环境工程微生物学实验四 微生物数量的测定实验报告

学生姓名：                   学    号：                   专业班级：                  

实验类型：√ 验证 □ 综合 □ 设计 □ 创新   实验日期：            实验成绩：            

实验四   微生物数量的测定

一、实验目的：    

1了解血球计数板测定微生物数量的原理；

2    了解血球计数板的结构，学习并掌握血球计数板计数微生物数量的技术，包括样品的点样、菌数计数的方法与计算；

二、实验基本原理：    

镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌泡子可采用血球计数板；一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽(Petroff Hausser)细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。

血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网。每个方格网共分9大格，其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成。

    每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1／400mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室(大方格)的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为l／4000mm3。使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格(或中方格)中微生物的数量，再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。

    本方法适用于细胞数较多的样品测定（每毫升105～106以上），当样品中的细胞浓度较低时，须选择其他方法测定，否则因误差太大而影响实验结果。

图  血球计数板的构造

  a.平面图(中间平台分为两半，各刻有一个方格网)

    b.侧面图(中间平台与盖玻片之间有高度为0.1毫米的间隙)

血球计数板计数网的分区和分格

三、主要仪器设备及耗材：

显微镜、血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、吸水纸、滴管、擦镜纸、酵母菌液

四、实验步骤：

(1)取洁净的血球计数板一块，在计数室上盖上一块盖玻片。

(2)将酵母菌液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴(不宜过多)，使菌液沿两玻片间自行渗入计数室，勿使产生气泡，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌液。也可以将菌液直接滴加在计数室上，然后加盖盖玻片(勿使产生气泡)。

(3)静置约5分钟，先在低倍镜下找到计数室后，再转换高倍镜观察计数。

(4)计数时用16中格的计数板，要按对角线方位，取左上、左下、右上、右下的4个中格(即100小格)的酵母菌数。如果是25中格计数板。除数上述四格外，还需数1中格的酵母菌数(即80小格)。由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部菌体，防止遗漏。如菌体位于中格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。

(5)凡酵母菌的芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复分数2-3次(每次数值不应相差过大，否则应重新操作)，取其平均值，按下述公式计算出每毫升菌液所含酵母菌细胞数。

每毫升菌液含细胞数＝平均每小格酵母细胞数×400×10000×稀释倍数

a 、16×25的计数板计算公式：

每毫升菌液含细胞数=(100小格酵母细胞数/100)×400×10000×稀释倍数

                  =4×100小格酵母细胞数×104×稀释倍数

b 、25×16的计数板计算公式：

每毫升菌液含细胞数=(80小格酵母细胞数/80)×400×10000×稀释倍数

=5×80小格酵母细胞数×104×稀释倍数

(6)血球计数板用后，在水龙头上用水柱冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或吹风机吹干。

五、实验数据及处理结果

微生物的显微计数（25×16）

1、讨论本次实验结果的误差来源

七、实验体会及对实验改进的建议