淀粉酶预习思考题答案要点

酶活力的测定其总体思路就是在底物过量的情况（一般[S]≧10KM），于酶的最适pH、温度等条件下测定某种酶作用产物的生成速度以表征酶的催化能力，并保证测定的是初速度（底物消耗小于5%）。所以本实验在保证以上要求下，以麦芽糖的生成量来表征淀粉酶的活力，并严格定义了酶活单位。在这个总体思路的指导下，我们首先必须关注的是：材料自身、原本就存在的被测定产物的含量！具体到本实验即是麦芽中自身已经存在的麦芽糖。这部分酶作用产物是必须要精确刨除的，否则我们实验的最终定量便无法准确。而这就是“对照管”要完成的任务。所以，所有的酶活力测定实验中都有所谓“对照管”的设计，其作用就是刨除所有非指定酶促反应测定时间段内的待测产物！以保证最终结果的可信准确。这是酶活力测定方法中最关键的设计。

2、实验最易产生误差的操作是哪个步骤？如何尽量减少误差？

酶促反应的启动和终止是操作中最需要精确控制的，以保证酶促反应时间的准确和平行管的相关性。即：本实验中测定管中加入淀粉和NaOH；同步加入或计算好时间差。同步加入是最完美的操作，所以由此类实验需求，进一步改进发明了“排”。

3、-淀粉酶活性测定时70℃水浴为何要严格保温15分钟？保温后为何要立即于冰浴中骤冷？

-淀粉酶的耐热也是有限度的，15分钟即保证了-淀粉酶最大程度的钝化，又保证了-淀粉酶活性的不受损伤。而立即冷却是为阻止-淀粉酶的复性。

4、pH5.6柠檬酸缓冲液的作用？各管于40℃水浴准确保温15分钟的作用？

pH5.6是本实验条件下酶的最适反应pH环境，酶促反应前保温15分钟是保证达到反应的最适温度，但时间过长则酶又会有失活的危险。

5．众多测定淀粉酶活力的实验设计中一般均采取钝化-淀粉酶的活力而测-淀粉酶和测总酶活力的策略，为何不采取钝化-淀粉酶活力去测-淀粉酶活力呢？这种设计思路说明什麽？

对于实验设计而言，非常重要的一点就是：理论上的可行性必须通过实际中的可操作性来实现。可操作性越强，所得实验结果可信度才越高。由此原则，热钝化-淀粉酶是体系外加热然后骤冷保证-淀粉酶在后续最适温度和最适pH环境下不会复性，继续-淀粉酶的测定；而不耐酸的-淀粉酶的钝化必须在体系内进行，后续测定又必须调节pH至5.6，-淀粉酶将会复性，不调节pH值，-淀粉酶的测定又缺乏严谨性，故而，虽然理论上可行，但实际中的可操作性很差。这是我们设计实验时必须注意的。

6．本实验中所设置的对照管的作用？它与比色法测定物质含量实验中设置的空白管有何异同？本实验可否用对照管调分光光度计的100%T？为什麽？

我们已经知道了酶活力测定中对照管的作用。所以从化学本质上讲，它与比色法中空白管的设计理念是完全一样的，都是用于刨除测定体系中的“本底”物质。只是各自刨除的具体对象不同。对照管所要刨除的是非测定时间段内所产生的作用产物，而比色法中的空白管所刨除是非测定物质在特定波长下的光吸收。由于对照管中含有麦芽糖，所以相关反应后将产生在A520下有特异光吸收的物质，所以不能用来做空白管调100%T，这是分光光度计的使用所不允许的。

7．我们所测定得到的总酶活力减去所测定得到的-淀粉酶活力是否就等于-淀粉酶活力？为什么？你的结论说明什麽？

仔细查看一下相关教材上关于这两种淀粉酶的作用位点就会明白，它们的活力绝非简单的加和。实际上它们是生命活动中酶协同作用的典范之一。-淀粉酶的作用产物是-淀粉酶的作用底物。它们的协同作用所产生的活力远远大于二者单独作用的活力之和，是种子旺盛生命力的根源所在。这一点大家由自己最后的活力计算结果便可明确感知的。生命因协作而精彩，生活也一样。

在本实验的活力计算上：

样品稀释的总体积： -淀粉酶的应为： 50 *（1+1+2+4）= 400

总酶的应为：  50 * 20 * 8 = 8000

关于最后的实验笔试考查：（开卷形式）

主要考查点：

1、相关实验基本操作规范（在此不要质疑为什么笔试考操作，因为许多操作如果从理论上你就没想过应该怎样做才合理，或者相关操作规定的合理性，那么你的实际操作能否正确我们很怀疑的。）

2、实验室良好实验氛围的建立与保持的基本素质。

3、解决相关问题的实验设计理念与实现可操作性的考虑。（实验设计能力）

4、相关实验结果的分析讨论、结论得出的能力。

嗯，希望能比较综合的提醒加强同时也考查一下大家的基本实验素质。算是一个实验课程的总结性考查吧。