USP_1225_-_药典规程的验证

用于评价药品质量水平的检验规程受到多方面要求影响。根据联邦食品、药品和化妆品法案501章，由美国药典和国家处方集各论中的含量测定和质量标准构成了法定标准。现行GMP[21 CFR 211.194(a)]要求，用于评价药物与已建立标准符合性的检测方法，必须符合在准确度和可靠性方面的适当标准的要求。根据这些法规[21 CFR 211.194(a)(2)]，在美国药典-国家处方集中有描述的分析方法无需验证这些方法的准确度和可靠性，而仅需要核查在实际使用条件下的实用性。认识到美国药典和国家处方集的法律地位，因此，建议采用新的或是修订的药典分析规程，以充分的实验室数据支持记录方法的有效性。

本信息章节的内容最大程度的与三方国际会议(ICH)的文件《分析规程验证》和《方法学》的延伸内容保持一致，涉及到的分析规程包括欧盟、日本和美国提交的注册申请的一部分。

药典意见书

关于新的或修订的分析规程的药典意见书应该包括充足的信息，使美国药典专家理事会及其专家委员会的成员能评估拟议规程的相对优势。大多数情况下，验证涉及到评估分析规程描述的清晰性和完整性，需要此规程的确定性，和已恰当验证过的文件。信息可根据涉及到的方法类型而改变。然而，大部分情况下，提交建议包括以下部分：

基本原理—这部分内容应该确定规程的需要性，描述提出的此规程的性能和它优于其他类型的原因。对于修订的规程，应提供相比之下现行药典规程的局限和拟定规程的优势。

拟定分析规程—这一部分应该充分对分析规程进行完整性描述，具体到能使业内人士重复它。文章应包括所有重要的操作参数和具体指令，如：试剂制备、进行系统稳定性试验、所用空白的描述、预防措施、实验结果计算的明确公式。

数据要素—这一部分应提供完全的、完整的此分析规程验证的文件材料。其应该包括对于证明每个实用分析性能特征的实验数据和计算的总结。这些特性在下面的部分描述。

验证

一个分析规程的验证是建立和实验室研究的过程，该程序的运行特性满足预定分析程序的要求。在此文件中所描述的规程种类的验证中，典型的分析运行性能特征应该是表1文件中列出所描述的。因为对于术语和使用的意见可能不同，在这一章节的下一部分单独定义了每个运行性能特性，同时单独描述了测量常用的典型的一种或几种方法。定义适用于“试验结果”。分析规程的描述应该明确什么是该规程的试验结果。如ISO 5725-1 和3534-1所规定的，试验结果是指“进行特定实验方法是得到的参数值。实验方法应明确实验结果记录的一个或几个所得测量值，和他们的平均值，或者其他的合适的函数（如中值或标准偏差等）。也可要求使用的标准修正值，如气体体积对于标准温度和压力下的修正值。因此，试验结果可以是几个观测值的计算结果。同样，试验结果也是观测值本身。”

一个试验结果可以是，但不必是，被当做是一个标准的验收准则的最终得和可记录的值。物理性能方法的验证可涉及到化学计量学模型的评估。然而，典型的用于方法学验证的分析性能参数应适用于源于使用化学计量学模型的方法学。当得到一个规程验证的代表性样本时，应考虑到进行条件的影响和分离的材料的潜在的影响。

表1. 在方法验证中使用的常用分析特性

ICH文件对下列情况下关于验证的必要性作出了指导：原料药合成中的变更；成药组成中的变更；以及分析规程中的变更。

1225章目的是提供适合于验证大围的药典分析规程的信息。药典规程的验证会用到表1中列出的用于方法学验证的和表2中分析方法分类列出的一些或是全部的典型分析特性参数中。对于一些药典规程的验证，验证的基本方法可能不在1225章节所提到的性能参数之中。对于这些规程，在单独的药典章节中规定那些特别的分析验证性能参数和所有验证要求。

分析运行特性参数

准确度 

定义---- 分析规程的准确度是由该规程得到的测试结果与真实值的接近程度。分析规程的准确度应该在其整个范围内得到确立。

 [术语注释：在<1225>中的准确度的定义仅在无偏差时与ICH Q2相符合在VIM和ISO文件中，准确度意义不同。在ISO中，准确度是把无偏性（术语是真实度）和精密度相结合]

测定---- 对于原料药的含量测定，可以用该分析规程来分析已知纯度的被分析物（例如，某个标准物质），或将以此规程所得的结果与第二种、成熟的、已知准确度的规程所得的结果进行比较，以测定其精确性。

对于处方产品中某个药物的含量测定，以该分析规程来分析成药各组分的合成混合物，其中已经在这些组分的范围之内加入已知数量的待分析物。如果不可能得到成药的所有组分，也可以将已知数量的待分析物加入到该成药中（例如，“增敏”），或者将结果与用第二种、成熟的、已知准确度的规程得到的结果进行比较，对于杂质的定量分析，应使用以已知数量杂质增敏的样品来评估准确度。当不可能获得特定杂质或降解产物的样品时，应将结果与得自规程的的结果进行比较。在没有其他信息的情况下，可能必需通过将某种杂质的响应值与药物的响应值进行比较来计算杂质的数量；同等数量的杂质与药物的响应值的比值（相对响应因子），如果已知，则应使用。

通过测定被加入到样品中的已知数量的被分析物来计算准确度，得到回收百分比，或得到平均值与接受的真实值之间的差异，并给出置信区间。

ICH文件建议精密度的评估应当使用覆盖规定范围的至少三个浓度水平进行至少九次测试（例如，三个浓度并且每个浓度三次重复进样）。

准确度的评估可以通过多种不同的方式完成，包括评价在含量测定的整个范围内被分析物的回收率，或评价估计与实际浓度之间关系的线性。具统计学意义的标准有二，一是斜率的置信区间被限定在约1.0的区间，二是此斜率接近1.0。在任意一种情况下，此区间或接近程度的定义应该在验证方案中明确规定。接受标准将取决于含量和其差异性，以及取决于该产品。通过测试证明该斜率为1.0的零假设没有统计学意义，这样的方法不能用于设定接受标准。

物理特性方法学的准确度可以通过标准参考物质的分析进行评估，上述方法的适用性根据具体个例具体分析 。

精密度

定义---- 分析规程的精密度是当该分析规程单独分析均质样品的多个样本时，若干检验结果的一致程度。分析规程的精密度通常以一系列测量数值的标准差或相对标准差（变异系数）来表示。精密度可以是分析规程在普通操作条件下可重现性或可重复性程度的度量单位。在此内容里，可重现性涉及在协作研究中，分析规程在不同实验室的使用。中间精密度（也称为“耐久性”）体现了在实验室内的差异，如在相同的实验室，但在不同的日期，或使用不同的分析员或设备。可重复性涉及在同一个实验室内，一段较短的时间内，使用相同的分析员和相同的设备的情况下，对分析规程的应用。

测定----分析规程的精密度的测定，通过对充足数量的均质样品的等分试样做含量测定来进行，以便能够计算标准差或相对标准差（变异系数）的具有统计学意义的估计值。在此内容中的含量测定是样品的多次分析，其样品已经用完整分析规程（从样品制备到最终检验结果）进行过分析。

ICH文件建议可重复性的评估应该使用最少九次检测，覆盖该分析规程所规定的范围（例如，三个浓度和每个浓度三次重复进样，或在100%测试浓度上进行最少六次测定）。

专属性

定义---- ICH文件将专属性定义是当待分析物含有预期会有的其他组分（例如，杂质、降解产物、矩阵组分）时，准确可靠地评估待分析物的能力。某个分析规程缺乏专属性可以通过其他辅助性分析规程进行补偿。【注意：其他声誉卓著的国际权威机构（IUPAC、AOAC-I）已经提出术语“选择性”，而将“专属性”留给已经具有完全选择性的规程。】对于下面讨论的测试，上述定义具有以下的含义。

鉴别检测：确保待分析物的鉴别。

纯度检测：确保执行的所有分析规程能够令对于待分析物各杂质含量的准确陈述得以做出。

含量检测：提供准确的结果，令对样品中待分析物的含量或效力的准确陈述得以做出。

测定---- 对于定性分析（鉴别检验），应当论证其在可能存在的、结构密切相关的物质中进行选择的能力。从含有待分析物的样品中得到阳性结果（可能通过与已知标准物质的比较），而从不含待分析物的样品得到阴性结果，以对其选择能力加以确认，并还要确认阳性响应不是来自与待分析物结构相似或密切相关的物质。

对于检测杂质的分析规程，专属性可以通过以适当水平的杂质将原料药或成药增敏，并论证这些杂质的测定达到了适当的准确度和精密度。

对于含量检测，对专属性的论证要求能够显示出该分析规程不受各杂质或辅料的影响。在实际操作中，通过以适当水平的杂质或辅料将原料药或成药增敏，并证明含量检验结果不受这些外来物质的影响，来完成论证。

如果没有杂质或降解产物的标准品，可以通过将含有杂质或降解产物的样品的测试结果与第二种、成熟规程（例如，药典或其他验证过的规程）的结果进行比较，来论证专属性。这些比较应该包括在相关破坏性条件下（例如，光、热、湿度、酸/碱水解、氧化作用）存储的样品。对于含量测定，应比较其结果；对于色谱法杂质检测，应比较杂质概况。

ICH文件声明，当使用色谱分析规程时，应提交具代表性的色谱图，以论证选择性的程度，而且应对色谱峰作适当的标识。也可以使用色谱峰纯度测试（例如，使用二极管阵列或质谱仪），来显示待分析物的色谱峰仅产生于一个组分。

对于通过光谱学方法验证定性定量测定，涉及到如近红外分光光度法、拉曼光谱学、X-射线粉末衍射等主题内容的，应参考相关的章节。

检测限度

定义---- 检测限度是限度检测的特性。它是指在规定的试验条件下，样品中可被检测到的待分析物的最小数量，但是无需定量。因此，限度检测仅仅说明了待分析物的数量高于或低于某个特定水平。检测限度通常以在样品中的待分析物浓度（例如，百分比、十亿分率）表示。

测定---- 对于非仪器分析规程，检测限度的测定方法通常为，对含有已知浓度待分析物的样品进行分析，并确立能够可靠地被检测出来的待分析物的最低水平。

对于仪器分析规程，可以使用与非仪器分析规程相同的方法。对于提交用于官方药典规程的备选方法，其几乎从来不需要确定实际的检测限度。而是，通过分析含有高于和低于必需的检测水平的、已知待分析物浓度的样品，以显示检测限度足够低。例如，如果必需检测浓度在0.1%的杂质，则应当证明该分析规程将可靠地检测在这个水平的杂质。

对于展示出背景噪音的仪器分析规程，ICH文件描述了一个通用方法，用来比较从以下样品测得的信号，这些样品分别为含已知低浓度被分析物的样品和空白样品。这样就确立了能够可靠检测的待分析物的最低浓度。可接受的典型信噪比是2:1或3:1。其他方法取决于校正曲线斜率的测定和响应值的标准差。无论用什么方法，均应该在随后通过分析适当数量的、已知接近或制备于检测限度的样品，来验证检测限度。

定量限度

定义---- 定量限度是样品矩阵中低含量物质的定量分析的特性，例如在原料药中的杂质和成品药物中的降解产物。它是在规定试验条件下，能够以可接受的精密度和精确度进行测定的样品中待分析物的最小量。定量限度以样品中待分析物的浓度（例如，百分比、十亿分率）来表示。

测定---- 对于非仪器分析规程，定量限度的测定方法通常为对含有已知浓度待分析物的样品进行分析，并确立能够以可接受的准确度和精密度被检测出来的待分析物的最低水平。

对于仪器分析规程，可以使用与非仪器分析规程相同的方法。对于提交用于官方药典规程的备选方法，其几乎从来不需要确定实际的检测限度。而是，通过分析含有高于和低于必需的定量水平的、已知待分析物浓度的样品，以显示定量限度足够低。例如，如果必需在0.1mg每片的水平评估待分析物，则应当证明该分析规程将可靠地这个水平定量待分析物。

对于展示出背景噪音的仪器分析规程，ICH文件描述了一个通用方法，用来比较从以下样品测得的信号，这些样品分别为含已知低浓度被分析物的样品和空白样品。这样就确立了能够可靠地定量待分析物的最低浓度。可接受的典型信噪比是10:1。其他方法取决于校正曲线斜率的测定和响应值的标准差。无论用什么方法，均应该在随后通过分析适当数量的、已知接近或制备于定量限度的样品，来验证定量限度。

线性和范围

线性的定义---- 分析规程的线性是该规程直接地、或通过明确给出的数学转换而间接地，得出与特定范围内的样品中待分析物浓度呈比例关系的测试结果的能力。因此，在此部分，“线性”是指浓度与检验结果之间的线性关系。在某些情况下，为了实现线性，浓度和/或测量数据可以进行转换。（注意：当进行转换时，在回归分析中用到的权重因子可以变化。）虽然其他转换方式也是可以接受的，但是可能的转换包括对数、平方根、倒数。如果无法实现线性，可以使用非线性模型。其目的是得到一个精确描述浓度-响应值关系的模型，不论是线性还是非线性。

范围的定义---- 分析规程的范围是分析物的较高浓度和较低浓度（含）之间的区间，已经证实在此区间内，使用该规程进行测定具有适当水平的精密度、准确度、和线性。该范围通常以与该分析规程得到的测试结果相同的单位表示，例如百分比，百万分率等。

线性和范围的确定---- 应在分析规程整个范围内确立线性。线性的确立最开始应该通过目测代表内容物中待分析物浓度的多个信号构成的图表来进行。如果其呈现线性关系，测试结果应该通过适当的统计学方法（例如，以最小二乘方来计算回归线）来确立。来自回归线自身的数据可以用于提供线性程度的数学评估。应该提交其相关系数、Y轴截距、回归线斜率、残差平方和。

通过用规程分析含有待分析物的、浓度在范围的极限值上和在范围中的样品，确认该分析规程提供了可接受的精密度、准确度、线性，以进行该规程范围的验证。

ICH建议，为了确立线性，通常使用最少五个浓度。其还建议，应考虑下列的最小范围的规定。

原料药（或成药）的含量测定：供试浓度的80%到120%。

杂质的测定：接受标准的50%到120%。

对于内容物的均一性：最少供试浓度的70%到130%，除非由于剂型的特性（例如，定量吸入气雾剂）而支持应用更宽或更适合的范围。

对于溶出度检测：在规定范围上±20%（例如，如果一个控释产品的接受标准覆盖了从1小时后20%到24小时后最多90%的区域，则验证区域应该为标签声称值的0%到110%）。

对于传统的线性概念如：在样本浓度和反应之间的线性或是数学关系的建立，是不适用于粒度分析的。对于粒度分析，浓度范围指的是，在一定的浓度范围内，所测定的粒度分布不受浓度变化的影响。低于规定浓度范围的会由于低信噪比产生错误，高于规定浓度范围的会由于多重散射而产生错误。

 耐用性

定义---- 分析规程的耐用性是规程文件中列出的操作参数在微小、故意的变更中不受影响的能力的衡量单位，并在日常使用中提供了其适用性的指标。耐用性可以在分析规程的研发中确定。

系统适用性

如果检测结果易受分析条件中的差异影响，则这些差异应当被适当地控制，或应当在规程中加入预防性的陈述。评估耐用性的一个结果就是确立一系列系统适用性参数，以确保不论何时使用，均可维持分析规程的有效性。典型的差异是分析溶液、不同设备、不同分析员的稳定性。对于液相色谱法而言，典型的差异是流动相pH值、流动相构成、不同批号或供应商的色谱柱、温度、流速。对于气相色谱法而言，典型差异是不同批号或供应商的色谱柱、温度、流速。

系统适用性测试基于这个概念，即这些设备、电子仪器、分析操作、供试样品构成了一个完整系统，此系统可以作为整体进行评估。为某个特定规程设定的系统适用性测试参数取决于被评估的规程的种类。对于色谱规程，它们尤其重要。向USP提交的文件应该应该注明在通则色谱法<621>中系统适用性章节下的要求。

 验证所需的数据要素

药典测试的要求差别较大，从高度精确的分析测定到特性的主观评估。考虑到此宽幅差异，则可以理解不同测试规程需要不同的验证计划。此章节仅覆盖了这些需要验证数据的测试中最常见的种类。这些种类如下：

第一类：对成药中原料药或活性成分（包括防腐剂）的主要组分进行定量测定的分析规程。

第二类：对成药中原料药或降解物质中杂质进行测定的分析规程。这些规程包括定量测定和限度测定。

第三类：对工作特性（例如，溶出度、药物释放）进行测定的分析规程。

第四类：鉴别测试。

每一个类别均需要不同的分析信息。每个种类通常所需要的数据要素在表2中列出。

表2. 验证必需的数据要素

当验证物理性方法时，应考虑到所有分析规程都需要的相同运行特性参数。以个例为基础，以确定该规程符合预期用途为目标，评估运行特性参数的使用。每种验证参数的特定验收准则应该与此方法的预期用途一致。

         物理性方法也可分成四中验证类别。例如，根据方法学的要求，定量光谱学方法的验证涉及到对第一、二类分析运行特性参数的评估。定性的物理性测量，如：粒度，表面积，体积和夯实密度等都会影响到运行特性参数，常归于第三类。第四类适用于定性鉴别光谱学方法。但是不同的方法用于不同的目的，当将一种类别适用于特别的方法类别时，需要考虑专门的使用方法和要分析的物料的特性参数。

分析规程的有效性可以通过实验室研究来确认。因此，此类研究成功完成的记录文件是确定某个规程是否适用于其预定用途的基本要求。当前的药典规程也要符合相关管理规定，要证实在实际使用条件下的适用性。▲（见药典规程的确认<1226>，以了解与药典规程确认相关的基本原则）▲USP31适当的记录文件应伴随着任何有关新的或修改过的药典分析规程的方案。

Auxiliary Information— Please check for your question in the FAQs before contacting USP. 

Pharmacopeial Forum: Volume No. 35(2) Page 444