摘 要： 建立快速，准确，灵敏的测定生长抑素原料药的方法。方法 采用沃特世ACQUITY UPLC超高液相色谱系统，以磷酸（取磷酸11Ml，加水900 mL，用三乙胺调PH至2.3，用水稀释至刻度1000）为流动相，（A）—乙腈 （B）梯度洗脱，流速：0.3ml/min；检测波长为215nm; 柱温45℃；进样体积2μL。结果 生长抑素在0.0051492mg/ml—0.12873mg /ml范围内有良好的线性关系（R2 = 0.9993），平均回收率（n=9）为99.1%。该检测快速，准确，灵敏度高，重复性好，为生长抑素原料药的质量控制提供了一种快速准确的方法。
关键词：超高效液相色谱 生长抑素原料药
生长抑素（Somatostatin）主要用于严重急性食道静脉曲张出血、急性胃或十二指肠溃疡出血、并发性急性糜烂性胃炎或出血性胃炎、胰、胆和肠瘘的辅助治疗，胰腺手术后并发症的预防和治疗，糖尿病酮症酸中毒的辅助治疗[1-3]。
超高效液相色谱法是一个新兴的领域，Waters ACQUITY UPLC™系统也出现不久，目前已发表的应用资料还很不足。与传统的HPLC相比，超高效液相色谱法的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍[4]。目前，UPLC多应用于代谢组学分析及其他一些生化领域，在天然产物的分析方面运用也逐渐兴起，因为在这些领域深入研究需要更高的分析精度。使用超高效液相色谱法对天然产物分析，特别是药物分析研究领域的发展将是一个极大的促进[5]。本实验选择采用超高效液相色谱法（UPLC）进行生长抑素原料药含量的测定，为提升生长抑素原料药的质量标准提供方法依据。
2 材料与方法
2.1材料
2.1.1仪器
沃特世ACQUITY UPLC超高液相色谱系统，配置ACQUITY PDA检测器及Empower2色谱管理软件（Mitford，Boston，MA,USA），十万分之一电子天平（型号： XP 205），超纯水制备仪（型号：arium 611UV），pH计（型号：PHS-3C）
2.1.2 试剂
乙腈为色谱纯（上海星可生化有限公司，批号：200912112），磷酸为分析纯（广东光华化学厂有限公司，批号：20070123），三乙胺为分析纯（东光华化学厂有限公司，批号：220081010），生长抑素原料药对照品（深圳市翰宇药业股份有限公司，批号:20090101 含量:8.3% ），生长抑素原料药样品（深圳市翰宇药业股份有限公司，批号：20090801）。
2.2 方法
色谱条件，美国沃特世ACQUITY 超高效液相色谱法系统，配置ACQUITY PDA检测器，色谱柱：ACQUITY BEN C18(2.1mm×50mm.1.7μm)流动相A：磷酸（取磷酸11mL，加水900 mL，用三乙胺调PH至2.3，用水稀释至刻度1000），流动相B:乙腈，进样体积：2μL，流速：0.35mL/min，检测波长：215nm，柱温：45℃。
洗脱程序：见表1
表1 梯度洗脱程序
| 时间（Min） | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 7.6 8.4 8.9 | 79 60 60 79 | 21 40 40 21 |
| 11.0 | 79 | 21 |
3结果
3.1 标准曲线
3 结果
3.1 标准曲线
取生长抑素原料药对照品12.873mg(精密称定，含量88.3%)，置50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密吸取0.2、 0.4、 1.0、 2.0、 3.0、 5.0mL
转移至10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，分别制成浓度为0.0051492 0.0102984 0.025746 0.051492 0.077238 0.12873mg/mL的对照品溶液。用上述超高效液相色谱法色谱条件进行测定，考察线性关系。结果显示，UPLC的回归方程及相关系数分别为y = 2E+07x-36684, R2 = 0.9993，线性良好。见表2
表2 标准曲线测定结果
3.1 系统精密度试验
取生长抑素原料药对照品12.815mg(精密称定，含量88.3%)，置250mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。制成浓度为0.05126 mg/mL生长抑素原料药溶液。用上述UPLC超高效液相色谱法色谱条件 ,在一天内连续测定六次.结果显示,生长抑素的峰面积的RSD为0.24％，系统精密度良好，结果见表3
表3 系统精密度考察结果（n=6）
| 编号 | 峰面积 | 平均峰面积 | RSD(%) |
| 1 | 858710 | 857152 | 0.24 |
| 2 | 856058 | ||
| 3 | 857670 | ||
| 4 | 860163 | ||
| 5 | 855097 | ||
| 6 | 855214 |
取生长抑素原料药样品三组，每组三份，第一组：8mg；第二组：10mg；第三组：12mg。具体为第一组：8.56mg、8.58mg、8.61mg。第二组：10.01mg、 11.2mg、10.98mg。第三组：14.42mg、13.66mg、15.23mg。分别置入200 mL容量瓶，定容至刻度，摇匀。用上述色谱条件进行测定,得出超高效液相色谱法平均回收率为99.1%，SD为1.7%。说明准确度良好，结果见表4
表4 回收率试验结果（n=9）
| 称样量(mg) 含有量（mg） 测得量（mg） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD(%) | |
| 8.56 7.71 7.69 99.8 8.58 7.72 7.67 99.3 8.61 7.75 7.51 96.9 10.01 9.09 9.06 99.7 11.12 10.01 9.96 99.5 10.98 9.88 9.83 99.5 14.42 12.98 13.01 100.2 13.66 12.29 12.32 100.3 15.23 13.71 13.57 99.2 | 99.1 1.7 |
取生长抑素原料药样品11.365mg (精密称定，含量88.3%)，置250mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。制成浓度为0.05126 mg/mL生长抑素原料药溶液。用上述超高效液相色谱法色谱条件,在0h、4h、8h 、12h 、24h 、48h进行测定，以生长抑素的峰面积进行考察，进样6次，测得RSD为0.5％。表明，至少在48小时内稳定。结果如表5
表5 稳定性实验结果（n=6）
| 编号 时间（h） 峰面积 平均峰面积 RSD（%） |
| 1 0 857403 2 4 849716 3 8 852136 855584 0.5 4 12 855371 5 24 8513 6 48 859967 |
取生长抑素原料药样品6份(分别为12.123g, 12.562g, 12.697g, 11.985g, 12.437g, 12.218g)置于250mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀。分别配成浓度为0.048492mg/mL，0.050248 mg/mL，0.050716 mg/mL，0.04794 mg/mL，0.049748 mg/mL，0.048872 mg/mL的生长抑素原料药溶液，在上述超高效液相色谱法的色谱条件下进行测定。结果显示，生长抑素的平均含量为.8%，RSD为0.7%，重现性良好。结果如表6
表6 重复性实验结果（n=6）
| 编号 含量（%） 平均含量（%） RSD（%） |
| 1 .31 2 88.92 3 90.13 .8 0.7 4 .82 5 90.51 6 90.32 |
3.5.1 取三批生长抑素原料药，分别为11.983g,12.685g,13.217g.溶于250mL的容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，制备成生长抑素原料药的溶液。用上述的超高效液相色谱法的方法，每个批次进样两针，根据色谱图的积分结果，得出生长抑素的含量，结果见表7
表7 UPLC法测定生长抑素原料药的含量
| 样品批号 峰面积 含量（%） 平均含量（%） RSD（%） |
| 20090801 851469 .21 849159 .13 20090902 948697 90.52 90.14 0.8 956872 90.66 20091101 986544 91.11 981309 90.21 |
色谱条件，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：以磷酸溶液（取磷酸11mL，加水900mL，用三乙胺调PH至2.3，用水稀释至刻度1000）-乙腈（色谱纯）为流动相，HPLC：Waters 2695 配置Waters 24 UV/visible Detector，色谱柱：Welch Materials XB-C18 5um, 4.6*250mm (100A) 流动相A：磷酸（取磷酸11mL，加水900mL，用三乙胺调PH至2.3，用水稀释至刻度1000摇匀）,流动相B:乙腈，进样体积：10μL，流速：1.0mL/min，检测波长：215nm，柱温：45℃ 。
洗脱条件（见表8）
表8
| 时间（Min） | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 18 20 21 | 79 60 60 79 | 21 40 40 21 |
| 26 | 79 | 21 |
图2 生长抑素的HPLC色谱图
测定结果（见表9、图2）
表9 HPLC法测定生长抑素原料药的含量
| 样品批号 峰面积 含量（%） 平均含量（%） RSD（%） |
| 20090801 3143407 90. 3179832 90.71 20090902 3201739 90.93 90.5 0.4 3098451 .92 20091101 3157923 90.62 3102573 90.32 |
4讨论
本文建立ACQUITY UPLC-PDA系统检测生长抑素原料药的方法，该方法的出峰时间仅为4分钟，与HPLC的10分钟的出峰时间相比[7]，时间减少了60%，能够快速的检测生长抑素原料药的含量。
本文所使用的UPLC方法中洗脱条件是从HPLC方法直接转换过来，并尝试过不同的流速，发现0.3ml/min的流速能达到要求,分离度、柱压等均能符合实验要求，所以选用此流速作为本实验的流速。
本文使用UPLC对生长抑素原料药通过标准曲线的制作，系统精密度、回收率试验、稳定性试验、重复性试验、以及不同批号的样品的测定。在系统精密度实验中得出生长抑素的峰面积的RSD为0.24％，表明系统精密度良好；在回收率试验中得出平均回收率为 99.1%，RSD为1.7%，表明系统的准确度良好；在稳定性试验中，通过对生长抑素原料药样品在0h﹑4h﹑8h ﹑12h ﹑24h﹑ 48h的测定，以生长抑素的峰面积进行考察，进样6次，得出RSD为0.5％，表明，至少在48小时内稳定；在重复性试验中，用生长抑素的含量测定考察，得出生长抑素的平均含量为.8%，RSD为0.7%，表明重现性良好；在不同批号的样品的测定实验中，分别用HPLC和UPLC对三批生长抑素原料药进行测定，用UPLC测得的含量为90.14%，RSD为0.8%，与HPLC测得的含量很接近，且RSD为0.8%，重复性较好。
与传统的HPLC方法相比，在速度，准确率，灵敏度方面具有明显的提高[8]。另外，由于UPLC在出峰时间方面的缩短不仅节约了时间，提高了检测的效率，还在很大的程度上节省了流动相的消耗，为使用单位在经济方面节约了不少。综上所述,基于UPLC方法快速，准确，灵敏以及低消耗的特点，它必将作为一个更好的方法而在含量检测方面成为大众的选择。
参考文献
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[2] 陈建忠，孙庆龙. UPLC法测定乌药中去甲异波尔定的含量[J]. 液相色谱质谱通讯，2009,53：10-13.
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[4] Want EJ, Wilson ID, Gika H et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS[J], Nature protocols, 2010, 5(6):1005-1018.
[5] Sterz K, Scherer G, Ecker J. A simple and robust UPLC-SRM/MS method to quantify urinary eicosanoids[J], Journal of lipid research, 2012(Epub ahead of print).
[6] Wang C, Wang YG, Liang QD, Rang WQ, Gao Y. Analysis of chemical composition in the combination of monkshood and pinellia by UPLC/Q-TOFMS with multivariate statistical analysis[J], Yao Xue Xue Bao, 2010, 45(10):1301-1306.
[7] Zhang CY, Dong L, Chen SL, Xie CX, Chang DL. UPLC fingerprint for quality assessment of ginsenosides of ginseng radix et rhizome[J], Yao Xue Xue Bao, 2010, 45(10):1296-1300.
[8] Tang F, Cai G, Yuan B, Zhang Z. Determination of flavones in different origin and parts of Bupleurum smithii var. parvifoliaum byUPLC-PDA[J], Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 2010, 35(21):2874-2876.
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