测定食品中蛋白质含量

          食品学院第7组     S100111029    王婷   

1、实验目的：

   1.熟悉并使用分光光度计。

   2.学习并理解Lowry-Folin法测定食品中蛋白质含量的方法。

二、实验原理：

 在碱性溶液中，蛋白质中的肽键与铜盐可产生双缩脲反应，产生络合物，此络合物会将磷钼酸-磷钨酸（Folin）试剂还原，产生深蓝色络合物。在一定条件下，蓝色深浅与蛋白质的量成正比。在波长540nm处测定样品的吸光度，与标准曲线对比，可确定蛋白质的含量。这种方法是检测可溶性蛋白质含量最灵敏的金典方法之一。

三、实验试剂：

   1.试剂A：称取Na2CO3100g溶于1000ml（最终体积）0.5mol/LNaoH中。

   2.试剂B：称取CuSO4·5H2O1.0g溶于100 ml（最终体积）蒸馏水中。

   3.试剂C：称取酒石酸钾钠2.0g溶于100 ml（最终体积）蒸馏水中。

   4.牛血清蛋白（BSA）标准溶液：准确称取牛血清蛋白，配成浓度为200ug/ml的溶液。

   5.2mol/L Folin-酚试剂：

于2L的磨口烧瓶中加入100g钨酸钠（Na2WO4·2H2O）、25g钼酸钠（Na2MO4·2H2O）、700ml蒸馏水，在加入85℅磷酸溶液50ml以及浓盐酸100ml，充分混合，接上冷凝管，回流10h。回流完毕，加入150g硫酸锂、50ml蒸馏水和浓溴水（90℅）数滴，开口继续煮沸15 min，以除去多余的溴（冷却后如仍然有绿色需再加溴水，在煮沸）。冷却后加水定容至100ml。混匀，过滤，制的的试剂应呈金黄色，置于棕色瓶中保存。

使用时一酚酞作为指示剂，用标准溶液滴定，用蒸馏水稀释（本处为10倍），使其达到所需浓度。

四、实验步骤：

   1.标准曲线的绘制：

  （1）取10ml具塞试管6支，编号，分别准确吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml血清蛋白溶液置于相应的试管中。在各支试管中分别加入1.00、0.80、0.60、0.40、0.20、0.00ml的蒸馏水，使其总体积达到1ml。

不同浓度BSA溶液的配制

（3）分别在各试管中准确加入Folin-酚试剂稀释液3.00ml，立即震荡，充分摇匀。

（4）静置45min，在540nm波长下测定每个试管中也的吸光度（A值）。

（5）以A值为纵坐标，BSA质量（0～200ug）为横坐标，绘制标准曲线，求出回归方程和相关系数R2。

2.样品的测定

 将啤酒样品适当稀释，吸取2份，各1.00ml，重复步骤（2）～（4）。

五、实验记录和数据处理

当Y=0.318时，x=113.57

样品中蛋白质的含量（mg/ml）=XA×N×0.001=113.57×20×0.001=2.27

六、说明

1加入Folin-酚试剂后立即将反应摇匀，以便Folin-酚试剂在碱溶液中破坏之前即能被铜-蛋白质复合物还原。

2.短时间内反应液的颜色保持稳定，因此，静置45 min后反应立即测定吸光度，若拖延时间过长，颜色将会变化，影响结果。

七、思考题

1测定食品中蛋白质含量的常用方法有哪些，其原理、适用性如何。

答：（1）凯式定氮法

原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨, 氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。

适用性：凯氏定氮法适用范围广泛，测定结果准确，重现性好，但操作复杂费时,试剂消耗量大。凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。

（2）Lowry-Folin法

原理：在碱性溶液中，蛋白质中的肽键与铜盐课产生双缩脲反应，产生络合物，此络合物会将磷钼酸-磷钨酸（Folin）试剂还原，产生深蓝色络合物。在一定条件下，蓝色深浅与蛋白质的量成正比。在波长540nm处测定样品的吸光度，与标准曲线对比，可确定蛋白质的含量。

适用性：这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。

（3）紫外吸收法

原理：蛋白质分子中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。

适用性：紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，测定后仍能回收使用。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。

（4）考马斯亮蓝法（Bradford）

原理：Bradford法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝是一种有机染料，在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色，其最大吸收波长从465nm变为59nm，蛋白质在1～1000μg范围内，蛋白质－色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质的定量测定。

适用性：考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合反应十分迅速而稳定，2min左右即达到平衡,其结合物室温下1 h内保持稳定，且在5～20min之间,颜色的稳定性最好。该方法适用于要求灵敏度高、快速定量测定微量蛋白质的测定。

（5）双缩脲法(Biuret )

原理：在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以1个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。

适用性：双缩脲法中样品的取用量对测定结果的准确性有显著影响，采用0.5g样品，40mL双缩脲试剂的比例具有较高的检测精度。双缩脲法对不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,不受温度的影响。可快速测定蛋白质含量，试剂单一，方法简便，但灵敏度差，测定范围为1～20mg蛋白质。适用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定，常用于谷物蛋白质含量测定。

2使用分光光度计时应注意什么？

答：（1）分光光度计使用前要进行预热。（2）比色皿使用完毕后，应立即用蒸馏水冲洗干净，并用干净柔软的纱布将水迹擦去，以防止表面光洁度被破坏，影响比色皿的透光率。（3）若大幅度改变测试波长，需稍等片刻，等灯热平衡后，重新校正“0”和“100%”点。然后再测量。