临床生物化学实验原理、方法及检测

中国中医研究院广安门医院临床检测中心

    生物化学实验——是把化学(分析技术)和生物化学(实验反应原理)的方法应用于疾病的诊断、治疗、监控的实验分支。

一个生化实验的最后测定结果应包括四大部分来完成。

一、实验反应原理及分析方法（理论依据）

二、实验检测技术（手段）生化仪的分析技术。

三、质量控制程序（质量保证）室内质控、室间质评、仪器、试剂、人员五要素。

四、临床意义（目的）咨询服务、异常结果的解释。

实验反应原理及分析方法(理论依据)

一个生物化学实验的反应原理设计，首先要找出所检测的化学特性，如测定体液（首先是血液）中酶的含量血液中除少数酶（如凝血溶血酶、铜氧化酶及假性胆碱脂酶等）含量较多外，血液正常生理状况下含量微乎其微。一般每毫升含微微克（Pg）水平，要直接测定如此微量物质是相当困难的。用免疫化学方法可测定全部酶蛋白分子含量（不论其有无活性）而用化学方法测定只能测定酶的催化活性，间接计算出酶的含量。目前利用酶具有催化活性这一特性，在临床上已普遍应用测定酶蛋白，同时还可以测定三大代谢的产物，如糖、脂类、蛋白质、这样也就建立起利用酶促反应的一级反应测定代谢物的方法。一级反应—反应速度与底物浓度成正比，因此只有当酶反应为一级反应时，才能准确测定底物含量，（如测定血糖、总甘油三脂、总胆固醇等）。从此在临床试剂盒的方法中出现了以酶为试剂测定各种代谢产物。

临床化学方法的分类

特别是自动生化仪方法的特点

以往临床化学实验都采用比色法进行各个项目的测定，这是因为比色法具有微量、迅速、准确的优点，特别适合于微量的生物体体液中各项物质测定。

在一般比色法中，手工使用比色计或分光光度计可以测定各种反应溶液的吸光度，但由于很难控制测定时间和反应温度，很难准确记录反应过程中吸光度变化，因此，毫不奇怪在很长一段时间内我们所使用的方法，都是在呈色反应达到完全或者反应达到平衡时，吸光度达到稳定时才进行测定。即所谓平衡法或终点法。

但自从自动生化仪出现后，从根本上改变了上述情况。通过各项先进技术，人们可以精确测定反应的动态过程。并可以准确计算任何一段反应时间内的反应速率，这样大大开阔了临床化学家对方法选择。除经典的终点法外还可以进行动态测定。这样不仅缩短了操作时间，大大提高了工作效率，还可进行一些用常规比色方法不能进行的测定。如测定酶反应的初速度（Vo）等等。测酶初速度（Vo）只能用分光光度法。

因此，用好自动生化仪一个重要前提必须对自动生化仪可以提供的测试方法类型有所了解。

生化自动分析仪特点：

1 精确测定反应的动态过程；

2 准确计算任何一段反应时间内的反应速率；

3 除经典的终点法外还可以进行动态测定。

分析方法的分类

临床化学常用方法按表1分类：

表1    分析方法分类

分析方法中的测定步骤

        物理化学方法                     物理方法

平衡法              动态法           平衡法     动态法

         可变信号法    固定信号法     

在临床化学中绝大多数方法都是所谓物理——化学方法。也就是将所测定物质进行一些化学转化后再进行测定。例如在实际工作中测胆红质，不是直接在n m测定，而是先进行重氮化反应后比色定量测定生成的有色偶氮化合物。

绝大多数化学反应都经历一个类似图1的反应过程。

图中虚线明显将反应分为二个截然不同时期，左面期中所测的产物浓度在不断变化之中，由传感（Sensor）所得到的信号也在相应改变之中。如所用的方法主要是根据这期间所获得的信号进行计算，这称之为动态法。

相应在图中虚线右边时期，传感器所得到信号相对不变，如根据

                 动态期               平衡期

        产        

酶反应速度

或酶活力

        物   

                            时间

               图1 化学反应的过程

这些信号计算的方法称之为平衡法。从科学上说此术语显然比终点法更为确切，因为信号无变化，不一定意味着反应完全达到终点。

正因为在这期内传感器所得到信息变化不大，因此对测定的条件如时间，浓度，PH……要求远没有动态法那样严格，所以不要求特殊仪器，而且精密度较高，非常适宜于一般仪器和实验室使用。

图1也同样适用于酶催化的反应，在动态期酶所催化产化的物质处在一个动态变化之中，在酶作用一段时间后，由于基质消耗逆反应出现，底物的抑制作用等，反应速率愈来愈慢，最后达到平衡期。此时基质和产物浓度不出现变化，因此很清楚如要测酶活性，只能在动态期测定酶所催化反应的速率。所以严格说测酶方法不论用自动生化仪，记录或分光光度计或普通比色计都包括在动态法的范围内。

平衡法（终点法）

  这是目前我国生化实验室常用也是大家所熟悉的方法。其特点是对测定条件尤其是测定时间和温度要求不严格，所以容易掌握，计算结果方便，精密度好，但由于反应达到平衡需要一定时间，一般都需十分钟以上，因此整个操作时间长，工作效率低，目前不少自动生化仪特别是离心式分析仪改用动态法。即使采用平衡法时也对方法进行修改，设法缩短动态期。例如同是糖激酶——葡萄糖—6—磷酸脱氢酶法测血糖，手工法往往需15分钟后比色，但在自动生化仪中由于加大工具酶用量，在3分钟内就达到终点。另外应用计算机技术在每一个标本达到平衡时就可分别进行终点测定。

近年来有一种倾向就是将特异性较差的化学法改为特异性酶法。即以酶作为试剂来测定血中各种代谢物质。

这类方法和经典的平衡法有所区别，下面做一个简单叙述：

这类方法特点是被测物质（酶反应的基质）在酶反应过程中完全被转化或消耗掉（即达到反应终点），通常这类方法操作简单，一般不需要作标准管，通过一些已知的理化常数例如克分子吸光系数等不难将结果计算出来，其缺点是反应时间较长，特别不适合于离心式自动分析仪。另有少数酶反应，基质并未完全消耗掉，只是达到一个动态平衡，此时往往需要同时作标准管。

动态法(连续监测法)

动态法——即根据某一物质对一个反应的催化或延缓作用来测定期含量，这是通过秒表测量反应延缓时间而达到此点。

从六十年代开始，动态法得到迅速发展，这是由于一系列高技术发展的结果：出现了高质量的电化学和比色传感器，温度控制的比色杯，迅速混匀技术，以及自动数据处理系统等，人们避免了繁杂的计算，可以迅速直接得到测定结果，满足了临床医学大量生化标本的要求。反之动态法的使用也大大推动临床化学发展，仅用有限人力可以测定成十倍原来的工作量。如测酶活性全部使用此方法。

实验检测技术（生化分析仪的分析原理）

人体的供能、合成与代谢是由、糖（碳水化合物）、蛋白质、脂肪来完成的。临床上蛋白质的检测是测定蛋白质的20多种氨基酸，采用的是吸收光谱和分光光度法。

生化分析仪的组成：分析系统、数据处理系统（计算机、显示器、打印机）附件等。全自动生化分析仪还配有电解质系统（ISE）。

生化分析仪适用于医学实验室血液中物质含量的测定，也可测定体液中小分子量的物质。

生化分析仪最简单的测定原理——单色光测定反应物浓度的吸光度OD值。

比色分析的基本原理

许多化学物质的溶液具有颜色（无色的化合物也可以加显色剂经反应生成有色物质），当有色溶液的溶度改变时，颜色的深浅也随之改变，浓度愈大，颜色愈深。因此，可以用比较溶液颜色深浅的方法来测定有色溶液的浓度。这种方法叫做比色分析法。

一、朗伯—比尔定律

当一束单色光通过有色溶液时，入射光线的一部分被器皿反射回来，一部分被溶液吸收，另一部分则透过溶液，如图所示。它们之间有以下关系：

Io=Ia+Ir+It               1-1

Ir

式中：Io—入射光强度                   

It

Io

浓度C

      Ia—吸收光强度              

L

      Ir—反射光强度                      

      It—透过光强度

由于在实际测定时，所用的比色皿都是同质料用规格的。反射光的强度为一定值，不会引起测量误差，所以反射光的影响可以不加考虑。则上式可简化为：

               Io=Ia+It              1-2

    从式1-2可知：当入射光强度Io为一定时，被吸收光强度Ia愈大，则透过光强度It愈小。也就是说：光强度的减弱仅与有色溶液对光线的吸收有关。

那么，溶液对光线的吸收与哪些因素有关呢？实验证明：溶液的浓度C愈大，液层厚度L愈厚（即光线在溶液中所经过的路程愈长），则溶液对光线吸收的愈多。它们之间的关系有下式决定：

Io

It

                      lg     = KCL      1-3

这个公式就是朗伯—比尔（Lambert---Beer）定律。

公式中的K称为吸光系数，它表示有色溶液在单位浓度和单位厚度时的吸光度。在入射光的波长、溶液种类和温度一定的条件下，K为定值。吸光系数是有色化合物的重要特性之一，在比色分析中有着重要的意义。K值愈大，表示该物质对光的吸收能力愈强，浓度改变时引起吸光度的改变愈显著，因此比色测定时灵敏度愈高。

朗伯-比尔定律即有色溶液对一定强度光的吸收程度，与液层厚度和溶液中有色物质浓度的乘积成正比。其中朗伯定律说明吸收光与厚度间的关系；比尔定律说明吸收光与浓度间的关系。 

朗伯—比尔定律在光电比色计中的应用

假定有两种有色溶液，其中一种是已知浓度的标准溶液，另一种是待测溶液。根据公式：

               在标准溶液中：As=KsCsLs           1-4

               在待测溶液中：Ax=kxCxLx           1-5

将式1-4除以式1-5可得：KsCsLs

As

KxCxLx

Ax

                 =                         1-6                        

如果上述两种溶液的液层厚度相等、温度相同而且是同一种物质的两种不同浓度的溶液，测定时所选用的单色光的波长亦相同，则有：

Ls=Lx、Ks=Kx ，代入式1-6可得：   Cs

As

Cx

Ax

=                         1-7

由此可见，在上述条件下，吸光度与浓度成正比。这一关系式就是光电比色计的设计依据，也是比色分析的基本计算公式之一。式中标准溶液的浓度Cs为已知，As和Ax可用光电比色计测量出来，则待测溶液的浓度Cx即可求出：

Ax

As

Cx =      × Cs                    1-8

由于在实际测定时，标准溶液和待测溶液都要加以稀释，而且在报告结果时，多以100毫升（或1000毫升）中的含量来表示。因此，在实际计算时，就需要在上式中乘上稀释因数。

求待测溶液浓度的方法有：直接比较法（计算法）、因数法和标准曲线法三种。这些方法在“生物化学及生物化学检验技术”课程中有介绍。

波长的选择：

由于有色溶液对光的吸收具有选择性，因此进行比色测定时，滤光片必须加以选择，否则灵敏度很低，导致测量结果不准确。选择滤光的一般原则是：滤光片最大透过的光线应该是溶液最大吸收的光线。从颜色上看，滤光片的颜色与待测溶液的颜色应为“互补色”。

什么叫做互补色呢？凡是两种颜色相加后能得到白色，则此两种颜色就称为“互补色”，图中直接相对的两种颜色，均为互补色。

                              绿

                 黄                         青

青蓝

白

橙

                                  蓝

               红                           兰 

                              紫

为什么选择滤光片时，要使滤光片的颜色与待测溶液的颜色为互补色呢？这是因为滤光片和有色溶液具有相似的透光特性，与它们本身颜色相同的色光，能够最大限度地透过。而与它们本身颜色成互补的色光都能被最大地吸收。

待测溶液和滤光片的颜色

   室内质控IQC包括精密度，一般用CV%。

  室间质评EQC包括准确度，一般用偏差。

  参考系统的选择及溯源性包括仪器自身校准溯源及国家的溯源系统。

  检测系统的稳定性以及仪器的校准。

自动生化分析仪使用中的校准 

对自动生化分析仪检测系统精密度和准确度的验证。

仪器、试剂、校准品、操作程序等的组合为——检测系统。

生化室自定了检测系统——并使用了带溯源性的仪器、试剂、校准品、操作程序。

实验结果具有可靠的溯源性。

检测系统包括四部分外，手工操作还必须包括具体操作人员。所以我们认为在检测系统中任何一个组分的改变，都会影响检测结果。在确定仪器、试剂等的性能其实都是组合的检测系统的共有性能。

建立校准方法，选择合适的校（标）准品，包括校（标）准品的树木、类型和浓度；如有可能，校（标）准品应溯源到参考方法和/或参考物质；确立校准的频度。

校准验证：有可能，方法应追溯到参考方法或已知值的参考品；确定校（标）准品的数目，类型和浓度，校准验证的接受限，以及校准验证的频度；确定检验结果的报告范围，确定时必须包括一个最小值（或零），和此范围上限的最大值。

至少每六个月以及有下列情况发生时，进行一次校准：

改变试剂的种类，或者批号。但如实验室能说明改变试剂批号并不影响结果的准确，则可以不进行校准。

仪器或者检测系统进行过一次大的预防性维护或者更换了重要部件，这些都有可能影响检测性能。

质控反映出异常的趋势或偏移；或者超出了实验室规定的接受限、采取一般性纠正措施后，不能识别出和纠正问题时。

所有进行过的校准和校准验证工作都必须记录并写成文件。

1. 酶活力单位的计算。国际单位—规定一个国际单位为在实验室规定条件下（如37ºC、最适合的PH、最适底物浓度时（每分钟催化一个微摩尔底物变化所需要的酶量。

2. 什么是法定计量单位。一般采用摩尔单位，凡分子量已知的物质算出相对分子量（Mr）或相对原子量（Ar）。mg/dl与mmol/L的换算，求出系数。

3. 实验中尽量避免基质效应。

体外诊断试剂盒性能指标

以OLYMPUS生产的甘油三脂试剂盒为例。分析批内CV<3%，总精密度CV<5%，30天定标一次原厂家定标液，溯源追踪到CAP的血清脂类RMO16#2，更换试剂批号，质控出现漂移，仪器做保养后重要零件更换时作定标。

线性范围10至1000mg/dl，用mmol/L报告时 x 0.0113。

干扰性    乳糜达到500mg/dl影响<7%

          胆红素达到32mg/dl影响<10%

          抗坏血酸达到20mg/dl影响<1%

病人准备：10—14小时进食，如用血浆肝素和EDTA抗凝。

标本稳定性4度稳定7天，－20度稳定3个月。

为什么要定标？多长时间要定标一次？

定标的意义：定标就是要找出一个参考点，就是一个K值（或F值）。它是由仪器与试剂状态确定下来的。当我们测定一个标本时，无论您是用手工的方法或全自动生化分析仪，测出来的值只是一个吸光度，这个吸光度对我们没有什么意义，我们要把这个吸光度转化成一个浓度或是酶的活性。那就要乘上一个K值，计算并打印出来的结果对我们就有意义了。K值就是我们通过定标找出来的。一般上最低要求是由试剂空白与标准品。经过仪器测定出两个吸光度。

A标准－A试剂空白  （试剂空白通常是0）             

标准浓度－试剂空白

K=

标准液的浓度我们是知道的，这两个吸光度可以由仪器测出，这样就得出一个K值。无论什么样的标本，用其吸光度乘以K值我们就得到了答案。因此，K值具有非常决定性的意义，可以决定标本的准确性。

K值的决定因素：我们看看K值会受到什么影响呢？第一，标准液的浓度一定要准确（标准液最好与标本一样是以血清为基质的）。第二，标准液的吸光度与试剂空白的吸光度一定要准确。吸光度受仪器状况、试剂状况的影响，如果您的仪器相当稳定，试剂是影响K值的一个主要因素。

如何确定K值是正确的？一般我们用质控血清来检查，最好是两种水平的质控来检查，如果质控结果很好，可以说K值是准确的，用这个K值计算出来病人的结果也是准确的，所以K值非常关键。

K值的真面目：K值实际上代表了斜率，截距代表试剂空白，试剂空白每天都在变化，所以K值的稳定性决定您的仪器与试剂，如果仪器与试剂都十分稳定，那K值也很稳定。

多长时间定一次标合适？这要看您试剂的稳定性，质控结果不好，有些项目做试剂空白可以解决，有些项目要做两点定标。

TV × 1000

酶的项目如何确定K值：一是计算出来的理论K值；

SV × L × ε

        K = 

二是用有酶项目的定标液得出K值：目前各公司可以提供多项目的定标液，不仅有底物类的项目，也有酶类的项目。

测定特种蛋白为什么要用多点定标

  透射免疫比浊时，由于抗原与抗体结合的过程中，吸光度与浓度之间不成线性关系，一般是三次方程曲线关系。若要将抗原与抗体两个变量之间的变动特征恰当地反映出来，需要经过三次方程拟合成近似直线化的方程，在进行运算，免疫比浊实际操作过程中可采用终点法或速率法。用五点或七点不同浓度进行定标，经三次曲线方程拟合求出一条能反映真实情况的浓度与吸光度的关系曲线方程，作为定量的工作曲线。如果以单一标准浓度定标用一次方程直线回归运算所测结果仅在标准浓度上下波动，真正的过底过高值无法测定。

生化自动分析中国发展概况

  临床化学检验自动化在中国的发展，九十年代中期曾有学者将其分为4个时期如表1。

表1 生化自动分析在中国的发展分期