SDS-PAGE电泳

实验材料

所用试剂均需分析纯。

1.1 超纯水

电阻率应不低于13

1.2  A液（0.3 %十二烷基磺酸钠，SDS; 3.0Mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸 Tris-Hcl,PH8.45）

称取18.15gTris加适量超纯水溶解，用盐酸调PH值至8.8，加超纯水定容至100ml。

1.3  B液（30%丙烯酰胺/N，N’-甲叉丙烯酰胺）

称取29g丙烯酰胺1.0gN，N’-甲叉丙烯酰胺，加超纯水溶解至100ml，待其完全溶解后用滤纸过滤。避光保存。

1.4  C液（10%十二烷基磺酸钠，SDS）

称取1g十二烷基磺酸钠，加超纯水溶解至10ml ，室温保存。

1.5  D液（四甲基已二胺）

1.6  E液（10%过硫酸铵）

称取100mg过硫酸铵，加超纯水溶解至1ml。

1.7  F液（1.0Mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸Tris-Hcl,PH6.8）

称取12.1gTris加适量超纯水溶解，用盐酸调PH值至6.8，加超纯水定容至100ml。

1.8  电极缓冲

称取3.02gTris，18.8gGlycine,1.0gSDS加适量的超纯水溶解，用盐酸调PH值至8.3，加超纯水定容至1000ml。

1.9  样品缓冲液（2 X SDS）

称取0.12g Tris(PH6.8),0.4g SDS,0.01g溴酚蓝，1ml 甘油，加超纯水溶解定容至10ml（用于非还原SDS-PAGE。如用于还原SDS-PAGE，则再加0.5Mβ-巯基乙醇）

1.10  蛋白质标准，待检样品的分子量应包括在使用的分子量标准范围之内。

1.11  固定液

量取250ml甲醇，60ml冰乙酸，60ul甲醛，加超纯水至500ml。

1.12  漂洗液

量取500ml乙醇，加超纯水定容至1000ml。

1.13  辅助液

加1ml 2%的Na2S2O3 于99ml超纯水。

1.14  银染液

称取0.2g银，25ul甲醛，加超纯水溶解至100ml。

1.15  显色液

称取15g碳酸钠，50ul甲醛，20ul Na2S2O3 ，加超纯水定容至100ml。

1.16  终止液

量去10ml冰乙酸加超纯水至100ml。

1.17  考马氏亮蓝染色液

称取0.5g考马氏亮蓝R-250，90ml甲醇。20ml冰乙酸，加蒸馏水溶解至200ml。

1.18  考马氏亮蓝脱色液

量取40ml甲醇，100ml冰乙酸，加蒸馏水至1000ml。

2.  实验步骤

2.1  制备分离胶

将配好的分离胶（配方见下表）灌入电泳槽中，加水（或异丙醇）覆盖，室温下聚合（室温不同聚合时间不同）

凝胶配方

待分离胶聚合后，用超纯水洗胶表面，用滤纸吸取去上面的水，再灌入浓缩胶（配方见上表），查入样品梳，注意避免气泡出现。

2.3  样品处理

将待检样品与样品缓冲1：1的比例混匀，100℃水浴3—5分钟。

2.4  加样

待浓缩胶聚合后拨出样品梳，将电极缓冲液注满电泳槽上下槽，在加样孔中加入2.3项待检样品5ug（银染）或10ug以上（考马氏亮蓝染色）。

2.5  电泳

接通电源、冷凝水，以恒流25mA开始电泳。

2.6  染色

2.6.1 银染法

2.6.1.1  固定

将电泳后的凝胶取下，浸入固定液中，1小时。

2.6.1.2  漂洗

将凝胶从固定液中取出，用漂洗液漂洗3次，每次10分钟。

2.6.1.3  辅染

将漂洗后的凝胶浸入辅染液中1分钟。

2.6.1.4  清洗

将凝胶自辅助液中取出，用超纯水清洗3遍每次5分钟。

2.6.1.5  银染

将清洗后的凝胶浸入银染液中，室温20分钟。

2.6.1.6  清洗

将凝胶自银染液取出，用超纯水清洗3遍每次5分钟。

2.6.1.7  显色

将漂洗后的凝胶浸入显色液中，至到蛋白条带显色完全。

2.6.1.8  终止

将凝胶浸入终止液中10分钟后，保存于纯水中。

2.6.2  考马氏亮蓝法

2.6.2.1  染色

将电泳后的凝胶取下，浸入染色液中。室温30分钟。

2.6.2.2  脱色

将凝胶自染色液中取出，浸入脱色液中，直到凝胶低色近于无色为止，凝胶保存在纯水中。

3、结果计算

非还原电泳凝胶经扫描进行纯度分析；还原电泳凝胶蛋白质标准经扫描作分子量标准曲线，计算待检样品的分子量。

附：

1.检测表达量的菌体样品标准处理方法：

取一定量菌液，将其OD值校正为1.0，取1ml该样品离心，收集沉淀。电泳前加入60μl 8M尿素，反复吹打，使沉淀完全悬浮，再加入20μl 4×还原上样缓冲，100℃水浴15分钟，每孔上样5μl，进行电泳。

2.送样人员要求：

    送样人员将其样品给予电泳实验人员时，应标明各个样品的处理办法，如进行还原电泳还是非还原电泳、上样量等等。电泳实验完成后，不能将凝胶随意拿出电泳室，如有特殊情况，需向电泳人员说明。

2.实验记录：

    每完成一组电泳，将各个样品名称按照加样顺序详细记录到实验记录本上，并注明实验日期。待凝胶脱去底色后，用扫描仪扫描，保存。陈勇定期进行备份。