蛋白质组学在肿瘤研究中的应用

蛋白质组学在肿瘤研究中的应用

□赵桂华　尹淑霞　郝万东　仲维霞

【摘　要】蛋白质组学是在后基因组时代出现的一个新的研究领域,是对机体、组织或细胞的全部蛋白质的表达和功能模式进

行的研究。生命的表现形式最终由蛋白质决定的,从蛋白质组学的角度进行肿瘤诊断与治疗具有积极的现实意义。近年来蛋白质组学发展十分迅速,蛋白质学在肿瘤研究中得到了广泛的应用。

【关键词】蛋白质组学;肿瘤研究;应用

【作者单位】赵桂华,山东省寄生虫病防治研究所;尹淑霞,济宁供水集团水质检测中心

郝万东,济宁市金乡县第一中学;仲维霞,山东省寄生虫病防治研究所

　　随着人类基因组计划的完成,生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代,生命科学的主要研究对象是功能

基因组学,包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。[1]1994

年澳大利亚M acquarie 大学的W ilkins 和W illia m s 提出了蛋白

质组(Pr oteome )的概念。[2]

2001年2月,《Nature 》和《Science 》

杂志对蛋白质组学研究进行了述评与展望。[3～4]蛋白质组学

有别于传统的单个基因或单个蛋白的研究模式,从机体或细胞的整体水平上来阐明生物体全部蛋白质的表达、修饰、结构功能和相互作用,以及蛋白质和核酸之间的相互作用,对生命的复杂活动有全面和本质的认识,在整体、动态和网络水平上对蛋白质进行研究。肿瘤是由环境和遗传因素相互作用的多

基因、多蛋白质参与的疾病。蛋白质组学(Pr oteom ics )可全面、动态、定量地分析比较正常与癌变标本中蛋白质种类和数量的改变,不仅有助于肿瘤发病机制的阐明,还能筛选和鉴定蛋白质特异性标记和特异性抗原,在肿瘤的早期诊断、治疗和

新药研制方面,具有广阔的应用前景。

[5]一、蛋白质组学在肿瘤研究中的方法

随着后基因组时代的到来,蛋白质组研究为尽早发现肿瘤标志物提供了可能,各种技术方法的发展为其运用于肿瘤临床诊断创造了条件,目前蛋白质组学技术在实验诊断与临床医学中已经得到越来越多的应用,在蛋白质组学研究中,蛋白质分离技术、生物质谱技术、生物信息学这三项技术对实验诊断与临床医学发展有决定性的影响,尤其对肿瘤的早期诊断至关重

要。[6]

蛋白质组学在肿瘤研究中的主要方法和技术如下。

(一)双向凝胶电泳技术(t w o -di m ensi onal gel electr opho 2

resis ,2DE )。该技术主要用于分离细胞或组织蛋白质抽提

物,构建特定组织或细胞蛋白质的“二维电泳图谱”,分析特定条件下蛋白质的表达状况,进行蛋白质组差异比较。2DE 技术凭借其高通量、高灵敏度、高分辨率和重复性好,便于计算机进行图像分析处理,可以很好地与质谱分析等鉴定方法匹配的优点,已成为目前蛋白质组学研究中最常用的蛋白质分离技术。其他的蛋白质分离技术有液相色谱和毛细管电泳技术。尤其是新近发展的液相色谱技术可与质谱联用,具有

高分辨率,可直接用于高复杂性蛋白质混合物的分析,对低丰

度蛋白的检测能力超过了2D -P AGE 。

[7]

(二)质谱技术。蛋白质组学研究中常用的质谱技术有:

(1)基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALD I -T OF -MS )技术;(2)电喷雾串联质谱(ESI 2MS/MS )技术;(3)表面

增强激光解析离子化-飞行时间质谱(SE LD I -T OF -MS )技术等。其中SE LD I -T OF -MS 应用基因芯片的设计理念,把层析、质谱等技术合理应用于蛋白芯片的检测,不需进行蛋白质的双向电泳,能快速、简便地从各种体液和组织中找出疾病相关蛋白质。其最大特点是快速、简便、易行、样品用量少和高通量分析,[8]有潜在的临床应用前景。近来质谱技术与液

相色谱联用(liquid chr omat ography/tande m mass s pectr ometry .

LC2MS/M S ),具有在高复杂性样本中鉴定低丰度蛋白质的

强大功能。有高敏感性和分辨率,具有较大的动态检测范围,且所需时间较短,每次操作时间不超过11h,可用于大规模临

床蛋白质组分析。

[9]

(三)蛋白质组的生物信息学。生物信息学其在蛋白质

组中的研究有两个重要应用:(1)构建和分析双向凝胶电泳图谱;(2)数据库的搜索与构建。在后基因组时代,生物信息学的研究内容已经从对基因组和蛋白质组数据的高效分析,转移到比较基因组学、代谢网络分析、基因表达谱网络分析、蛋白质结构与功能分析以及药物靶点筛选等,分别与功能基因组、蛋白质组、结构基因组等研究领域互相配合、紧密相关,

成为目前极其热门的系统生物学研究的重要基石。[10]蛋白质

组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础。生物信息学的发展已给蛋白质组研究提供了更方便有效的计算机分析软件,特别值得注意的是蛋白质质谱鉴定软件和算法发展迅速。最近发展的质谱数据直接搜寻基因数据库使得质谱数据可直接进行基因注释,判断复杂的拼接方式。

二、蛋白质组学在肿瘤诊断中的应用

蛋白质组学技术通过比较正常细胞与疾病细胞等各类细胞间的多种差异蛋白的表达,寻找与疾病发生发展相关的关键蛋白可深入探讨疾病的产生机制,通过质谱分析等技术确认差

・

021・

异蛋白,为疾病提供早期诊断依据。贾继辉[11]等运用固相PH 梯度双向凝胶电泳等技术,筛选出猴病毒40转化的人胃黏膜上皮GES -1,与人胃癌细胞MG C -803间若干与肿瘤发生密切相关的差异表达蛋白质。这种差异蛋白分析有助于深入研究胃癌的发生发展机制,进而为胃癌的早期诊断和防治提供依据。龙云铸[12]应用双向凝胶电泳和质谱技术,分析乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌HCC 癌组织与癌周肝硬化组织之间的蛋白质组差异,鉴定其中的差异蛋白质点,发现有表达水平存在显著差异的蛋白质点35个,14个差异蛋白质点得到了初步鉴定,其中癌组织凝胶中表达明显的蛋白质有8个:在癌组织中表达明显降低而在肝硬化组织中增强的蛋白质有6个。这为进一步阐明肝癌的发病机制和早期诊断,奠定了良好的实验基础,可能有助于癌变机制、肿瘤标记和治疗靶标的进一步研究。

三、蛋白质组学在肿瘤药物研发上的应用

(一)发现药物作用新靶点定向合成有效药物。疾病相关蛋白质组学可以提供一种发现和鉴定在疾病作用下表达异常蛋白质的方法。这种蛋白质可以作为药物筛选的靶点。疾病特异性蛋白的不断发现为药物设计提供了丰富的靶点:如

Chen 等应用蛋白质组学对MCF27乳腺癌细胞在加0.1

μmol/L 抗肿瘤药阿霉素2d 后的蛋白质表达变化进行了研究,结果

发现热休克蛋白27(HSP27)变化最为显著;以HSP27作为药物靶点有可能开发出新的抗乳腺癌药物。Oda 等采用蛋白质组学技术对有生物活性但未知靶点的化合物进行探测靶点研究,成功发现了E7070类抗肿瘤药物特异结合蛋白靶点,以此靶点为研究对象可进一步合成有效药物,并应用于临床治疗。

(二)药物作用机制的研究。通过运用蛋白质组学高通量地对比分析药物作用前后蛋白质表达谱或蛋白质表达丰度的改变有助于药物的作用机制的研究。如Steiner 等通过分析抑制素类降胆固醇化合物对小鼠肝脏蛋白质组的影响从药物治疗前后表达变化的蛋白质中鉴定出合成酶,从而阐明了该类降胆固醇药物的作用机制。此外,药物蛋白质组学的应用可使药物的子药理机制研究更快速和准确。

B runeau 等应用蛋白质组学对白色念珠菌在给予吡啶类药氟

康唑和伊曲康唑以及mulundcadin 类药物后的基因表达的变化,发现mulundcadin 类药物作用机制为抑制3D 葡聚糖合成酶的表达,而吡啶类药的作用机制为抑制麦角固醇合成酶的表达。上述研究提示通过蛋白组学研究明确分子药理机制,可使药物作用的关键靶点更加清晰,为药物研制带来新的思路和途径。

(三)药物毒理机制的研究。蛋白质组学在药物研究上的应用使人们对药物毒理机制的认识达到了一个新高度。通过这方面的研究,可以使许多药物的毒副作用得到准确而快速的揭示。尽管一些药物的毒性在临床上早已为人所知,但对其机制并不完全清楚。如庆大霉素明显的毒副作用是肾毒性,Kennedy 等运用蛋白质组学研究了庆大霉素治疗后的大鼠血清标本,发现了评价庆大霉素毒性的非侵入性标志物。此外,蛋白质组学与传统方法的有机结合在鉴定药物毒理机制上具有重要意义。如Heijne 等将蛋白质组学和基因组学结合起来研究溴苯的毒性发现了溴苯诱导多个基因的表达的

特性,表明了二者相结合的重要性。

四、蛋白质组学在肿瘤治疗中的应用

蛋白质组学研究现已在多种人类肿瘤组织或细胞系如卵巢癌、子宫癌、肾癌、胃癌中开展,并取得了一些成果。

(一)胃癌。胃癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤,在高病死率的恶性肿瘤中胃癌居首位。提高胃癌患者生存率、降低病死率关键在于早发现、早诊断及早治疗,而积极寻找敏感性和特异性较高的胃癌标记物为胃癌早诊断提供了强有力的手段。Ebert 等[14]利用SE LD I -T OF -MS 技术对胃癌和健康人血清进行研究建立了一个包含50个决策树的分类模型,在诊断胃癌的特异性和敏感性都达到100%。而Landuyt 等[15]对胃肠道间质瘤(GI ST )的研究发现,C -kit 基因中外显子9和外显子11突变的2组肿瘤,应用SE LD I -T OF -M S 检测蛋白质质谱发现有154个不同的蛋白质表达,提示C -kit 基因不同外显子突变的GI ST 可能具有完全不同的表现。

(二)肺癌。肺癌已成为本世纪发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,严重危害人类健康和生命。Ying 等[20]利用蛋白质技术探讨肺组织癌变过程。对原代细胞R15H 和经238Pu 高能量α粒子照射HP V218永生化人支气管上皮细胞

BEP20得到早期传代细胞R15H20,用蛋白质技术分析,发现

两系细胞中有43个蛋白质点强度改变,R15H20与R15H 相比,21种蛋白表达增加,22种蛋白表达减少;3种蛋白质仅在

R15H 细胞表达,其中2种被确定为高移动蛋白组1;在R15H20细胞中减少的2种蛋白被确定为mas p in 前体。

(三)乳腺癌。乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤,Luftner

等[16]应用蛋白质组学发现了分子量为2813K D 的血清蛋白

NMP66,其对乳腺癌早期诊断(无腋窝淋巴结转移)的特异性

达到100%,且对导管内癌的诊断敏感性高达80%,可作为预测导管内癌术后复发及治疗效果的重要指标。W right 等[17]也发现NMP66在健康人和乳腺纤维瘤患者以及乳腺良性疾病中均不存在。A laiya 等[18]研究发现,在不同临床病理类型中蛋白质表达形式也有所不同,侵袭性癌中核增殖抗原和某些膜蛋白质如HSP90、PHSP60等存在高度表达,而在乳腺纤维腺瘤和侵袭性癌之间共有24个已知蛋白的差异表达。

(四)宫颈癌。宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤,近年来发病率有明显增高及年轻化的趋势,严重威胁了广大妇女健康。Matsui 等使用22DE 和MALD I 2T OF ～MS 技术在ME2180

宫颈癌细胞中鉴定出I F N γ、T NF 调节蛋白和三种细胞因子调节蛋白(丙糖酸磷酸化异构酶、蛋白酶体亚单位C3及GTP 连接蛋白RAN )。Sahota 等[19]

使用W S Q4蛋白芯(0220000Da ),在50例患者(包含宫颈癌和非癌患者)中检测到32个蛋白峰,它们全部出现在阳性组或对照而在另一组缺如,说明宫颈癌组细胞的蛋白与非癌组有明显差异。

(五)卵巢癌。由于卵巢位于盆腔深部,不易扪及或查出,80%的患者就医时卵巢的恶性肿瘤都不是早期,医学上对其至今都缺乏有效的早期诊断方法,故卵巢癌已成为严重威胁妇女生命的肿瘤。Moshkovskii 等[20]采用SE LD I 2T OF2MS 、

22DE 及HP LC 方法对27份卵巢癌标本中的蛋白质组进行了

分析,结果发现15份(55.6%)标本中出现1117k Da 及11.

・

121・

5k Da 双峰,而对照组34份中仅有2份(5.8%)出现双峰现象,同时发现11.7k Da 的本质为血清淀粉A1,11.5k Da 为其

N2末端缺少精氨酸的变构体,二者皆可作为早期卵巢癌的肿

瘤标志物。Yu 等

[21]

采用SE LD I 2T OF2M S 方法研究了32例

卵巢癌肿瘤标本,29例作为健康对照,结果发现了5种潜在的肿瘤标志物:2085Da 、5881Da 、75Da 、9422Da 、6044Da,其敏感度、特异性和阳性预测值皆可达到96.7%。

五、展望

蛋白质组学研究内容和范围也在不断扩大,涉及到了各种重要的生物学现象,如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等等。在应用研究方面,蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一,为疾病的早期诊断与治疗提供可能。然而这些研究大量涉及到的仅局限于癌症和神经系

统疾病(如阿尔茨海默病、帕金森氏病)等临床发病机理不明、治疗无特效性的疾病。对其他系统疾病,尤其是有明确发病原因及治疗手段的疾病的研究则较少。在治疗上,主要用于临床指导用药以及临床药物的筛选。虽然它还有许多棘手的问题尚待解决,但是我们坚信,随着研究方法和技术的革新,蛋白质组学必将为诊断疾病提供全新的范例,对临床肿瘤研究起到决定性的影响。【参考文献】

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(上接第245页)审计工作水平的重要保证,因此,地勘单位

的内部审计机构必须依据国家的审计法律法规和国家的财经法规建立内部规章制度,按照内部审计规范所规定的程序、方法、内容等开展各项审计工作,规范内部审计机构和人员的行为,克服工作的随意性和盲目性,切实维护内部审计工作的严肃性,从而实现内部审计工作的法制化、制度化、规范化。

(五)明确内部审计工作思路。地勘单位内部审计工作

必须把工作定位在为本单位领导的决策当好参谋,促进加强

本单位内部管理,规范其各项财务收支行为,提高经济效益和社会效益上。地勘单位要搞好内部审计,就必须一切从实际出发,思想,实事求是,用市场经济的观点去观察、分析和处理审计工作中所检查出来的问题,及时向本单位领导提出决策依据和可行性建议,为领导的决策服务,把服务寓于监督之中。在具体的审计工作中,对审计发现的问题要在弄清事实的基础上,分析问题产生的原因和后果,立足于帮助,使之改正或找出妥善的解决办法,恰当做出处理和给出建议。

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