离子束介导甘蓝全DNA转化拟南芥菜的RAPD分析

离子束介导甘蓝全DNA 转化

拟南芥菜的RAPD 分析

卞　坡1,2　秦广雍2　余增亮1　霍裕平2　王　燕2

(11中国科学院等离子物理所,安徽合肥　230031;21郑州大学离子束生物工程实验室,河南郑州　450052)

摘　要:在离子束介导甘蓝外源全DNA 转化拟南芥菜的当代发现了2株表型变异株,以其中的

1株(编号为T6)作为研究对象,用40对10碱基的随机引物对该株和其后代株进行RAPD 分

析,发现S168号引物对T6和其后代株的RAPD 结果与对照相比有明显差异,说明离子束介导

外源基因转化可以引起受体基因组变异,并且该变异有遗传性。对差异条带测序后同拟南芥

菜基因组序列比对,发现该条带的序列在ABC Transporter 结构基因的内部。

关键词:离子束;RAPD ;拟南芥菜;全DNA 转化

RAPD ANA LYSIS OF Arabidopsis thaliana TRANSFERRE D WITH

TOTA L DNA OF CABBAGE B Y ION BEAM

BI AN P o 1,2　QI N G uang 2y ong 2　Y U Z eng 2liang 1　H UO Y u 2ping 2　W ANG Y an 2

(1.Institute o f Plasma Physics o f Chinese Academy o f Sciences ,H e fei ,Anhui ,　230031;

2.Ion Beam Bio 2Engineering Lab o f Zhengzhou University ,Zhengzhou ,H enan ,　450052)

Abstract :T w o mutants were found am ong the Arabidopsis thaliana trans ferred with total DNA of cabbage.Variation of genome of T6and its offspring were analyzed by RAPD 2PCR with 40random primers.The result from S168primer was different from the CK,indicating that variation of genome can be made by total DNA trans ferring by use of ion beam ,and this variation is hereditary.It is found that S 16821850is included within the gene of ABC transporter by aligning with genome of Arabidopsis thaliana in T AIT.

K ey w ords :ion beam ;RAPD ;Arabidopsis thaliania ;trans ferring ;genome

收稿日期:2002205216

基金项目:国家科技攻关项目资助课题(2001BA302B -03)

作者简介:卞坡(1973～),男,河南人,在读博士,从事离子束介导转基因的机理研究。

低能离子束介导植物转基因是近几年发展起来的一种遗传转化技术。低能离子作为一种集质、荷、能于一体的离子首先应用于材料表面改性的研究。余增亮[1]发现低能离子与生物组织相互作用时,动量和能量的沉积引起的物理和化学溅射作用能对生物组织进行层层刻蚀,因为生物组织本身的结构具有极度的不均一性,刻蚀的结果是在生物组织内部形成可供大分子通过的“通道”。另外,低能离子作为带电离子,在与生物样品的作用过程中,富集在细胞表面的正电荷能改变细胞膜的通透性,这些低能离子与生物组织作用的独有特性使这项技术很快应用到植物转基因工作中来,并在水稻、棉花、小麦和烟草上得到成功的应用[2,3]。但对离子束介导外源全DNA 转化技术却颇有争议,外源DNA 片断能否进入受体,其整合规律和对受体基因组的影响以及转化受体的遗传性和遗传规律等都是需要研究和解决的。本文以拟南芥菜为转化受体,以拟南芥菜的同科植物甘蓝为转化供体,用RAPD 作为分析手段,研究离子束介导外源DNA 转化中的基本规律。

053　核农学报　2003,17(5):350～353

Acta Agriculturae Nucleatae Sinica

1　材料与方法

111　材料

拟南芥菜为C olumbia 生态型,来自英国Nottingham 大学拟南芥菜储存中心,编号N1092。甘蓝为红

甘蓝。宿主菌DH5

α,T 2载体pUCm 2T 。离子注入机为俄罗斯产TIT AN 源低能离子注入机,PCR 扩增仪型号为G eneAm pPCR System 2400,DNA 测序仪器为ABI PRIS M 377296,测序试剂为BigDye terminator v210。基因组DNA 小量制备试剂盒(No.SK 252),UNI Q 210柱式DNA 胶回收试剂盒(No.SK 131,NaI version ),T 2载体PCR 产物克隆试剂盒(D0211,pUCm 2T vector ),RAPD 引物,T aq plus DNA P olymerase ,dNTP 以及相关试剂购自上海生物工程公司。

112　方法

11211　供体甘蓝基因组的提取　采取CT AB 法[4],所得基因组片段长度30～50kb ,集中于40K b 。OD 260ΠOD 280=119,溶解于pH810的TE ,调整浓度为800μg Πml 。

11212　拟南芥菜种子的离子注入　注入离子为Ar +,能量30keV ,剂量115×1017ions Πcm 2

,脉冲注入,25H z ,400μs Πplus 。注入完成后立即浸入800μg Πml 的甘蓝全DNA 溶液,浸泡12h 后,用TE 溶液冲洗种子3遍,蒸馏水冲洗1遍,置4℃冰箱春化48h 。种植于光照培养间,种植数目100粒。设同样数量的原种对照、离子注入对照、原种、离子注入浸泡TE 对照。培养间条件:土壤为花卉营养土,pH 值415～510,光强5000～6000Lx ,光照时间16h ,温度20～22℃,昼夜温差2℃。

11213　RAPD 模板的提取剪取拟南芥菜营养生长中期的鲜嫩叶片约100mg 。用酒精擦净叶面,蒸馏水冲洗3遍,-20℃保存。模板DNA 抽提时,对抽提试剂盒GE NOMIC DNA MI NPREPS KIT 的抽提步骤稍加改动(加入Cell Lysis S olution 后65℃温浴1h ,加入Precipition S olution 后65℃温浴30min ),提取的DNA 溶于pH910的TE 。基因组片段长度40kb 。

11214　RAPD 反应　选择40条10碱基随机引物,25μl 反应体系,T aq Plus 10×Bu ffer 215μl ,T aq plus

DNA P olymerase 1μ,25ng 的模板DNA ,dNTP (dATP ∶dTTP ∶dCTP ∶dG TP =1∶1∶1∶1)400μM ,primer 014μM 。

RAPD 的反应条件:94℃预变性30s ,46个扩增循环为95℃变性30s ,38℃复性15s ,72℃延伸反应1min ,46个循环完成后,72℃补平8min [5]。按照任瑞文[6]

的方法进行优化实验。112%的琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察照像。

11215　转化　对RAPD 结果中的感兴趣条带用胶回收试剂盒回收,克隆到pUCm 2T 载体后转化到预先

制备的DH 25

α感受态宿主菌。平板培养,挑取白斑,摇瓶培养过夜,提取质粒,电泳验证目的片段是否插入到载体中。确证后测序。

2　结果

211　表型变异

在100株经离子束介导甘蓝全DNA 转化的拟南芥菜中,出芽94个,成苗90株,黄化苗3株,表型变异2株,变异率为516%。选择其中表型变异较大的1株(T6)作为本实验的研究对象(图12A )。该株在营养生长阶段从第4片叶原基发育开始异常,第5片叶原基位置错位,其后叶原基发育不再为螺旋状,叶子短小,形状极不规整,成簇状生长。进入生殖生长期的时间较对照晚12d 。Ⅰ、Ⅱ型体节均正常,但整个株型较对照弱小。T6株2代播种10粒,成活4株,表型与对照相比无明显差异。

212　RAPD 分析

提取的拟南芥菜样品DNA 经紫外分光光度计检测,A260Π280>118,经112%的琼脂糖凝胶电泳检测,DNA 片段整齐,片段大小40kbp 。符合RAPD 实验的要求。RAPD 扩增选择了40条引物对2个CK 和T6株的基因组做RAPD 分析,这40条引物分别是S 41260和S 1612180,其中39条引物对CK 的RAPD 2

153　5期离子束介导甘蓝全DNA 转化拟南芥菜的RAPD 分析

PCR 反应产生130条特异条带,T6与对照相比有4个条带缺失,占总数的311%。这4个条带分别为S161(740bp )、S168(1185kb )、S176(119kb ,960bp )。其中S168引物拉出的条带与对照存在稳定差异,分子量为1185kb (记为S 16821850)的条带消失,分子量为215kb 的条带加强,该条带的加强可能是受S 16821850消失的影响。用S168号引物对4个2代株基因组的RAPD 检测结果和转化当代T6的结果完全一致,如图2。S168引物产生的特异结果重复性好,经3次重复,结果稳定。S168引物的序列为5’2TTTG CCCGG T 23’

。

图1　当代变异株

Fig.1　Mutation of trans fered generation

A :T 6,

B :CK

图2　T 6和其2代的RAPD 分析结果

Fig.2　RAPD results of T6and its 2nd generation

1:M arker ;2,3:对照;4,5:T 6;6,7:2代对照;

8,9,10,11:2代株

1:M arker ;2,3:CK;4,5:T 6;6,7:CKof 2nd generation ;

8,9,10,11:2nd generation

213　测序结果

为了标定S 16821850在拟南芥菜基因组中的位置,回收CK 中S 16821850测序,测序引物M13(2),测序结果如下:

　　5’2TTTG CCCGG TG TGG AAAG T ACT AAAG CCG CTTG AAAAAT C ACTT ACCG AC AC AT AG TT AT AAGG TTG TT C 2

T CT CTTG TT CT AAT ACTG TT CTTGG ACCTT CTT AG ACG T AACTT CTTG T AT AAAG T CTG C AACCCCTTT ACTTT C AG 2

G AC ATTGG AAACT AAAG T ATT C AAAG AACT C AAG AACG TTG T CCCG TGGG CCTTG TT AG AC AATTTGG CCCT CGG 2

AAAG C AAG AT AATG T CG T C AAAAAG C ACG AATG T CT CTGG TG CTGG TTG T AG AAACG AAAT AAT C AT CG TT AC AT 2

CCG AG AT ATG AACT AG TTGG CT C ATG AACTTG C AAATTTG AAAGG TTG TGG AACT AT CC AAC 23’

上述序列为从RAPD S168引物开始的360个碱基长度。除去了测序引物M13(-)和RAPD S168引物间的91个碱基长度,这360个碱基长度在测序仪的有效测序范围内。该链为模板链。

3　讨论

本实验设计了严格的对照体系,包括原种对照、离子注入对照、原种、离子注入浸泡TE 对照。在以上的一系列对照中,均没有产生黄化苗和表型变异的株系,说明转化当代的变异和T6的RAPD 分析中差异条带的产生是外源DNA 片段的导入引起了受体基因组变异的结果。幼苗的主体组织结构实际上253核　农　学　报17卷

是顶2基轴向模式(axial pattern )和辐射径向(radial pattern )的叠加。拟南芥菜胚中顶2基轴的模式是幼苗主体组织结构的胚胎来源。在拟南芥菜的两个子叶的凹陷处是茎分生组织,也叫茎端分生组织。在种子萌发后,植物地上部分的所有组织细胞包括叶与茎的形态发生都与茎分生组织密不可分。T6在幼苗期的表型异常,说明了离子束介导的外源全DNA 片段转化到了拟南芥菜种子胚的分生组织细胞。外源DNA 片段对受体细胞的影响有两个方面,一是外源DNA 片断整合到受体基因组中,改变了受体中某些基因的表达,或者基因的机制,作用是插入诱变。二是外源片段携带的完整基因整合到受体基因组的合适位点后,自身也可以在受体细胞中表达。以上两种情况导致的分生组织细胞变异都能影响拟南芥菜幼苗发育时的结构特异元件,从而使拟南芥菜在营养生长阶段表型异常。但幼苗期的主体结构模式来源于胚胎生成的建成模式,所以幼苗的主体建成模式没有改变。拟南芥菜成熟胚的茎分生组织是一个有多细胞形成的组织,通过这种基因转化操作发育成的植株是嵌合体。因为植物发育过程中的时间和位置效应,分生组织中受外源基因转化而产生变异的细胞最终发育成植株的那一部分器官没有明确的规律。如果生殖器官和当代变异部分没有同一的细胞来源,那么这些当代的变异就会在2代中丢失。这可能是T6的2代表型恢复正常的原因。如果生殖器官和某些当代的变异有同一细胞来源,当代变异的性状就会遗传到后代。以S 16821850作为分子标记,其在T6和其2代株中的缺失说明了这种外源基因的转化操作产生的某些基因组变异是可以遗传的。

以S 16821850的测序部分作为Query ,用BLAST (Basic Local Align Search T ool )对T AIT 的比对表明,该序列同比对结果中的高分值序列有着很高的同源性,匹配率为96%,EXPECT 值E 2175,这说明我们的搜索结果就是S 16821850。BLAST 搜索的结果表明,S 16821850和ABC Transporter 转运蛋白的编码基因同源,检索名AT1G 66950,类型orf ,T AIT 检索号:G ene :2019692。该蛋白也称为P 2glycoproteins [7],主要构成细胞的膜泵,它的一个重要功能是通过阻止有害物质在细胞内的积累,保护组织不受外来有毒物质的侵害。当一个有害的分子(如Drug )进入细胞,该蛋白的胞内部分就迅速捕获到该物质,通过该蛋白的一系列作用将该有害分子“泵”出细胞。ABC Transporter 的编码基因的编码区的长度为6223bp ,有20个外显子。S 16821850的3’端在该基因的2202bp 位点处,此处为ex on 1791-2691。RAPD 反应在引物和模板5’端不完全配对的情况下反应也能进行,因为S 16821850的5’端没有测序,不能确定5’端的具体位置,根据长度计算,S 16821850的5’端在该基因的第2个外显子(ex on12395)内部。本实验中S 16821850的缺失应该有以下3个方面的原因:(1)ABC Transporter 结构基因内部的S168引物结合位点的碱基组成发生变化;(2)两个PCR 引物结合位点之间插入外源大片段,使两个引物之间的距离超过了PCR 的扩增范围;(3)两个PCR 引物结合位点之间(包括结合位点)的片段发生严重缺失。因为S 16821850在ABC Transporter 结构基因的内部,可以肯定S 16821850的变异是ABC Transporter 基因的一级结构变化引起的,其变化的细节和对该基因功能的影响还需进一步的研究。

参考文献:

[1]　余增量.离子注入水稻诱变育种初探.安徽农业科学,19,39(1):12～16

[2]　Y u.Z L ,Y ang JB ,Wu Y J ,et al.T rans ferring G US gene into intact rice cells by low energy ion beam.Nucl Instr M eth Phys Res ,1993,B80281:

1328～1331

[3]　吴丽芳,李红,等.用低能氩离子束介导将水稻几丁质酶基因导入小麦.科学通报.2000,21:2316～2321

[4]　F.奥斯伯,等.精编分子生物学实验指南.北京:科学出版社.1998,37～38

[5]　R obert S.Reiter ,John G.K.W illiams ,et al.G lobal and local genome mapping in Arabidopsis thaliana by using recombinant inbred lines and

random am plified polym orphic DNAs.,Proc Natl Acad Sci.US A ,1992,()2:1477～1481

[6]　任瑞文,卢强,等.提高RAPD 稳定性的几点经验与探讨.生物技术.2001,(11)2:38～40

[7]　Andrade A C ,Z wiers L H ,et al.ABC T ransporters and their im pact on pathogenesis and drug sensitivity.In :Pesticide Chemistry and Bio 2Science

R oyal S ociety of Chemistry ,Cambridge.U.K.1999,221～235.353Acta Agriculturae Nucleatae Sinica

2003,17(5):350～353