关于黑曲霉生产纤维二糖酶发酵条件的研究

关于黑曲霉生产纤维二糖酶发酵条件的研究

孟　勇,王忠彦,苗艳芳,胡　承

(四川大学生命科学院,成都6100)

摘要:作者通过单因子及正交试验,研究了C 源、N 源、磷酸盐及吐温280对纤维二糖酶产量的

影响,并对温度、时间、p H 值和培养基含水量等培养条件进行优化,使黑曲霉生产纤维二糖酶的酶活量由343.l U/g 增至908.2U/g ,提高了165%.关键词:黑曲霉;纤维二糖酶;发酵条件中图分类号:Q 55　　　文献标识码:A

纤维素要完全被酶水解成葡萄糖至少需要3类酶:内切型葡聚糖酶(也称C X 酶,CMC 酶),外切型葡聚

糖酶(也称C 1酶,微晶纤维素酶)和纤维二糖酶(也称β

2葡萄糖苷酶)的协同作用才能完成.纤维素首先在C 1酶和C X 酶的作用下降解成纤维二糖,纤维二糖酶进一步将纤维二糖水解成葡萄糖[1].实际上,纤维素在纤

维素酶解转化生成葡萄糖的过程中,其糖化效率很大程度上取决于纤维素酶系中纤维二糖酶的含量,如果纤维二糖酶的含量低,纤维素酶解的中间产物———纤维二糖会抑制C 1酶和C X 酶的活性,从而降低纤维素的糖化效率.因此增强纤维素酶系中纤维二糖酶的活力,是提高纤维素水解得率和葡萄糖产量的关键措施之一[2].

目前,国内外对微生物产纤维二糖酶的发酵条件研究不多[3].我们通过单因子及正交试验,对产酶培养基及发酵条件进行优化,以期生产出高酶活的纤维二糖酶.

1　料与方法

1.1　材料

1.1.1　菌种　黑曲霉W 28由本实验室分离、保存1

1.1.2　培养基　斜面培养基PDA.基础产酶培养基组成:玉米棒芯70%,麸皮26%,(N H 4)2SO 43%,KH 2PO 40.5%,MgSO 4・7H 2O 0.5%,自来水100%,自然p H 值,121℃灭菌45min.1.2　方法

1.2.1　菌株培养及固态发酵　见文[4].1.2.2　酶活力定义及测定　见文[5].

2　结果及分析

2.1　黑曲霉W 28产酶培养基的优化

2.1.1　碳源对产酶的影响　以玉米棒芯、麸皮、米糠、稻壳及麸皮与玉米棒芯、米糠、稻壳组成的复合碳源替

代基础产酶培养基中的碳源,其它成分不变,接种黑曲霉W 28,30℃下恒温培养4d ,测酶活,结果见表1.

表1　碳源对产酶的影响

碳源(%)麸皮(96)玉米棒芯(96)

米糠(96)稻壳(96)酶活(U/g )305.2

384.3294.2321.4

碳源(%)麸皮(48)+玉米

棒芯(48)

麸皮(48)+米糠(48)

麸皮(48)+稻壳(48)

麸皮(48)+玉米

棒芯(70)

酶活(U/g )

408.2

318.6

324.7

341.8

收稿日期:2001212220

2002年10月第39卷第5期四川大学学报(自然科学版)

Journal of Sichuan University (Natural Science Edition )Oct.2002Vol.39　No.5

　　由表1可知,在几种不同的碳源中,麸皮(48)和玉米棒芯(48)组成的复合碳源产酶的酶活最高,选择麸皮和玉米棒芯组成的复合碳源为最佳碳源.

2.1.2　氮源对产酶的影响　以不同的无机氮和有机氮替代基础产酶培养基中的(N H 4)2SO 4,其它成分不

变,接种黑曲霉W 28,30℃下恒温培养4d ,测酶活,结果见表2.

表2　氮源对产酶的影响

氮源(%)牛肉膏(3)蛋白胨(3)酵母膏(3)尿素(3)酶活(U/g )292.3243.5284.1312.7氮源(%)NH 4Cl (3)NH 4NO 3(3)NaNO 3(3)(NH 4)2SO 4(3)

酶活(U/g )314.5298.7304.6343.2氮源(%)(NH 4)2SO 4(3)+肉膏(0.5)

(NH 4)2SO 4(3)+蛋白胨(0.5)

(NH 4)2SO 4(3)+酵母膏(0.5)

(NH 4)2SO 4(3)+尿素养(0.5)

酶活(U/g )

324.5

334.8

306.2

317.3

　　从表2可知,在几种不同的氮源中,以(N H 4)2SO 4(3)为氮源,效果最佳.因此该菌株培养基中的氮源选择(N H 4)2SO 4.从表2还可以看出:以(N H 4)2SO 4为氮源,且添加部分为有机氮所组成的复合氮源并未促进酶活的提高.分析其原因,一方面,可能因为微生物对氮源的要求不同所致,如桔青霉产生52磷酸二酯酶,其生长和产酶都以有机氮效果为好;黑曲霉生产淀粉酶却倾向无机氮,用盐可使其产酶率显著提高;还有微生物生长和产酶对氮源的要求不同,如有机氮可促进绿色木霉的生长,而铵盐盐却有利于其纤维素酶的合成.另一方面,可能由于麸皮和玉米棒芯含有一定量的有机氮,可以满足微生物对有机氮的生水需要,以麸皮和玉米棒芯为碳源,添加适量(N H 4)2SO 4后已产生有机氮和无机氮的协同作用[6,7].

2.1.3　磷酸盐对产酶的影响　在基础产酶培养基中加入不同量的KH 2PO 4,接种黑曲霉W 28,30℃下恒温培

养4d ,测酶活,结果表见3.由表3可见:一定浓度的磷酸盐可提高纤维二糖酶的产量,培养基含0.75%KH 2PO 4,该菌株产酶活力最高.

表3　磷酸盐对产酶的影响

KH 2PO 4(%)

00.250.500.75 1.00酶活(U/g )

274.3

292.8

345.1

429.5

287.3

2.1.4　土温280对产酶的影响　据文献报道[8],添加0.1%土温280可使纤维二糖酶产量增加8倍,在基础

产酶培养基中加入不同浓度的土温280,其它成分不变,接种黑曲霉W 28,30℃下恒温培养4d ,测酶活,结果表见4.由表4可见:一定浓度的土温280可提高酶活量的.在基础产酶培养基中,加入一定浓度的土温280有助于酶活量的提高.

表4　土温280对产酶的影响

土温280(%)00.050.100.150.20酶活(U/g )

330.5

392.3

487.2

625.8

372.5

2.1.5　正交试验优化培养基　通过上述单因子试验,可以看出碳源、氮源、磷酸盐、土温280对产酶酶活均

有较大的影响.为此,运用正交试验对以上4个因素进行处理,采用L 9(34)正交表(表5).

表5　正交试验因素、水平设计表

因素

A

B

C

D

麸皮(%)+玉米棒芯(%)

(NH 4)2SO 4(%)

KH 2PO 4(%)

土温280(%)

1

26+7020.500.148+48

30.750.15370+26

4

1.0

0.20

　　在基础产酶培养基中,除了改变以上4个因素之外,其它成分不变,接种黑曲霉W 28,30℃下恒温培养4d ,测酶活.按表6安排试验,共做9个试验.由表6可知,R 值的大小依次分别为D ,A ,C 和B ,最好的配方为

9

39第5期孟勇等:关于黑曲霉生产纤维二糖酶发酵条件的研究

B 2

C 2

D 2.但该配方在正交试验中未出现,故须做一次试验予以证实.

按A 3B 2C 2D 2配方,其它成分不变,在上述同样条件下做验证试验,测得酶活为814.3U/g ,说明该配方确实是最佳配方.其配方为:麸皮70%,玉米棒芯26%,(N H 4)2SO 43%,KH 2PO 4,0.75%,土温2800.15%,Mg 2SO 4・7H 2O 0.5%,自来水100%,自然p H 值.

表6　正交试验的安排、结果及分析

因素

A B C D 酶活(U/g )11111262.321222724.531333423.542133524.652211638.262322706.87

3122652.8

83233532.593311712.9

K11410.31439.71682.01613.4K21869.615.21943.22084.1K318.21781.61714.51480.6K1470.1499.9550.7537.8K2623.2631.7693.9694.7K3623.7614.1571.5493.5R

162.6

131.8

143.2

201.2

2.2　发酵条件对产酶的影响

2.2.1　温度产酶的影响　在优化产酶培养基中,接种黑曲霉W 28,放在不同温度(15,20,25,30,35,40,45℃

)的培养箱中,恒温培养4d ,测酶活,结果见图1.由图1可知,黑曲霉W 28产纤维二糖酶的最适培养温度为25～30℃.2.2.2　培养时间产酶的影响　在优化产酶培养基中,接入黑曲霉W 28,30℃下恒温培养.培养时间分别为1,2,3,4,5,6,7,8,9,10d ,测酶活,结果见图2.由图2可知,当培养时间为5d 时,酶活达到最高,随着时间的延

长,酶活逐步降低.因此,产酶的最佳培养时间为

5d.

图2　

培养时间对产酶的影响

图1　温度对产酶的影响0

49四川大学学报(自然科学版)第39卷

3.0,3.5,

4.0,4.5,

5.0,5.5,

6.0,6.5,

7.0,7.5,

8.0)代替自来水,接种黑曲霉W 28,30℃下恒温培养4d ,测

酶活,结果见图3.由图3可知,黑曲霉W 28产纤维二糖酶的最适p H 值为6.0～7.0,考虑到经济成本及操作上的方便,通常采用自然p H 值(6.0～7.0).2.2.4　培养基含水量对产酶的影响　孢子萌发、菌丝生长、酶的形成都需要适宜的水分.因此,控制培养基含水量是固态发酵过程中的重要环节之一,当培养基含水量低时,菌种很快形成孢子,培养基中菌丝稀少酶活力不高;当培养基含水量偏大时,由于供氧及散热条件恶化,菌丝生长缓慢,培养周期延长,产酶效率降低[3].在优化产酶培养基中,加入不同量(90%,100%,110%,120%,130%,140%,150%,160%)的自来水,接种黑曲霉W 28,30℃下恒温培养4d ,测酶活,结果见图4.从图4可以看出,黑曲霉W 28产纤维二糖酶的最适含水量为120%为宜

.

图4　

培养基含水量对产酶的影响

图3　起始p H 值对产酶的影响2.3　结论

通过单因子及正交试验,最终得到黑曲霉W 28产纤维二糖酶最适培养基及培养条件:麸皮70%,玉米棒芯

26%,(N H 4)2SO 43%,KH 2PO 40.75%,土温2800.15%,MgSO 4・7H 2O 0.5%,自来水120%,自然p H 值,30℃下恒温培养5d.按该培养基及培养条件,接种黑曲霉W 28,测得酶活为908.2U/g.

对培养基及培养条件优化后,酶活由原来的343.1U/g 增加到908.2U/g ,提高了1.65倍,优化效果显著.参考文献:

[1]Oguntimein G B ,Moo 2Y oung M.Production and properties of β2glucosidase by Neurospora sitophita[J ].World Journal of Mi 2

crobiology and biotechnology ,1991,7:1-11.

[2]Dekker R F H.K inetics inhibition and stabability properties of a commercial β2glucosidase (cellobiase )preparation from As 2

pergillus niger and its suitability in the hydrolysis of lignocellulose[J ].Biotechnology and bioengineering ,1968,28:1438-1442.[3]孙力军,沈爱光.β2葡萄糖革酶产酶菌株发酵条件的优化研究[J ].安徽农业技术师范学院学报,1995,9(3):1-11.[4]夏黎明.固态发酵生产高活力纤维二糖酶[J ].食品与发酵工业,1999,25(2):1-5.

[5]张海,颜日祥.用混合培养法提高木霉A10的纤维素酶活性[J ].西北大学学报(自然科学版),1991,20(2):73-79.[6]李平,宛晓春,陶文沂,等.黑曲霉生产β2葡萄糖苷酶发酵条件的研究[J ].应用生态学报,1999,10(6):732-734.[7]官家发,李建黔,张发群.芽孢杆菌菌株纤维素酶形成条件的研究[J ].微生物学报,1992,32(6):412-417.

[8]Shewwale J G ,Sadna J C.Cellulase and β2glucosidase production by a basidiomycete species[J ].Can.J.microbial ,1978,24:

1204-1216.

1

49第5期孟勇等:关于黑曲霉生产纤维二糖酶发酵条件的研究

Fermentation Conditions of Cellobiase Production

from Aspergillus niger

M EN G Yong,W A N G Zhong2yan,M IA O Y an2f ang,HU Cheng

(College of Life Sciesce,Sichuan University,Chengdu6100,China)

Abstract:Through signal factor and orthogonal experiments,the effects of carbon source,nitrogen source, phosphate and polysorbate280on cellobiase production were studied.The fermentation conditions(including temperature,time,p H value,water content of medium)were also optimized.Under the optimized conditions, the activity of cellbiase produced from Asp.niger was increased from347.1U/g to908.2U/g.

K ey w ords:Aspergill us niger;cellobiase;fermentation condition