在黑色素瘤中异常表达的MHC II类受体

Aberrant Expression of MHC Class II in Melanoma Attracts Inflammatory Tumor-Specific CD4+ T-Cells, Which Dampen CD8+ T-cell Antitumor Reactivity

摘要

在不存在局部炎症反应情况下，MHC类型Ⅱ分子表达主要在造血细胞和胸腺上皮细胞。然而，某些肿瘤，如黑色素瘤，可能获得MHC II类的异常组成性表达。在一组初级黑素瘤细胞群体的和相应地扩大了自体肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中，我们将展示在具有高度MHC II类分子特异性及肿瘤有特异性T细胞应答的黑色素瘤细胞中， MHC II是如何表达的。值得注意的是，我们发现，肿瘤特异性CD4+ T细胞应答是由TNF产生支配。在IFNγ丰富的环境中，TNF降低CD8+ T细胞激活类似肿瘤部位的能力。相反，直接的CD4+ T细胞反应对无论是黑色素瘤细胞的增殖或活力无影响。总之，我们的结果表明了一种被MHC II类分子的异常表达激活的新免疫逃离机制的存在，这种机制靠吸引肿瘤特异性CD4 + T细胞引发肿瘤坏死因子主导的局部炎症反应转而去抑制CD8 +T细胞的反应。Cancer Res; 75(18); 3747–59. 2015 AACR.

引言

    在没有局部的炎症反应的情况下，MHC II型表达主要限于造血细胞和胸腺上皮。然而，某些类型的实体瘤，包括黑色素瘤亚单位，能从头组成表达MHC II类分子。另外，通过暴露于细胞因子例如IFNγ的方法，MHC II类可在几种细胞类型(包括肿瘤细胞)中被诱导表达。

    在黑色素瘤的MHC II类表达先前已发现与较短和较长的存活都相关联。的确，MHC II类表达可以使这些肿瘤被的肿瘤抗原特异性CD4 + T细胞直接检测。我们和其他人曾证明这种CD4+ T细胞能够产生Th1应答响应于自体肿瘤抗原。与此相反，最近的研究提出，分别表达在肿瘤细胞和肿瘤浸润免疫细胞的MHC II类分子与由淋巴细胞激活基因3（LAG3）的接合，可能会触发促存活信号和肿瘤细胞的抗细胞凋亡。此外，LAG3已被表征为免疫抑制性受体，并且其在T细胞上的接合可以在启动阶段而不是在效应阶段介导肿瘤微环境中的免疫反应的下调。

为了阐明MHC II型表达与CD4+ T细胞应答和CD4+ T细胞的功能性模式在黑素瘤中的关联，我们进行了扩大的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的一种多功能分析直接识别了一组的38自体配对的晚期患者产生的黑色素瘤细胞系。我们的研究结果揭示了一个新机制，MHC II表达的黑色素瘤对炎性CD4+ T细胞存在吸引，并且通过IFNg-介导及TNF诱导免疫反应局部扩大来反作用CD8+ T细胞应答，起到抑制作用。

材料和方法

病人和样品

科学伦理委员会批准了在丹麦的首都地的所有的程序。根据赫尔辛基宣言在任何操作之前患者签署书面知情同意书。所有患者都被诊断为组织学确诊的晚期黑色素瘤，AJCCⅣ期（N¼32）或IIIB（N= 1，完全切除），IIIC（N¼5，其中两种是完全切除）。

从ESTDAB得到（http://www.ebi.ac.uk/ipd/estdab/）原发黑素瘤的WM-115，FM-55-P，FM-55-M1，和FM-55-M2的肿瘤细胞系。 WM-115，WM-75，WM-793，和WM-266-4已被描述过特征。

用于流式细胞术的抗体

用流式细胞仪抗体小组分别为：

- CD4 +和CD8 + T细胞应答的多方面特性：CD4 QDOT 705（Life Technologies公司），CD8 QDOT605（Life Technologies公司），近红外活/死可固定死细胞染色即（Life Technologies公司），MIP-1A FITC（eBioscience公司），MIP-1B PerCP-eFluor 710（eBioscience公司），CD107a Brilliant Violet 421，IFNG PE-Cy7，TNF-APC，IL2 Brilliant Violet 650（Biolegend公司），IL17A Brilliant Violet 510。

- 所有其他肿瘤的T细胞共培养实验：CD4 FITC，CD8PerCP，可固定活力染料eFluor 450（eBioscience公司），IFN PE Cy7，TNF-APC，CD107a PE。

- MHC I类特性：抗HLA-ABC的APC，7-AAD

- MHC II类特性：抗HLA-DP，DR，DQ FITC，7-AAD                                      

TIL和黑色素瘤细胞系的制备

本研究使用的TIL是按照在其他研究中广泛描述的实验过程得到的。简要地说，在无菌条件下将手术的切除黑色素瘤肿瘤切成1〜2立方毫米小碎块，将浸润淋巴细胞从这些肿瘤中分离开，并在高剂量的IL2（​​6000 IU / mL的IL-2; Proleukin诺华）保持最低限度地扩增。当获得最少50X106肿瘤浸润淋巴细胞时（该产物在通常手术切除之后约14-28天此阶段被命名为“微创培养的TIL”），扩增是由标准的14天快速扩增实验（REP）进一步实现的，在其中的TIL在用200倍过量的同种异体的来自至少三个不同健康供体照射处理过的外周血单核细胞（PBMC）和30纳克/毫升抗CD3抗体（OKT3，Janssen-Cilag or Miltenyi Biotec）非特异性地扩增。在本篇文章中，该TIL被命名为“扩大的TIL（expanded TILs）”或“REP-TIL。”从一些病人的肿瘤碎片提取“未培养（或鲜）肿瘤浸润淋巴细胞”。肿瘤碎片用添加了1毫克/毫升胶原酶IV型（Sigma-Aldrich公司）和0.0125毫克/毫升dornase阿尔法（Pulmozyme，罗氏）的消化液消化过夜并立即冷冻保存。

在REP之前，根据制造商的说明利用阳性磁力选择（positive magnetical selection）分别使用CD8或CD4的磁珠（美天旎）筛选TIL，得到纯CD8 +或CD4 + T细胞群。并得到设计实验中所要使用的分好类的T细胞。随后，分选亚群们分别进行扩增。只有CD8+或CD4 + T细胞的浓度达到95％以上的培养物被用于接下来的实验。

自体黑素瘤细胞系分别TIL从产生，无论是从肿瘤碎片或从运输培养基中悬浮回收细胞团或从组织碎片中，如先前文献所述（16，18）。

通过流式细胞仪分析T细胞应答

如先前文献所述（10，16），进行T细胞反应的测定。

简要地说，TIL解冻，并在RPMI-10（Life Technologies公司）静置3天（用于REP的TIL的多官能表征），2天（最低限度培养的TIL），或过夜（在所有其它情况下）中补充有10％AB人血清（SigmaAldrich），之后洗涤两次，与自体短期培养的黑素瘤细胞系共培养。肿瘤反应性通过评估先前门控为CD4或CD8 T细胞表达的细胞因子（IFNG和TNF）或CD107a 的表达量来评估。

为了筛选CD8 +和CD4 + T对自体肿瘤抗原的细胞反应，对数期生长的自体肿瘤在100IU /毫升IFNG（Imukin，勃林格殷格翰）孵育72小时，然后充分洗涤，并添加到共培养物中。这样做是为了能最大限度地检测到低频的与MHC表达下调的自体肿瘤与或没有组成型MHC II类表达抗肿瘤反应。反应被定义为在相对CD8 +或CD4 + T细胞亚群中，最少有0.5％的应答细胞的存在（表达出下列T细胞功能中的至少一种：TNF，IFNG，或CD107a），最少50的阳性事件发生和与背景（即，未刺激的样品）相比至少三倍的T细胞的功能阳性细胞的频率。肿瘤反应性细胞在刺激的样品中的频​​率中减去由未刺激样品的。 0.5％作为判定显著性的底限。

对于MHC II类阻断实验，肿瘤细胞37℃在20毫克/毫升抗HLA DR，DP，DQ抗体（克隆TU39，从Biolegend公司）温育30分钟，或在相关同种型对照中温浴。然后，肿瘤细胞加入和没有附加洗涤的TIL（最终浓度在T细胞刺中激鸡尾酒约为0.5毫克/毫升）到共培养物中。进行聚合四聚体（肽-MHC多聚体的PE缀合并在内部产生HLA-A2性MART-1 / Melan-A衍生肽ELAGIGILTV）和细胞内细胞因子染色（CD107a聚乙烯是在此情况下与CD107a FITC替换）染色，评估MART-1特异性T细胞产生功能的反应的频率，如先前文献所述（10）。

在多官能表征实验（7个T细胞功能表征），在共培养基中与自体肿瘤细胞的孵育时间被延长至12个小时，以便能够检测早期和晚期的细胞因子产生。

那里要指出的是用1000UI/毫升的TNF（CellGenix）或100IU / mL的IFNG或两者都处理72小时的癌症细胞。由于由CD8 + T细胞的多个T细胞功能的同时阳性评估的高灵敏度，要同时表达TNF，IFNG，和CD107a中的至少两个功能（双阳性细胞）被选为总CD8肿瘤反应性的量度，以评价肿瘤坏死因子（TNF）对CD8 + T细胞识别的影响。

T细胞反应的多官能表征细胞使用BD FACSCanto II流式细胞仪或用5 laser BD LSR II。流式细胞仪配备了FACS Diva的软件6.3（BD）。

ELISPOT和细胞毒性试验

如先前文献所述（16）进行IFNγ ELISPOT实验。共有3×104的TIL（分别是3×104 CD8 + T细胞，3×104 CD4 + T细胞，或1.5×104 CD8 +加1.5×104 CD4 + T细胞，使得肿瘤浸润淋巴细胞的总量是在每一个孔相同）和3×103癌细胞加入各孔。一式三份孔进行了分析。结果为在受刺激的孔中IFNγ斑点减去背景。

对CTL介导的细胞毒作用的常规的51 Cr释放测定法进行如别处（19）中所述。

癌细胞的分析

MHC表达分析。半定量测定癌细胞的MHC I类或II类表达，进行标准染色鉴定，新鲜分离的肿瘤细胞与抗HLA-ABC或HLA-DP，DR，DQ抗体或同种型对照，洗涤，在采样前5分钟加入2mL的7-AAD到每个样品中。用BD FACSCanto II流式细胞仪收集细胞，并考虑到不同的自体荧光的个体细胞系的电压参数，对每个细胞系进行了调整以获得275±15的APC平均荧光强度（MFI）和65±5的FITC MFI。

鉴于几个肿瘤细胞株中的非均匀MHC II类染色，当所研究的抗体样品染色的MFI超过同种型对照至少四倍染色，黑素瘤被确定为MHC II型阳性。

细胞增殖分析 如先前所述（10）使用流式细胞术为基础的计数法对细胞增殖进行了评价。简要地说，在标准胰蛋白酶消化后，实验开始前一天（-1day），将黑色素瘤细胞接种在5至8×104 /孔的24孔板中，生长24小时后，加入标准培养基。然后，培养基换成新鲜标准介质±从对应的患者取得的活化的CD4 + T细胞上清液的稀释液，从而使得0.5 mL的终浓度/孔。基线对照孔在0天用50毫升每孔胰蛋白酶溶液进行胰蛋白酶处理，同时使用含0.05毫克/毫升碘化丙啶（PI; Sigma-Aldrich）250毫升标准培养基加入到每个孔中，以排除死细胞。所得悬浮液在BD的FACSCanto II流式细胞仪配备有BD FACS装载机转盘，标准的速率下计数一定时间（90秒，高流动速率）。在药物中暴露72小时后，将其他孔用胰蛋白酶处理和之后的基线对照孔在相同的工作条件的细胞进行计数。用下列公式计算生长抑制：（T72- T0）/（K72 -T0）×100，其中T72是72小时后的细胞数，T 0是在零时间对照的细胞数，K72是对照孔（培养基）72小时后的细胞数。对照值被任意设定为100。低于0表示元细胞丢失而0到100之间的值表示生长抑制。

要从激活CD4 + T细胞得到上清液： 在24孔板中，5×106分类后的从个体患者处得到的CD4 + T细胞和用5×105自体IFNγ处理（72小时）的肿瘤细胞孵育，每孔总体积1毫升。 24小时后，收集上清液，用两个离心步骤（1,500rpm / 5分钟）将细胞洗出，随后将上清液冷冻保存在-80℃，供以后使用。

RT-PCR技术。使用根据制造商的TRIzol试剂（Invitrogen）使用说明从样品中提取总RNA。逆转录反使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche）。实时PCR（qPCR;对于IDO-1，PDL-1，MLANA，TYR，PMEL，TAPBP，PSMB9，和GAPDH）分析利用了内部设计的引物和LightCycler Nano instrument（Roche）。

数据统计分析

执行了达戈斯蒂诺皮尔森正态性检验检查值的正态分布，还有F测试，以检查方差齐性。视上面的测试结果再作出是否在相关的数据集执行参数或非参数试验的决定。结果不同群体之间的比较采用双侧测试（或者配对t检验，非配对t检验，Mann-Whitney检验，或魏氏配对测试）。对生存分析进行对数秩检验。定性数据与Fisher精确检验进行了比较。

用对数变换的数据来比较组间的差异，用来分析相对定量的能力来表达单个T细胞的功能。对于qPCR的数据，靶基因的Ct被减去GAPDH Ct获得△Ct。采用配对符号秩和检验来比较IFNγ处理的细胞和培养基，TNF-γ，和TNF+IFNγ-处理细胞之间的差异。数据显示为相对于IFNγ处理细胞(任意设置值为1)。

在多官能表征实验（7 T细胞功能表征），流式细胞术数据用FlowJo 9（TreeStar Inc.）进行初加工。使用顺序选通策略直到识别了使用并行布尔门（门仅围绕应答细胞绘制）分类的CD4 +和CD8 + T细胞细胞。根据pestle说明，数据导出到pestle 1.7并正确格式化。使用SPICE 5.2版本（从http://exon.niaid.nih.gov（20）下载）进行分析和介绍结果。在REP TIL和最低限度的TIL培养的分析中，根据制造商的说明，用Pestle1.7进行未刺激样品减去背景。与此相反，在未培养的TIL的分析中，背景样品不能被减去，因为肿瘤消化不可避免也含有未培养的肿瘤细胞，这些细胞可以在12小时的培养中刺激TIL（数据未显示）。至少1％应答细胞在CD4 +或CD8 + T细胞亚群的阈被接受，这样背景T细胞功能的表达噪声的影响不会超过约30％至40％（从young TIL或REP TIL样本背景染色中估计）。虽然有这些阈值，背景事件对总响应的贡献也许会相对高（尤其是对于CD107a+细胞，观察了未刺激的样品中在最低限度培养的TIL和REP TIL阳性细胞的比例）。分析可能仅在这些情况下进行，因为在未培养的TIL中肿瘤反应性细胞的频率普遍较低（在5个病例样本中分析，11，15，19，24，和25，CD4 + T细胞的阳性细胞的平均频率是2.2％ ±1.6％，CD8 + T细胞的阳性细胞的平均频率是5.3％±5.1％）。

在SPICE，REP TIL的分析阈值设定在0.1，而在所有其他的分析中，阈值设定为0.02。如先前所描述（20），使用Student t检验和的局部置换检验进行分布的比较。其他统计分析均采用的GraphPad Prism 5（GraphPad软件）。

结果

筛选与自体肿瘤抗原的细胞反应的CD8 +和CD4 + T细胞

尽管事实上，体内肿瘤的异质性可能不能完全通过短期培养的自体黑素瘤细胞系体现，但如果能认为T细胞应答直接作用于大多，可能不是全部，可能病人的对应肿瘤抗原，TILs/自体肿瘤细胞系的共培养能表现出一个金标准。为了获得最大的T细胞反应，自体肿瘤用低剂量IFNγ预处理，我们以前已经展示过这会增加TIL识别和反应性。此后，肿瘤被暴露在自体肿瘤浸润淋巴细胞（10）。

分别在34（％）和18（53％）患者（图1A; P = 0.001）中筛选38种体外扩大TILs /自体肿瘤，且该肿瘤与特定可检测的直接的CD8 +和CD4 + T细胞反应成堆出现。细胞反应的强度作为测量表达肿瘤坏死因子，IFNG，或CD107a的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）频率的标准。细胞反应的强度，CD8 +T细胞中 18％±18％（平均值，中位数为10％），CD4 + T细胞中4.0％± 9％（平均值，中位数为0.66％）（图1B，P <0.0001）。因此，CD8 + T细胞应答二者比CD4 + T细胞应答更频繁而且强烈地出现。

在6个被分析的样品中，有6个样品肿瘤细胞上MHC II类的的封锁显著降低CD4 + T细胞反应（样品取自6个高CD4 + T细胞应答患者），证实II类依赖识别（图1C和D）。

高CD4 + T细胞应答的存在（14例，确定在整个CD4 + T细胞亚群具有至少2％的细胞响应自体肿瘤）不与TIL中的CD4 + T细胞的较高频率有关（图1E）。这可能表明，在体内CD4 + T细胞浸润的量值，这很可能反映在扩增TIL细胞中的CD4 / CD8 T细胞比率，并不与CD4 + T细胞应答存在有关，而是与大多数代表非肿瘤相关的免疫细胞的CD4+ TIL有关。值得注意的是，我们以前已经表明，非肿瘤相关病毒特异性CD8 + T细胞在肿瘤微环境（21）的高频存在。

另外，高CD4 + T细胞反应的患者的CD8 + T细胞应答的特性与无或低CD4 + T细胞应答的患者（图1F和补充图S1）并没有显著不同。

高CD4 + T细胞反应（利用流式细胞仪）的患者的在扩增的TIL上FoxP3的表达的分析显示，在解冻后立即染色TIL CD4 +和CD8 +都相对较高的组分，呈阳性。不过，在IL2缺失的培养基7天后FoxP3的表达完全丧失（数据未显示）。因此，我们将此FoxP3的临时表达解释为体外培养条件所引起的高T细胞活化的作用，而不是与经典的调节性T细胞的功能相关联。

图1：对黑色素瘤CD4+ T细胞反应。A，具有对自体黑色素瘤细胞系CD4+或CD8+ TIL细胞应答患者的频率。B，对自体黑色素瘤细胞系有CD8+或CD4+ 肿瘤应答的TIL的频率。肿瘤细胞在与TIL共培养前用100 IU/mL IFNγ预处理，在材料和方法说明过。肿瘤应答细胞表达以下至少一个T细胞的功能：TNF，IFNγ，或CD107a。线条显示中值。C和D，MHC II类对肿瘤靶细胞阻断后CD4+T细胞产生的TNF。C，在六个类似的结果中一个代表性的样本，CD4+ T细胞门控。线在D中显示中位值。E，高或无/低CD4+ T细胞反应的患者的CD4+ T细胞的在所有TIL细胞中的频率。线显示平均值。F，在高或无/低CD4+ T细胞反应的患者中，肿瘤应答CD8+ T细胞的频率。线显示平均值。

MHC II类黑色素瘤细胞株中的表达

之前的研究表明，在43%黑色素瘤细胞株MHC II类分子组成型表达，而且绝大多数暴露在IFN-γ-a细胞因子的黑色素瘤（> 70%）表达II类，而在肿瘤微环境中的IFN-γ-a细胞因子可能是高水平，与CD8+ T细胞抗肿瘤反应密切相关（1）。

38例黑色素瘤中19例（50%）组成表达MHC II类分子（表1和图2A）。在IFNγ处理后，的MHC II型阳性和阴性肿瘤的MHC II类表达相对倍（数据未显示）和高或无/低CD4+ T细胞反应的MHC II类表达相对倍（补充图S2A）是相似。在19个组成II类阴性肿瘤只有3个IFNγ处理后在不表达MHC II类分子。

    为了弄清MHC II类的异常表达是否转移性黑素瘤的特异事件，两种来自原发黑素瘤（WM-115和FM-55-P）细胞系进行MHC表达特征检测。两种细胞系MHC I类表达都表现出与转移性起源细胞相比类似的模式（组成性表达，IFNγ处理后表达增强）。 WM-115 MHC II类组成性阳性，而FM-55-P为阴性，并且暴露于IFNγ之后两个染色后为阳性（WM-115具有增加的表达）（数据未显示）。对两个附加的细胞系，来自同一患者FM-55的单独的转移灶（FM-55-P代表原发黑素瘤），即FM-55-M1和FM-55-M2，进行了分析。都显示没有MHC II类组成型表达（但在IFNγ处理后有），正像他们的对应起源。

为了扩展分析和证实我们的结果，对ESTDAB数据库（http://www.ebi.ac.uk/ipd/estdab/）进行了检查。事实上，我们对WM-115和FM-55-P组成型表达的数据匹配ESTDAB的报告。此外，据报道在两个自于初级黑素瘤（WM-75和WM-793）其它细胞系中有两个组成型表达至少一种II类MHC同种型，正如WM-266-4一样，是一个起源于我们分析的一个患者的一个转移灶的细胞系，这个患者的转移灶在建立初级细胞系（WM-115）的18个月后诊断出。这些结果证实了以前布洛克尔和他的同事（22）的原位数据，并表明活化MHC II类的组成型表达可能在黑素瘤是非常早期的事件。

CD4 + T细胞应答和MHC II类的组成型表达的关联

为了表征MHC II类的组成型肿瘤表达是否与在TIL中CD4 +肿瘤特异性T细胞增加的频率相关联，我们在匹配的样本（扩增的TIL）中检查CD4 + T细胞应答。

在肿瘤组成表达MHC II类中的TIL中检测到较高的肿瘤特异性CD4 + T细胞应答频率（II类组成型阳性：平均7.5％±11％ vs. II类组成阴性1％±1％；P = 0.002；高CD4 + T细胞反应在12/ 19 II类组成型阳性肿瘤vs. 2/19 II类组成型阴性的肿瘤；P = 0.002；图2B；表1）。在所有的情况下，肿瘤识别实验在IFNγ预处理后进行，如果肿瘤特异性CD4 + T细胞存在，使得最终能检测T细胞反应，因为绝大部分肿瘤高水平表达MHCII分子无论MHCII分子组成性阳性（如上）。

这些数据表明，II型表达是一个早期事件经常随后出现肿瘤抗原特异性CD4 + T细胞的浸润。然而，这不是一个绝对的要求，因为在某些组成型II类表达的黑素瘤中没有强CD4 + T细胞应答出现（7/19; 37％）表明，这是不够的，并且在没有组成型II类表达的两种黑素瘤高频中存在CD4 +T细胞反应（Pt.24和Pt. 25; 2/19; 10.5％）表明这不是强制性的。

 特别令人感兴趣的，我们的队列中两个样品（Pt.30和Pt.35）由来自同一患者（表1）但不同时间。第一次转移（命名为Pt.30）切除后进行TIL试验（clinicaltrials.gov identifier：NCT00937625）。不久之后，病人被注入扩增的TIL，此治疗导致> 80％所有先在肿瘤病灶的的复原，但有新的转移病灶出现在第一评价（数据未显示）。这种病变继续增长，在输液TIL 约6个月后，切除（命名为Pt.35）。如表1中所示，这两种细胞系均组成表达MHC II类，但只有难以治疗的和渐进转移性病灶被肿瘤特异性CD4 + T细胞浸润，并且高频出现（表1）。这是一个有趣的观察轶事，表明肿瘤特异性CD4 + T细胞的浸润，可以进行时空动态调节，并且与肿瘤细胞中无明显MHC II类表达变化的疾病进展有关。

图2：在黑色素瘤细胞MHC I类和II类表达和与CD4 + T细胞应答的相关性。 A，在两个具有代表性的患者（组成型II类阳性或MHC组成阴性的黑素瘤）的MHC II类分子（HLA DP，DR，DQ）表达在任何一个第二类阳性黑素瘤一个。虚线，同型控制；灰色实线，组成型表达；黑色实线，预处理IFNγ100IU / mL的72小时后的表达。B，MHC II类分子的组成性表达肿瘤响应CD4 + T细胞的患者的的频率。线显示中值。 C和D中，高或无/低CD4 + T细胞应答的患者黑色素瘤细胞系的相对组成型或IFNγ诱导的I类表达。线表示平均值。

CD4 +和CD8 + T细胞对黑素瘤反应的多官能表征

为了确定CD4 +和CD8 + T细胞应答的潜在功能模式，我们从8例中选择在两个亚群中都有强应答（>2％ CD4 +或CD8 +门控的TIL同时表达TNF和IFNG，和至少10％的CD4 +和/或CD8 + T细胞亚群频率；从Pts.1，5，11，15，18，19，24，和25）的TIL，并进行基于七个不同的已知抗肿瘤活性的多官能的效应器功能分析，为了确定相关的T细胞亚群的反应病人自身的变异性。

为了确定表达T细胞功能的相对定量的能力，我们比较了肿瘤反应性细胞的MFI。利用CD4 +和CD8 + T细胞的严格的选通策略，仅通过有反应的T 细胞（T 细胞反应阳性）对肿瘤活性的细胞进行鉴定。

图3: 对黑素瘤CD4 +和CD8 + T细胞应答的多官能表征。A. 来自肿瘤反应性CD4 +和CD8 + T细胞七个个体 T细胞的功能的表达的半定量比较，对于任何单独的T细胞的功能，在条形图显示出相对表达值用下述式得到：100 / [（全部CD4 + T细胞表达的刺激样品中的单个功能的MFI /未刺激的CD4 + T细胞的MFI） /（全部CD8 + T细胞表达的各个功能的刺激样品中的MFI /未刺激的CD8 + T细胞的MFI）。值超过1，所述个体的T细胞的功能主要是由CD8 + T细胞表达（例如，在细胞因子的情况下，产生细胞因子的单细胞水平CD8 + T细胞产生的细胞因子比产生细胞因子的CD4 + T细胞更多）。 值低于1的，所述个体的T细胞的功能主要由CD4 + T细胞表达。 B，CD4或CD8 T细胞亚群的细胞依据表达的分析七T细胞功能中的至少一个进行门控，和细胞表达的任何的七个细胞功能的频率进行了评估。图表明，绝大多数的肿瘤响应的CD4 + T细胞（即，表达的7种 T细胞功能中的至少一种）也产生TNF。柱表示平均值误差线。 C和D，SPICE的T细胞的功能分析细胞表达的7 种T细胞功能中的至少一个的分析表明CD4 +和CD8 + T细胞非常不同的功能模式。 ＃，P <0.05。

这些分析显示了在单个细胞的基础上， CD4 + T细胞能更多产生TNF（补充图S3）和IL2的固有能力，但是相对于IFNγ，MIP-1α和MIP-1β的生产（图3A）的。另一方面，从仅1例CD4 + T细胞群中检测到IL17A产生，CD8 + T细胞中没有，而CD107a动员与CD8 + T细胞活性（图3A）更加相关联。概括地说，单个产生TNF的 CD4 + T细胞平均产生的TNF，比单个产生TNF CD8 + T细胞得多。IL2的生产量也类似，但如预期的， CD107a动员的结果与之相反。

随后，至少产生七个T细胞功能中一种的细胞的相对比例的选择性分析显示CD4 + T细胞向产生阳性肿瘤坏死因子（TNF）（图3B）显著歪斜。的确，85％C的至少产生一种D4 + T细胞功能的细胞都表达出TNF生产。因此， TNF的产生似乎是CD4 + T细胞必须满足的一个必要条件，以对黑素瘤产生直接响应。这与过去在相同的TIL产品中被观察到的CD8 + T细胞有很大不同，只有约50％的应答细胞产生阳性肿瘤坏死因子TNF（图3B）。其他T细胞的功能，除了CD8 + T细胞IFNγ生产（仅观察到趋势），反映了定量表达评估的结果。的确，我们观察到MIP-1A-和MIP-1b产生细胞的相似频率，CD4 + T细胞表达IL-2的比例略高，但十分显著的是，更多CD8 + T细胞动员CD107a（图3B）。在全球范围内，这些结果表明，无论CD4 + T细胞表达哪种功能，TNF的产生似乎是普遍的。

SPICE（Simplified Presentation of Incredibly Complex Evaluations）是一种新型的生物信息学工具，通过组合布尔门控和复杂算法的数据分析（20，23），允许在众多不同的细胞群（未被经典顺序选通策略证明）中T细胞效应子功能的多样“模式”的深度检测，。为此目的，我们已经利用SPICE T细胞应答的质量监督进行了样品分析。

复杂功能模式分析表明扩增CD4 +和CD8 + T细胞对自体黑色素瘤的反应之间有强烈的病人自身差异（P = 0.0006）。再次确认了CD4 + T细胞显著向TNF生产倾斜，特别是超过50％产生可检测的响应的CD4 + T细胞的仅产生TNF，而CD8 + T细胞的反应出现更复杂，多功能，且大多是基于IFNγ生产或CD107a动员（图3C和D）。补充图S4表示SPICE数据分析的图形，以条形图表示的T细胞功能（n=128）中的所有可能的组合（补充图S4A），CD4 +的（补充图S4B），或CD8 +（补充图S4C）T细胞的NPLot或CoolPlot（补充图S4D）

由于技术的复杂性和所需的描述的实验大量TIL样品的可用性，扩增的TIL如前面所说被用于实验。然而，我们不知道在几次对数扩增中观察到的功能的模式被是否保持。因此，我们进行了最小扩增的TIL以及未培养的TIL类似分析，和与来自相同的病人的扩增TIL的结果比较。我们进行了7种T细胞的功能的实验，但如具有扩增的TIL，只有少数的T细胞表达IL2，IL17A，MIP-1α，或MIP-1β（数据未显示）。因此，只分析了三个功能（TNF，IFNG，和CD107a）。

记住在未培养的TIL的分析中潜在的技术缺陷（参见材料和方法/统计分析），该分析显示出所有TIL分析中观察到的类似模式。密切的相似性与以往扩增的TIL多功能结果。实际上，当在每个类型的TIL培养物中CD8 + T与CD4 + T细胞亚群相比较时，观察到在CD4 + T细胞中TNF产生细胞的比例较高（补充图S5A）。此外，CD4 + T细胞和CD8 + T细胞的模式是不同类型的TIL培养的（补充图S5A和S5B），补充图S6显示了每个单独患者T细胞功能模式，再次示出不同类型的TIL culture之间密切的病人自身相似之处. 这样，我们的结论是，在体外在扩增的TIL中观察的CD4 +和CD8 + T细胞亚群之间的主要功能差异在体内扩增时是稳定的，从而反映在肿瘤微环境的T细胞反应。

在一个不同的说明，似乎比例较高CD107aþ细胞随着IFNgþ细胞的比例较低存在于未培养TIL（补充图S5A和S5B）。然而，考虑到进行分析的患者数少，以及在未培养的TIL的分析技术问题（参见材料和方法/统计分析），这偶然观察到的事件需要进一步的调查，但它不改变整体的结论，即CD4 + T细胞产生更多的肿瘤坏死因子，未培养的TIL也相同。

TNF对CD8 + T细胞识别的影响

因为我们的数据表明，肿瘤坏死因子的产量为黑素瘤特异性CD4 + T细胞的主要效应器功能，所以我们想知道自身黑素瘤暴露于TNF是否可以影响被扩增的CD8 TIL所识别。为此，用TNF，IFNG，或两者TNF和IFNG同时处理黑素瘤细胞。为了再现一个具有较强的CD4 + T细胞应答，CD8 + T细胞应答或两者的肿瘤微环境，在先前的SPICE分析的基础上这个被选择。

图4: 细胞因子对肿瘤识别的CD4 +和CD8 +肿瘤浸润淋巴细胞的影响。 A，肿瘤坏死因子减少肿瘤的识别MART-1特异性CD8 +肿瘤浸润淋巴细胞没有显著改变肿瘤识别其他特定的CD8 +肿瘤浸润淋巴细胞。 FACS图细胞因子表达从三个具有相似结果测试的代表性患者示于该图。 B，暴露于IFNγ，TNF或TNF和IFNG同时对肿瘤的识别大量CD8 +肿瘤浸润淋巴细胞的影响。线显示CD8 +的TIL的频率同时表达TNF，IFNγ，和CD107a中的至少两个功能的平均值。 C和D，IFNγ，TNF或TNF及IFNγ对肿瘤识别大量CD4 +的TIL同时暴露的影响。线显示平均值，P <0.05，P <0.01。

兰茨贝格和他的同事（24）先前已经证明，肿瘤坏死因子诱导黑素瘤可逆去分化并减少了T细胞识别黑色素瘤分化抗原（MDA）。T细胞应答的分析显示，如预期，肿瘤坏死因子显著降低MDAs的识别（图4A和补充图的S7-数字代表不同患者，实验使用来自三个不同患者样品并获得类似的结果；数据未示出）。然而，TNF没有显著影响球型CD8 + T细胞的反应性（图4A和B）。正如所料，IFNγ并不显著增加球型CD8 +和CD4 + T细胞的反应性（图4B-D和补充图S8），如先前由我们的组（10）所证明的。值得注意的是，它也同样被证明，IFNγ既不增加也不减少由MDA-特定细胞进行的自体或异体肿瘤识别，如CD8 + T细胞识别MART-1EAA或GP-100YLE肽（10） - 尽管在这种情况下，因为IFNγ诱导从蛋白酶到免疫蛋白酶转变（25，26），所以仍然未完全阐明，这种影响是否是抗原类特定的或肽特异性，。

令人惊奇的是，暴露于TNF显著降低IFNγ介导的CD8 + T对黑素瘤细胞反应的增加（图4B和补充图S8）。另一方面，TNF与未经处理的肿瘤（图4C和D）相比能增加（尽管不是显著）CD4 + T细胞应答。

这些数据表明，一方面TNF趋于依照正反馈机制略微扩增本身（暴露于TNF的肿瘤增加从CD4 + T细胞的TNF产生），但在另一方面，它抑制了在IFNγ富肿瘤微环境中CD8 + T细胞的反应性，并且这种抑制与强CD8 + T细胞反应的存在同时发生。

TIL对黑色素瘤细胞基因表达的影响

为了阐明所观察到对CD8 + T细胞对肿瘤识别的影响是否与基因表达相关联，对与免疫识别有关的一组基因通过qPCR在八个细胞系中进行分析（来自Pt. 1，5，11，13，15 ，17，18，和19）。除了众所周知的IFNγ对免疫抑制基因表达的有增加影响，也能提高TNF提高表达基因的表达，例如吲哚胺2,3双加氧酶-1（IDO-1）或程序​​性死亡配体 - 1（PD-L1）约5至10倍（补充图S9A）。此外，MDAs的表达下降趋势被证实（补充图S9B）。另一方面，在加入TNF到2至5倍观察到MHC I类处理和呈递途径的表达趋势倾向增加，但尤其是IFNγ本身相对于对照组表达增加约10 f倍（补充图S9C）。

这些数据可能表明，在IFNγ富含肿瘤微环境中，肿瘤坏死因子通过对肿瘤细胞的免疫能力的增强降低黑素瘤免疫敏感性。

图5: 肿瘤响应CD4 + T细胞对肿瘤细胞或CD8 IFNγ应答的影响。A，来自对自体增殖的黑色素瘤细胞高CD4 + T细胞应答的患者的活化CD4 + T细胞的上清液的的影响。点为有误差棒的平均值。 B，来自高CD4 + T细胞应答患者的CD8 +或CD4 +肿瘤浸润淋巴细胞的自体肿瘤细胞毒性。 CD4 + T细胞培养物中显示灰色，CD8 + T细胞以黑色显示。 C和D，分选后的 CD8 +，CD4 +或CD8 +和CD4 +合并的TIL的IFNG ELISPOT分析。 C和D，从个别患者的结果（平均一式三份的观察及误差棒的; C）中，而D显示来自一个有代表性的患者的ELISPOT孔中。

瘤特异性CD4 + T细胞对黑色素瘤细胞的增殖和生存力或对短期的CD8 IFNγ反应的肿的影响

为了表征CD4 + T细胞应答是否会影响黑色素瘤细胞的增殖或存活，我们进行了附加的增殖和细胞毒性实验。

自体肿瘤与来自6例上述（与自体肿瘤同时激活）的高水平CD4 + T细胞反应性（Pts.1，5，11，15，18，和19）患者的分好类的CD4 + T细胞培养物的上清液培养72小时，并如前述以标准流式细胞术为基础的计数测定细胞增殖（10）。只有2个6黑色素瘤细胞系中有意义的CD4 + T细胞的上清液增殖（图5A）是明显的。

CD4 + T细胞对黑色素瘤的直接细胞毒活性已在先前小鼠实验中证明。为了评估是否肿瘤细胞毒性CD4 + T细胞可在人类中被检测到，对分类后的CD4 +或CD8 + T细胞来自5名高CD4 + T细胞反应患者（Pts. 1，5，11，15，和19）进行标准的4小时的细胞毒性实验。在4/5的案例中CD8 + T细胞显示杀死自体肿瘤的能力，而CD4 + T细胞在任何情况下没有显示出（图5B）。

这些结果表明，在免疫应答的效应阶段CD4 + T细胞反应似乎不具有直接强烈的抗肿瘤活性。

评估CD4 +和CD8 + T细胞生产IFNγ是否其他细胞亚群的存在的影响和/或CD4 + T细胞的存在是否可以增强的CD8应答，进行来自6个高CD4 + T细胞的反应性患者（Pts.1，5，11，15，18，和19）的CD8 + T细胞加入CD4 +，CD8 +或CD4 +和CD8 +一起的ELISPOT分析。添加两种细胞亚群获得IFNγ特定斑点的数目与单独的任一CD4 +或CD8 + T细胞获得的斑点数的平均值是大概一致的，和没有观察到增加效应（图5C和D）。因此，我们的结论是，在短期测定法中关于肿瘤识别和相对IFNγ生产CD4 +和CD8 + T细胞似乎不相互作用或影响彼此。

组成型和高CD4 + T细胞反应患者的结果

最后，我们试图评估在扩增的TIL是否高CD4 + T细胞应答，组成型II类阳性，或高CD4 /的CD8 T细胞比率（后者具有较多病例）的存在与已知的黑色素瘤或患者的生存预后相关联因素。血浆乳酸脱氢酶（LDH）被选择用于实验，因为它目前代表在转移性黑色素瘤的最准确的预后循环标记物的。 

并没有观察到血浆LDH水平巨大差异（补充图S10A和S10E），除了在较高的LDH值、无MHC II类组成肿瘤患者（补充图S10C）。在患者组（补充图S10B，S10D，与S10F）之间，总生存期无显著差异。同时考虑到数量相对较少的患者，这些数据表明，检查的因素不是黑色素瘤强有力的的预后指标。

讨论

有在人类转移性黑素瘤中由CD4 + T细胞应答介导的肿瘤消退轶事的病例被报告（8，9，27）。然而，很少有人知道在肿瘤微环境，如何生成天然效应子CD4 + T细胞应答，CD4 + T细胞是如何影响CD8 + T细胞反应。

MHC II类的组成型表达通常仅限于专业抗原提呈细胞（APC;参考28）。然而，以往的研究表明，MHC II类的黑色素瘤的组成型表达通过II类反式（CIITA）的异常转录可能不是一个随机事件，而是与恶性转化有关（29）。 CIITA活化本身并没有参与肿瘤发展（30），这表明它的异常诱导是靠一个依赖于MHC II类表达的更复杂的网络发起和维持。

在这项研究中，我们已经表明，尽管不是必要的或足够的，在黑色素瘤细胞MHC II类的从头组成型表达是一个功能强大的刺激，以促进肿瘤特异性CD4 + T细胞在肿瘤微环境的积累。我们的数据表明，据推测，局部黑素瘤已经发生在早期阶段。 CD4 + T细胞直接识别黑素瘤的表面上呈现相关联地MHC II类分子的肿瘤抗原，并执行由TNF产生支配效应子功能。事实上，内源性蛋白可以通过自噬和/或非经典的抗原加工（31，32）被呈现在II类。

我们已经表明，通过肿瘤特异性CD4 + T细胞产生的效应子功能不显著影响黑素瘤增殖或生存力，与CD8 + T细胞的同时有效的细胞毒性。这意味着，细胞扩增的标准条件下，至少在大多数情况下，肿瘤特异性CD4 + T细胞的直接的抗肿瘤活性不是很有效地黑素瘤的体外生。这可能反映了体内大多数肿瘤特异性CD4 + T细胞这个条件是不能够介导直接的有力的抗肿瘤作用。

以前的研究表明黑素瘤肿瘤的长期暴露于TNF的有害作用。兰茨贝格和他的同事（24）已经表明，以下的TNF-丰富的炎性环境可以降低免疫原性和通过诱导可逆的去分化促进黑色素的免疫逃逸。在这项研究中，我们已经证实，黑色素瘤在局部的TNF的慢性暴露下调MDA-特异性CD8 + T细胞的识别。然而，使用批量TIL培养的时候，非常有趣的是，暴露前肿瘤坏死因子并没有显著影响CD8 + T细胞反应。这可能表明，MDA​​特异性T细胞对总CD8 + T细胞反应性的贡献比较小。

与此相反，暴露于TNF能显著降低众所周知IFNγ介导增加的CD8 + T细胞反应对黑素瘤的。这表明，在一个IFNγ丰富的环境，例如含IFNγ产生CD8 + T细胞的肿瘤微环境，来自肿瘤特异性CD4 + T细胞（或其他来源）的TNF可能降低CD8 + T细胞的反应性，并通过正反馈的T细胞反应同步增加CD4 +，从而扩增本地TNF信号。

尝试表征导致所观察到的现象的分子事件，我们分析一组能够通过影响对黑素瘤免疫敏感性的基因的表达。虽然IDO-1和PD-L1的诱导证明了进一步增加肿瘤细胞的免疫抑制能力，并且TNF的加入降低MDA基因的表达，与MHC I类抗原加工和呈递途径相关联的其他基因似乎也被诱导。尽管困难量化不同免疫活化/免疫抑制途径的相对贡献，肿瘤细胞的增加的免疫抑制能力可能解释了在实验中观察到的免疫灵敏度减少。

有趣的是，这些数据支持一个肿瘤进展模型: 为了逃避有效的CD8 + T细胞反应，一些黑色素瘤激活CIITA因此组成型表达MHC II类。反过来在肿瘤微环境募集了通过TNF的产生抑制CD8 + T细胞应答的肿瘤特异性CD4 + T细胞。

值得注意的是，MHC II类与其他肿瘤相关的免疫抑制分子有几个共同的特点，例如，氧酶和PD-L1上。事实上，如本和几个其他研究中，MHC II类的异常在某些黑素瘤被激活，并完全和IDO和PD-L1相同（33，34），它是由IFNγ介导的免疫应答上调的。因此，在黑色素瘤原位检测的MHC II类的可表示在黑色素瘤细胞组成型表达或被诱导IFNγ分泌细胞（例如，肿瘤抗原特异性CD8 + T细胞），或两者​​的存在。

迄今许多其它逃避CD8 + T细胞应答的机制已被表征（35）。 CD8 + T细胞识别与MHC I类分子表达的肿瘤细胞的表面上的相关联的肿瘤抗原。因此，在I类抗原加工和呈递途径的缺陷，以及I类MHC分子下调可能本身抑制CD8 + T细胞应答。事实上，几个研究已经证明，I类分子表达的下调与几种预后较差的实体肿瘤相关联，包括黑色素瘤（5）。

有趣的是，在这项研究中的那些未吸引强CD4 + T细胞应答的黑素瘤响应于IFNγ显示MHC I类的一个有缺陷的上调。这确实可能被解释为额外的免疫逃逸机制，从而暗示肿瘤两个不同亚群的存在：（i）高CD4 + T细胞应答（在大多数情况下，由第II类的从头组成性表达引起）和正常 I类黑素瘤接触IFNγ后上调; （ⅱ）有响应于IFNγ缺陷的I类上调的黑素瘤不吸引强CD4 + T细胞应答。根据这个模型，二者黑素瘤答要么间接地通过炎性CD4 + T细胞的吸引力（黑素瘤亚群i）中，或直接通过I类MHC（黑素瘤亚群ⅱ）的有缺陷的上调有效地下调CD8 + T细胞应。

作为这一理论的间接确认，强CD4 + T细胞应答（或具有组成型MH C II类阳性的肿瘤）患者似乎没有比无CD4 + T细胞反应的患者具有更差的预后。后者表达一个普遍有缺陷的上调的MHC I类分子。

在我们的研究中，绝大多数病人（85％）被确诊为AJCCⅣ期黑色素瘤（向远处转移）。然而，我们发现强烈的CD4 + T细胞反应在有3/6例早期疾病阶段（IIIB / IIIC）。如由最近的一项研究（36），在执行及时完整切除局部黑色素瘤的情况下，局部免疫反应的影响则与临床结果无关。相比之下肿瘤固有特征可能决定了患者是否很快会向远处转移。因此，更可能的是我们的观察可以被应用到完全切除是不可行的疾病阶段。

应当强调的是，尽管CD4 + T细胞天然对黑素瘤原位的响应和相关慢性暴露于TNF可以减少在大多数情况下（即，大多数肿瘤特异性CD4 + T细胞）的抗肿瘤CD8 + T细胞反应，如最近由Tran和他的同事（37）在胆管癌中（即，多官能性突变的抗原特异性CD4 + T细胞）或由以前单一的病例报告（9，27），这不排除选择CD4 + T细胞亚群的潜在有益作用，或者利用这些应答原理的治疗的可能性的。关于这一点，最近，Linnemann和他的同事（11）在黑色素瘤发现特征变异（新 - ）抗原特异性CD4 + T细胞。在他们的研究中，作者描述了在4/5例患者（相对）小的CD4 + T细胞亚群在接触新抗原后产生IFNγ，而不是其他细胞因子。这是特别有趣的，因为我们的数据显示，黑色素瘤中肿瘤特异性CD4 + T细胞绝大多数产生TNF和而不是IFNγ，也表明黑素瘤特异性CD4 + T细胞的一个非常小的亚群只产生IFNγ（图3C和D）。无论如何这难以得出确切的结论，因为Linnemann和他的同事的大多数的T细胞识别分析（11），使用自体B细胞（呈新抗原）为靶，而不是肿瘤细胞。确实以前的研究得出，一些因素可能影响T细胞的功能，包括抗原密度（38，39）可能在肽负载的APC和肿瘤细胞不同。未来的研究将确定功能差异是否在不同的类肿瘤抗原的CD4 + T细胞亚群之间存在。

此外，肿瘤抗原特异性CD4 + T细胞的作用当然不限于直接识别的肿瘤细胞。例如，肿瘤抗原特异性CD4 + T细胞通过可抗原呈递细胞（40）的CD40的配体介导的激活促进肿瘤抗原特异性CD8 + T细胞的交叉激活的。最近，出乎意料的是，在三个的小鼠模型结果表明，大部分的免疫原性mutanome是由CD4 + T细胞识别（41）。如果由CD4 + T细胞识别的肿瘤抗原的是癌症如此普遍，可以推测，在肿瘤进展，癌细胞利用（或至少不影响）这些免疫系统的特征成形。我们的结果表明，这可能通过局部条件的产生（例如，MHC II类的异常表达）来实现诱导例如CD4 + T细胞在肿瘤微环境积聚来支持，而不是抑制，肿瘤的生长。

总之，免疫逃逸的几个机制已经确定，在临床上这些战略在抵消肿瘤免疫抑制表现出不俗的成绩（42-45）。在这项研究中，我们已经确定了黑色素瘤中从头MHC II类上的异常表达可通过招募炎症肿瘤抗原特异性CD4 + T细胞对肿瘤逃逸起作用的潜在机制。然而，在起始和维持的免疫反应中的MHC II类分子的基本作用不会立即保证策略直接抵消这一途径，未来的研究会解决这个问题。