第五章 植株再生的教案

所谓植物细胞的全能性: 是指任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植珠所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。

植株再生途径：

                       脱分化    愈伤组织  再分化

外植体                               再生植株

                              器官（根、芽）

几个需要了解的概念：

1. 愈伤组织(callus）,原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞．

组织培养中，则是指在人工培养基上由外植体组织的增生细胞产生的一团不定形的疏松排列的薄壁细胞．

2. 分化(differentiation)： 细胞在过程中发生结构和功能上的改变，从而在个体发育中形成各类组织和器官完成整个生活周期。

3.脱分化(dedifferentiation): 

 已分化好的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分生组织状态的过程。

4.再分化(redifferentiation):

脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。

二、愈伤组织的培养

（一）愈伤组织形成的条件

1、 外植体

植物的形成层、皮层、髓、次生韧皮部及木薄壁组织和表皮等都能形成愈伤组织，所以一般认为诱导愈伤组织成败的关键不在于植物材料的来源，而在于诱导的条件。

但是植物不同组织脱分化能力不同。

越幼嫩的组织脱分化能力越强。所以在决定选用一个合适的材料时，必须考虑以下一些因素：

①取材部位；

②取材植株的质量：植株健壮，生理状态良好。

③离体材料（外植体）的大小；切块的具体大小一般在0.5厘米左右，太小时产生愈伤组织的能力弱，太大时，又会在培养瓶中占地方太多，且易污染。

2) 培养条件  a.培养基和植物生长调节物质，b.培养方式：固体培养和液体培养，c.外部环境（光、温度）

植物生长调节物质是诱导愈伤组织极为重要的因素。用于诱导愈伤组织形成的常用的生长素是2,4－D、IAA和NAA，所需浓度在0.01～10mg·L-1范围内，如诱导玉米胚愈伤组织发生的培养基为MS+8mg·L-1  2,4－D+1mg·L-1NAA，在很多情况下，单独用2,4－D就可以成功地诱导愈伤组织发生，但是2,4－D浓度过低（10-3mg·L-1）时，生长会受到抑制；常用的细胞素是激动素和6-BA，使用的浓度范围在0.1～10mg·L-1。一般情况下，生长素和细胞素对保持愈伤组织的快速生长是必要的，特别是两者结合应用时，能更强烈地刺激愈伤组织的形成。

（二）愈伤组织形成过程

从单个细胞或一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：

阶段1、 诱导期

是细胞准备恢复的时期；是愈伤组织形成的起点。

诱导期细胞的特点：处在静止状态的成熟细胞通过一些刺激因素和激素的诱导作用，使其合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸物质的合成。细胞大小变化不大。

诱导期代谢变化：1)在切离和培养后的几秒钟内，细胞的气体交换迅速增加。2)多聚核糖体的不断增加，到有丝前，每个细胞中的RNA含量增加到30%。3)蛋白质也发生周期性积累，每个细胞的总增加量约为200%。4)酶活力增加，DNA聚合酶活力增加；与代谢有关的酶类，如己糖激酶和一些脱氢酶的活力增加。

诱导期的长短，因植物种类和外植体的生理状况和外部因素而异。如菊芋的诱导期只要22h，而胡萝卜需要几天时间，若菊芋块茎经5个月的贮藏，诱导期则须延长到40h。

阶段2、期

指细胞通过一分为二的，不断增生子细胞，即发生脱分化的过程。

经过诱导期之后，外植体外层细胞开始迅速。在这一时期由于细胞的速度大大超过了细胞伸展的速率，细胞体积迅速变小，逐渐恢复到分生状态。

1）特点：

1． 细胞的数目迅速增加。胡萝卜培养7天后，细胞数可增加10倍。

2． 每个细胞平均鲜重下降。这是由于细胞鲜重的增加不如细胞数目的增加快的缘故。

3． 子细胞具体积小，内无大液泡的特点，和根茎尖的分生组织细胞一样。

4． 细胞的核和核仁增大到最大。

5． 细胞中 RNA含量增高，RNA含量最高时，标志着细胞进入了高峰期。

6． 组织的总干重、蛋白质和核酸含量逐渐增加，新细胞壁的合成极快。

2）此时愈伤组织的形态特征：细胞快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态。

影响因素：脱分化因植物种类和器官及其生理状况而有很大差别，如烟草、胡萝卜等脱分化较易，而禾谷类的脱分化较难；花器官脱分化较易，而茎叶较难；幼嫩组织脱分化较易，而成熟的老组织较难。

3） 愈伤组织生长特点：愈伤组织的增殖生长只发生在不与琼脂接触的表面，而与琼脂接触的一面极少细胞增殖，只是细胞分化形成紧密的组织块。因此，由于愈伤组织的迅速增殖，组织小块变成了一个不规则的馒头状的块状结构。它是愈伤组织表面或近表面瘤状物生长的结果。

4）愈伤组织的继代培养：愈伤组织块若在原培养基上继续培养，由于其中营养不足或有毒代谢物的积累，会导致愈伤组织块停止生长，直至老化变黑死亡。因此，若要愈伤组织继续生长增殖，必须定期地（如2～4星期）将它们分成小块，接种到新鲜的原培养基上继代培养，愈伤组织可长期保持旺盛的生长。但是长时间的继代培养的细胞会出现染色体丢失，从而影响愈伤组织的再分化。

阶段3、形成期

   指外植体细胞经过诱导期和期后形成了无序结构的愈伤组织时期。

主要特征：

1．细胞的体积突然不再减小。保持相对不变。

2．细胞部位和方向发生改变。期的细胞局限在组织的外缘，主要是单周；在形成期开始后，愈伤组织表层细胞的逐渐减慢，直至停止。愈伤组织内部深处的局部地区的细胞开始，使面的方向改变了，出现了瘤状结构的外表和内部分化。

3．分生组织瘤状结构和维管组织的形成。当愈伤组织生长速度减慢时，就形成由分生组织组成的瘤状结构，它变成不再进一步分化的生长中心，而在其周缘产生扩展的薄壁细胞。瘤状结构团团地散布在愈伤组织块中。这时形成了维管组织，但不形成维管系统，而呈分散的节状和短束状结构，它可单由木质部组成，也可由木质部、韧皮部乃至形成层组成。细胞素促进维管化组织形成。

4．出现了各种类型的细胞。如薄壁细胞、分生细胞、管胞、石细胞、纤维细胞、色素细胞、毛状细胞、细胞丝状体等。

这时虽然在愈伤组织中发生了细胞分化，形成维管化组织和瘤状结构，但并无器官发生。只要满足某些条件，就可从愈伤组织通过再分化而产生苗或根的分生组织，甚至胚状体，进一步能发育成完整植株。

5．生长旺盛的愈伤组织一般呈奶黄色或白色，有光泽，也有淡绿色或绿色的；老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。

以上对愈伤组织形成过程的时期的划分并不具有严格的意义，实际上，特别是期和形成期往往可以出现在同一块组织上。另外植物细胞脱分化并不一定形成愈伤组织，越来越多的实验表明，植物细胞脱分化可以直接分化为胚性细胞而形成体细胞胚。

二、愈伤组织的类型

根据愈伤组织有无胚性分为：胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织

 根据愈伤组织的质地分为：松脆愈伤组织和致密愈伤组织

松脆愈伤组织和致密愈伤组织之间可以相互转化。

在不同的实验中由于目的的不同，对愈伤组织状态的要求也不完全相同，但优良的愈伤组织通常必须具备以下4个特性：

1．高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织中得到再生植株；

2．容易散碎，易于建立优良的悬浮系；

3．旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系；

4．胚性的保持力强，即长期继代胚性不丧失，以便可以对其进行各种遗传操作。

（四）愈伤组织细胞的分化

愈伤组织在离体培养过程中，组织和细胞的潜在发育能力可以在某种程度上得到表达，伴随着反复的细胞，又开始新的分化。

在分化过程中，植物生长调节剂的作用是极为明显的，合适的植物激素配比在器官分化中有着重要的作用。当生长素与细胞素的比例高时，仅形成根，生长素与细胞素的比例低时则产生苗。

生长素对维管组织分化过程有显著影响。法国植物学家Camus（1949）最早将小的营养芽嫁接在一种菊苣属植物根的愈伤组织表面，这些愈伤组织由薄壁细胞组成，经培养一段时间后，愈伤组织已分化出维管组织。后来，Wetmore等用洋丁香芽嫁接于开始生长的愈伤组织上，培养后，在芽基部的周围发生了零星分布的细胞团，稍后由它们又进一步分化成维管组织。而在远离芽的愈伤组织的深处，这种细胞团却分化成瘤状的结构，瘤内木质部向心分布，韧皮部位于离心的一侧。后来证实芽能诱导维管组织的分化是与芽在生长时合成了某些植物激素有关。在蚕豆愈伤组织实验中，用含有蔗糖和生长素的琼脂能代替芽的作用，同样诱导维管组织的分化。一般说来，生长素浓度和木质部发生之间存在着一种反比关系，低浓度的生长素能刺激木质部的发生。

生长素对维管组织分化所起的作用在很大程度上取决于糖的存在。在洋丁香愈伤组织实验中，如果灌注到愈伤组织顶面缺口里的琼脂含有0.05mg·L-1 IAA和1%蔗糖，愈伤组织只能形成数量很少的木质部分子。若保持生长素浓度不变，蔗糖水平达2%，则有利于木质部的分化，但韧皮部很少形成；当蔗糖水平为2.5%～3.5%时，木质部和韧皮部都能分化，蔗糖为4%时，只有韧皮部形成。

细胞素也能刺激大豆子叶愈伤组织木质部的形成。对烟草愈伤组织木质部形成而言，IAA和激动素之间存在协同作用。此外，生长素和赤霉素之间对木质部发生存在着刺激性的相互作用。乙烯也参与愈伤组织木质部的形成，如发现在缺乏乙烯的番茄突变体植株内，木质部没有导管，但产生乙烯的正常植株则有导管。银能抑制大豆愈伤组织木质部的分化，加入蛋氨酸可以克服银的抑制作用。

三、 再生植株的获得——愈伤组织的形态建成

已分化的具有专一功能组织细胞，改变细胞原来的结构、功能，而回复到无功能分工的分生组织状态，即愈伤组织状态。再从愈伤组织分生细胞团再分化，进行形态建成，可再产生完整的植株。

(一)愈伤组织形态建成

愈伤组织的形态建成，有器官发生和胚状体发生两种方式：

1、器官发生    指细胞或愈伤组织培养物，通过形成不定芽/不定根再生成植株，这是组培中常见的发生方式。

愈伤组织的器官发生顺序有三种情况：

①先产生根，在组织培养中最常见的再分化是根的形成，但在培养中先形成根的，往往抑制芽的形成，尤其对于单子叶植物； 

②先形成芽，再在芽伸长后，在其茎的基出根而形成小植株，多数植物属这种情况；

③先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株小植株；

2、胚状体发生 

胚状体（embryoid）：指在组织培养中，起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的具有双极性的胚状结构。从胚状体的定义来看：（1）体细胞胚不同于合子胚，因为它不是两性细胞融合的产物；（2）它不同于孤雌/或孤雄胚，因为它不是无融合生殖的产物；（3）它不同于器官发生途径形成的茎芽和根，因为它的形成须经历与合子胚相似的发育过程，而且成熟的胚状体是一个双极性的结构。

1）影响胚状体发生的因素

胚状体发生的方式最早在胡萝卜的组织培养中发现。现在大量实验证实，植物体细胞具有成胚的潜力。但是体细胞胚发生受许多因素的影响，Steward曾经提出椰子汁对离体条件下胡萝卜体细胞胚胎发生具有重要的作用，但这项结论未被其它研究者证实。目前认为生长素和氮源是影响胚状体发生的两个特别重要的因素。

（1）生长素：以离体条件下多数植物愈伤组织的体细胞胚发育，需要含2,4－D的培养基，其浓度范围为0.5～10mg·L-1，愈伤组织在这种培养基上，首先分化形成分生细胞团（称胚性细胞团）；在胚性细胞团发育到某一时段时，将之转移到生长素含量很低（0.01～0.1mg·L-1）或完全没有生长素的培养基上，它们就能发育为成熟的胚。因此，要形成体细胞胚，其关键是除去或降低培养基中的生长素成分（如2,4－D）的时间，去除2,4-D的时间一般认为是原胚期。2,4－D对胚胎成熟过程的抑制作用可能是通过内源乙烯引起的。培养在含2,4－D培养基上的胡萝卜愈伤组织产生的乙烯比培养在不含2,4－D培养基上的含量多。组织乙烯含量的增加将导致纤维素酶或（和）果胶酶活性的增强，在原胚发生极性分化之前破坏胚性细胞团，使原胚不能发生组织分化。

其他植物生长物质也能影响体细胞胚的形成。在南瓜中，NAA和IBA能促进胚胎发生。有些研究者发现0.1μg·L-1 的玉米素促进胡萝卜体细胞胚发生。

（2）氮源  培养基中的氨源形态也会显著影响离体条件下的胚胎发生。在野生胡萝卜叶柄节段的培养物中，只有在含一定数量还原态氮的培养基时，才能有胚胎发生，用NH4+ 和水解酪蛋白优于NO4— 或谷氨酰胺。

2）细胞胚与合子胚的比较

 （1）具有两极性，即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都为单向极性。

 （2）胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往往与愈伤组织的维管组织相联系。

 （3）胚状体的维管组织的分布是的“V”字形，而不定芽的维管组织无此现象。

 胚状体优点：产生数量多；可制人工种子，便于运输和保存；后代遗传性更接近母体。

(二)愈伤组织形态发生的

 细胞和愈伤组织的形态发生，主要受外植体本身、培养基和培养环境等三大类因素的。

1. 材料本身

虽然所有的植物细胞都具有全能性，能够重新形成植株，但各种细胞在表现全能性、重新形成植株的能力并不相同。这种差别不仅表现在同一植株的不同部位、不同器官和不同组织上，而且还表现在植物种类、植株年龄、生长季节和生理状态上。

(1)遗传型  

(2)器官和部位  

  (3)年龄  

2. 培养基

  培养基的各种成分和物理性质，都对器官发生产生一定影响，但起决定作用的仍然是植物生长激素，特别是生长素和细胞素的配比。

(1)生长激素   

(2)无机营养元素

(3)有机成分  

(4)物理性质   

3.培养环境条件

    (1)光照  (2)温度