的细胞培养一般采取两步法：第一步：采用利于细胞生长的培养基使细胞达到高的细胞浓度。第二步：更换利于细胞产物合成的培养基或者添加代谢产物的前体物质或诱导子促进产物的合成。

9、两相培养：在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系形成上、下两相，细胞在水相中生长合成次级代谢产物，分泌出来的产物被转移至有机相中。

10、毛状根培养生产次级代谢产物：一些植物的次级代谢产物在根里大量合成，但正常艮的培养非常困难，生长缓慢，收获困难，而许多毛状根在离题培养条件下表现出次级代谢产物的合成，产物较正常植物及悬浮培养细胞要高。利用RI质粒致根区诱导毛状根产生。

11、毛状根：是发根农杆菌感染双子叶植物后，形成的类似头发一样的组织。

12、毛状根诱导的方法：外植体接种法、茎杆接种法、原生质体—农杆菌共培养法。

微藻培养及应用

1、适合培养的微藻：蓝藻门、绿藻门、金藻门、红藻门。

2、微藻应用：

1）微藻在能源、医药、食品、水产养殖、化工、环保、农业及航天等领域有着重要的应用价值。

2）保健品、功能食品：片剂、粉剂、添加剂

3）水产养殖：饵料

4）航天：安保系统

5）转基因药物：可以食用

6）能源：生物柴油、氢

动物细胞培养生物制药

1、动物细胞培养：是模拟体内生理环境使分离的动物细胞在体外生存、增殖的一门技术。

2、贴壁型细胞的分类：成纤维细胞、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞。

3、接触性抑制：接触性抑制是某些动物细胞体外培养的生长特性之一，是指由于细胞相互接触而抑制细胞运动性的现象。

4、密度抑制：细胞接触后汇合成片后，只要营养充分，细胞仍能进行增殖。但当细胞密度达到一定程度后，营养相对缺乏，代谢产物增多，发生密度抑制现象。

5、培养基的类型：

1）天然培养基：血清、组织提取液、鸡胚汁

2）合成培养基

3）无血清培养基

6、动物细胞培养分类：贴壁培养、固定化培养、悬浮培养

7、动物细胞贴壁生长的过程：游离期、吸附期、繁殖期、退化期。

8、动物细胞小规模培养有哪几种类型：悬滴培养法、灌注小式培养法、培养板培养法、转管培养法、培养瓶培养法。

9、传代培养：是指将原代培养的细胞继续转接培养的过程。细胞的体外大量增殖以及细胞系的建立是通过传代培养实现的。

10、细胞系：是由原代培养经传代培养纯化，获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。第一次传代培养后的细胞即为细胞系。不能连续培养的为有限细胞系、能连续培养下去的是连续细胞系。

11、细胞株：是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或筛选的方法，由单细胞增值形成的细胞群。

12、微载体培养基本流程：

1）选择合适的微载体类型

2）浸泡水化及消毒

3）接种

4）培养观察与细胞记数

5）传代培养

6）消化与收获

13、微载体培养的优点：

1）模拟了体内三维生长环境，减轻了接触抑制，可以多层生长

2）很好地解决了生物反应器的空间分布问题，单位体积培养液的细胞产率高；培养系统占地面积和空间小；容易放大。

3）把悬浮培养和贴壁培养融合在一起

4）接种和收获方便：可循环、连续收获与培养，培养基利用率高

16动物细胞培养的生物反应器机械搅拌式桨叶改造，充气搅拌式改造，微载体培养，中空纤维式培养

17球传球接种技术，将贴满细胞的微载体与新鲜微载体混合实现细胞因随机碰撞而实现转移贴附在新载体表面的技术

14、病毒疫苗的类型：灭活疫苗、减毒活疫苗

15、干扰素：是一种细胞因子，是真核细胞对各种刺激反应后形成的一组复杂的蛋白质。

转基因生物反应器

1、转基因生物反应器：将外源基因转入细胞或动植物，利用细胞增殖或者动植物代谢准备外源基因的表达产物的技术。

2、转基因动物：:是指在基因组内稳定地整合以实验方法导入的外源基因，并且外源基因可以稳定地遗传给后代的遗传工程动物。一般用胚胎干细胞法，逆转录病毒载体法产生的第一代转基因动物均为嵌合体动物，而显微注射法得到的第一代转基因动物，也约有20%为此类动物。 

3、动物细胞培养生物反应器类型：

4、转基因动物细胞转基因方法：

1）物理方法：电穿孔法、显微注射法、裸露DNA直接注射法

2）化学方法：DEAE-葡聚糖法、磷酸钙-DNA共沉淀法、脂质体载体包埋法

3）生物学方法：病毒介导的基因转移

5、制备转基因动物的主要方法有：

1）原核期胚胎显微注射法 

2）反转录病毒感染法

3）胚胎干细胞移植法

4）精子载体导入法

5）人工酵母染色体法

6）受精前卵细胞显微注射法

6、转基因植物的转基因方法：

1）受体：叶盘、原生质体、悬浮细胞、愈伤组织、胚状体、活体

2）转化法：载体介导法；基因直接导入法（物理方法，化学方法）、种质系统法、病毒感染法

干细胞

1、干细胞：一类具有自我更新和分化潜能的细胞。

2、干细胞自我更新特征：对称、不对称。

3、干细胞增殖特征：增殖的缓慢性、增殖的自稳性

4、胚胎干细胞的分离：分离自胚胎内细胞团、分离自原始生殖细胞、分离自胚胎瘤细胞

5、干细胞体外诱导分化法：化学试剂诱导法、细胞因子诱导法、基因法。

6、成体干细胞：是成体组织内具有进一步分化潜能的细胞，是多能或单能干细胞。

7、干细胞巢：干细胞在组织中的居所。为干细胞提供了一个隐蔽的场所,直到有分化信号的刺激它才脱离静止的状态.

组织工程

1、组织工程：是利用生命科学、医学、工程学原理与技术，单独或组合地利用细胞、生物材料、细胞因子实现组织修复或再生的一门技术。

2、组织工程的三要素：种子细胞、支架材料、细胞因子

3、组织工程的3条技术路线：

1）将支架材料与细胞混合，移植到受损部位，随着细胞生长、支架材料的降解而取代或填补受损部位

2）将体外培养的细胞接种到受损部位生长进行原位修复

3）使用可降解三维多孔支架材料，接种培养细胞，体外再生组织或器官，移植替换。