血管紧张素转化酶活性抑制剂_丝素肽的分离_纯化和结构鉴定

作者简介:倪 莉(1972 ),女,博士,电话:(0591)73047,传真:(0591)3732462,E mai l:nili2000@sina.com 。

血管紧张素转化酶活性抑制剂

丝素肽的分离、纯化和结构鉴定

倪 莉1

, 陶冠军2

, 戴 军2

, 王 璋2

, 许时婴

2

(1.福州大学生物工程研究所,福建福州350002; 2.无锡轻工大学食品学院,江苏无锡214036)

摘要:可溶性丝素粉末经碱性蛋白酶A lcalase 水解后,其酶解产物对血管紧张素转化酶(ACE)的活性有很强的抑制作用。采用凝胶过滤色谱Sephadex G 15和反相高效液相色谱(RP HPL C)对水解度为20%的酶解产物进行分离纯化,利用质谱鉴定其中一种A CE 抑制剂是肽,其结构为Gly T yr 。

关键词:反相高效液相色谱法;质谱;丝素肽;血管紧张素转化酶;活性;抑制剂中图分类号:O658 文献标识码:A 文章编号:1000 8713(2001)03 0222 04

1 前言

血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂可作为降血压的药物,目前已有许多种ACE 抑制剂类合成药物。然而因这类降压药物属酶的竞争性抑制剂,它们对酶活性部位的抑制是可逆的,药物作用时间不长,停药后会使血压反弹;而且,这类药物被吸收和排泄的速度较快,经肾脏排出易损害肾功能,有一定的副作用,因此,亟待寻找安全、长效、无毒副作用的新型降压药。最近,从明胶、酪蛋白、玉米和大豆等食品中成功地分离出具ACE 活性抑制作用的降压肽[1~4]

,

它们具有无副作用、安全性高等优点,备受人们的关

注。

本研究以可溶性丝素粉末为原料[5],直接采用碱性蛋白酶Alcalase 进行水解,制备ACE 活性抑制剂

丝素肽。采用凝胶过滤色谱Sephadex G 15和反相高效液相色谱(RP HPLC)对丝素酶解产物进行分离纯化,并用质谱仪对其功能因子进行结构鉴定,从而为新型降血压药物的研制提供了新途径。

2 实验材料和方法

2.1 材料

可溶性丝素粉末[5](自制),Alcalase(2.4L)(丹麦Novo 公司),ACE 和马尿酰组氨酰亮氨酸(hip purl L His L Leu)(美国Sigma 公司),甲醇和乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯。2.2 实验方法及条件

2.2.1 ACE 抑制活性的测定 采用改进的Cush man 方法,用HPLC 定量测定马尿酸[6]。

2.2.2 Sephadex G 15分离纯化丝素肽 凝胶柱:1.6cm i.d. 100cm;洗脱液:0.01mol/L 的H Cl

溶液;洗脱液流速:20mL/h;检测仪:8802型紫外检测仪(温州孚华分析仪器厂);记录仪:XWD1 100记录仪(上海自动化仪表三厂);检测波长:220nm 。2.2.3 RP H PLC 分离纯化丝素肽 HPLC 系统:Waters T M 650E Advanced Protein Purification System (美国Waters 公司);色谱柱: Bondapak

TM

C 18P/N

84176(7.8mm i.d. 300mm )(美国Waters 公司);检测器:Dual Absorbance Detector,210nm 和280nm;进样量:200 L ~400 L;洗脱液流速:3mL/min;洗脱条件:0min~10min 100%A,10m in ~20min 0%B~50%B,20min~30min 50%B,30min~35min 50%B~0%B,35min~38min 100%A(A 液 水;B 液 体积分数为30%的乙腈水溶液)。2.2.4 氨基酸组成分析 采用835 50氨基酸自动分析仪(日本Hitachi 公司)分析氨基酸的组成。2.2.5 质谱鉴定 质谱仪:Platform LCZ 4000(美国Waters 公司);毛细管处电压:3.50kV;离子化温度:120!;脱溶剂温度:200!;检测的相对分子质量范围:100~900。

3 结果与讨论

3.1 采用Sephadex G 15分离纯化丝素肽 丝素经碱性蛋白酶Alcalase 水解后,水解度为20%的酶解产物(简称样品A20)对ACE 具有最强的抑制作用[6]。比较多种洗脱液对样品A20的分离效果[7],结果表明采用0.01mol/L 的HCl 洗脱液的分离效果最佳(见图1),洗脱出来的各组分用碱进行中和后即可测定其对ACE 活性的抑制作用。3.2 A20经Sephadex G 15分离后各组分对AC E 的抑制作用

测定A20经Sephadex G 15分离后各组分(如

第19卷第3期2001年5月

色谱

CHINESE JOURNAL OF CHROMAT OGRAPHY

Vol.19No.3M ay 2001

图1所示)对ACE 的活性抑制率,结果发现,图1中分离的各组分除组分1的活性抑制率较低外,其余组分对ACE 均具有较强的抑制作用,其中组分5的抑制作用最强。组分1~5的抑制率依次为:

15 0%,28 4%,25 3%,38 6%,58 0%

。

图1 样品A20的凝胶过滤图谱

Fig.1 Sephadex G 15gel chromatogram of sample A20Conditi ons:gel column, 1.6cm i.d. 100cm;eluent,0.01mol/L HCl;eluti on rate,20mL/h;wavelength,220nm.Tw o fractions of each peak w ere mixed together as on e com ponent:frac tions 14and 15as com ponent 1,fractions 25and 26as component 2,fractions 30and 31as component 3,fracti ons 35and 36as com ponent 4,and fractions 42and 43as component 5.

3.3 氨基酸组成分析

由进一步的分析结果可知,组分5中氨基酸的组成为甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(M et)和

酪氨酸(Tyr )。若以Gly 的量为基准,则Gly,Val,Met 和Tyr 的量比依次为1 0,0 02,0 005和1 2。由此可以判断,组分5主要含甘氨酸和酪氨酸,且其量比接近为1 1。

3.4 采用反相高效液相色谱分离纯化组分5 采用反相高效液相色谱进一步分离纯化组分5(见图2和图3)。对ACE 抑制剂丝素肽的结构与功能关系的研究结果表明:C 末端的Pro,Phe,T yr 或序列中含有的疏水氨基酸是维持高活性所必需的,对二肽而言N 末端的芳香族氨基酸与ACE 的结合是最有效的[8]

,因此采用210nm 和280nm 波长同时进行检测。由图2 a 和图2 b 可以看出,经凝胶过滤色谱洗脱出的单一峰仍是由多组分组成的,P2是组分5的主要成分,也是芳香族氨基酸含量最高的组分。对图2 b 中的洗脱峰P1,P2,P3进行

ACE 活性抑制率的检测,结果P2的抑制率最强(见表1)。P2组分经RP HPLC 再次分离后已是较纯的组分(见图3)。

表1 图1中的组分5经RP HPL C 分离后

各组分对ACE 的抑制作用

Table 1 ACE inhibitory activity of each fraction of component 5in Fig.1eluted from RP HPLC Fraction Rate of inhibition(%)

P114 P266.2P3

29.

6

图2 图1中的组分5经RP HPLC 分离的洗脱图谱

Fig.2 Reversed phase high performance liquid chromatograms of component 5in Fig.1

Column: Bondapak TM C 18P/N 84176(7.8mm i.d. 300mm );wavelengths:a.210nm, b.280nm;amount of sample:200 L 400 L;elution rate:3mL/min;elution condition:0min 10min 100%A,10m i n 20min 0%B 50%B,20min 30min 50%B,30min 35mi n 50%B 0%B,35m i n 38mi n 100%A(A:w ater,B:30%acetonitrile aqueous solution).

3.5 质谱

从负离子质谱(图4)中可以看出,P2中主要存在两个负离子峰,即(M -H )-237.4和(M -H )-475.3;在正离子质谱(图5)上相应出现两个分子离子峰,即(M +H)+239.3和(M +H)+477 4。高灵

敏度的质谱能检测出溶剂中微量的钠或钾离子的存在,所以正离子质谱中也出现了(M +Na)+

261.3,499.4和(M +K)+277.3,515.5。其他峰则为肽的碎片离子峰,根据分子离子峰和碎片离子峰,即可判断出肽的组成。

∀

223∀ 第3期倪 莉等:血管紧张素转化酶活性抑制剂丝素肽的分离、纯化和结构鉴定

图3 图2中的P2经RP HPLC 分离的洗脱图谱

Fig.3 Revers ed phase high performance liquid chromatograms of Peak 2in Fig.2

HPLC conditions are the same as i n Fig.

2.

图4 负离子质谱

Fig.4 Negative ion mass

spectrum

图5 正离子质谱

Fig.5 Positive ion mass spectrum

本实验采用的质谱仪,其配套的高级分析软件Biolynx 可以根据肽的分子离子的质量数,推测出它的氨基酸组成和序列,并找出肽在质谱中出现的碎

片离子,以及这一序列的匹配度。分子离子239.3的分析结果如下

:

A 30.0-

B 58.0-

C #75.0-i 30.0136.1Gly T yr X -208.1

Y #-182.1Z

-165.1

∀224∀色谱第19卷

其中,A,B,C,X,Y,Z 为二肽Gly Ty r 可能出现的碎片离子,i 为甘氨酸和酪氨酸的亚胺离子,有下划线的数值为在质谱中出现的碎片离子的质荷比。在质谱中出现了Gly Tyr 的两种碎片离子峰以及酪氨酸

的亚胺离子,这一序列的匹配结果为:匹配度100,相对分子质量为238 2,氨基酸个数为2,氨基酸序列为Gly Tyr 。

若以Gly 为C 端,T yr 为N 端,即序列为T yr Gly 时,除亚胺离子136.1外,未见对应的其他碎片离子峰,因而可以判断分子离子239.3的肽为二肽,氨基酸序列为Gly Tyr 。

对于分子离子477.4的肽,计算机分析软件推测为四肽:Leu Cys Asn Gln,然而在质谱中未出现相应的亚胺离子峰,碎片离子峰261.1正好与Gly T yr 的(M +Na)+相同,碎片离子峰147.1的丰度极小。由P2的氨基酸组成分析结果可知,P2中不含这几种氨基酸,因此,这一离子峰不可能为四肽Leu Cys Asn Gln 。

电喷雾离子源除可能与溶剂生成加合物外,如Na +(M +23)和K +(M +39),还可能生成多聚体,因此推测分子离子(M +H )+477.4是二肽(Gly T yr)的二倍体。

4 小结

丝素的酶解产物具有对ACE 的抑制活性,其中碱性蛋白酶Alcalase 水解丝素至水解度为20%时的

酶解产物的抑制活性最强[6]

。本研究采用凝胶过滤色谱Sephadex G 15和反相高效液相色谱对其进行分离纯化,最终确定其中一种具ACE 抑制活性的丝素肽的相对分子质量是238.3,氨基酸序列为Gly Tyr 。

参考文献:

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niversit y of Lig ht I ndustry ,2000,19(2):146 149倪 莉,王 璋,许时婴.无锡轻工大学学报,2000,19(2):146 149

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Chem,1980,255(2):401 407

Separation,Purification and Identification of Angiotensin

Converting Enzyme Inhibitory Silk Fibroin Peptide

NI Li 1,TAO Guan jun 2,DA I Jun 2,WANG Zhang 2,XU Shi ying 2

(1.Institute of Biotechnology ,Fuz hou Univ er sity ,Fuzhou 350002,China;2.Food School ,Wux i University o f L ight I ndustry ,W ux i 214036,China)

Abstract :Silk fibroin peptides could be obtained from soluble silk fibroin by enzymatic hydrolysis.Its hydrolyzates produced w ith Alcalase show ed sig nificant inhibitory activity against the angiotensin I converting enzy me (ACE).One inhibitory peptide from the hydrolyzate at a degree of hydrolysis of 20%(sample A20)w as purified and identified.Sample A20w as first isolated by size exclusion chromatography(SEC),eluted w ith 0 01mol/L hydrochloric acid solution on a Sephadex G 15column (1.6cm i.d. 100cm).The peak of No.5on the SEC chromatog raphy w as further purified by reversed phase HPLC ( Bondapak T M

C 18P/N 84176column,7.8mm i.d. 300mm ),eluted w ith a linear gradient elution w ith acetonitrile from 0%to 15%at temperature (30%2)!.Then the pure peptide w ith ACE inhibitory activity w as obtained,the am ino acid sequence of which was identified as Gly Tyr by mass spectrometry.

Key words :reversed phase hig h performance liquid chrom atog raphy;mass spectrometry;silk fibroin peptide;

angiotensin converting enzy me;activity;inhibitor

∀

225∀ 第3期倪 莉等:血管紧张素转化酶活性抑制剂丝素肽的分离、纯化和结构鉴定