基因工程实验报告(终)华南理工大学

(2011 -2012 学年第一学期)

实验内容：基因工程综合实验

实验时间：2012.10.28-2012.11.2

提交日期： 2012 年 11 月 5 日

大肠杆菌表达包涵体蛋白的基因工程实验以一个目的基因片段的获得，表达和纯化和活性分析为主线，抓住蛋白和核酸两大主题，建立一个综合型和研究性的大实验教学体系，重视各项技术的衔接。综合性实验旨在启迪严谨的科学思维和创新意识，提高对实验方法和实验技术的综合运用能力。具体到每个实验的实验目的如下：

1．掌握SDS碱裂解法小量制备质粒的原理和方法。

2．掌握高速离心机、微量移液器等常规仪器的正确使用。

3. 掌握分光光度法估算样品中DNA的浓度和纯度。

4. 熟悉紫外分光光度计的使用方法。

5．学习掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳的原理和方法及其运用。

6.掌握用CTAB法小量制备大肠杆菌基因组DNA

7.了解基因组DNA的其它提取方法

8.了解酶切原理。

9.掌握酶切体系的建立原则。

10. 熟悉基因工程所用性内切酶的特点。

11.学习掌握外源DNA与质粒载体的重组连接技术

12.掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法及技术。

13.熟练掌握用重组DNA转化感受态细胞的技术，为基因克隆打好基础

14.学习掌握PCR技术的原理及基本操作

15.学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。

16.掌握蛋白质的SDS-PAGE电泳原理和操作技术及应用。

实验流程

质粒的提取

Southern杂交

pcr

抗性菌的筛选

目的基因与质粒的连接

感受态细胞的制备与转化

工程菌的诱导表达

双酶切

PCR

DNA琼脂糖电泳

PCR产物回收

蛋白质的提取分离

SDS-GAGE蛋白质检测

具体每日实验流程

1、 10月28日，利用双酶切，DNA琼脂糖凝胶电泳，胶回收，双酶切目的基因和载体连接过夜。 

2、10月29日下午，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化，涂平板和培养，先正放置半小时，再倒置培养过夜。 

3、10月30日下午，挑阳性（含抗性基因）菌落，菌落PCR，转板和液体培养菌体。 

4、10月31日上午，转接培养，诱导表达，晚上，离心菌体，去上清，冰箱放置保存。

5、11月1日下午，离心菌体，提质粒，跑电泳进行鉴定，培养菌体。 

6、11月2日下午，跑SDS蛋白质电泳 。 

实验技术与方法

    本次实验是多个基因工程基础实验内容的有机整合，交叉进行。从一个基因片段的获得，鉴定，表达和纯化和活性分析为主线，将核酸提取，PCR，RT-PCR，核酸杂交，表达和Western杂交等基因工程实验技术有机整合。

目的基因的扩增：（1）染色体DNA的提取，（2）PCR的引物设计与扩增反应，（3）电泳鉴定；

载体质粒的制备：（1）质粒DNA的提取、纯化，（2）DNA纯度、浓度与分子量的测定，电泳法、紫外线吸收法鉴定；

目的基因与载体的连接（1）目的基因和质粒DNA的性内切酶的酶切反应，（2）载体与目的基因的连接反应：

重组DNA导入宿主细胞：（1）感受态宿主细胞的制备，（2）重组质粒DNA的转化，（3）重组子的选择（抗性基因）以及重组质粒的提取、酶切与电泳鉴定。

Southern杂交（1）染色体DNA的酶切与电泳鉴定（2）DNA的转移，（3）探针DNA的标记（4）杂交和显色。

表达蛋白的工程菌的构建：（1）重组表达质粒的构建，（2）目的基因的诱导表达，（3）表达产物的SDS-PAGE鉴定

Western杂交（1）蛋白质的电泳鉴定（2）蛋白质的的转移，（3）杂交和显色

工程菌发酵培养的优化与表达产物的分离、纯化：（1）发酵条件的优化选择，（2）收集菌体、超声波破碎、分级沉淀，（3）凝胶层析分离、纯化表达产物，SDS-PAGE鉴定表达产物的纯度。

实验结果与分析

PCR目的基因

反应体系：水          31.75    

模板菌液    15    

10*buffer    5    

dNTP        4    

引物1       2    

引物2       2    

酶             0.25

反应条件：94℃预变性5min，

          94℃预变性30s

55℃复性30s，        30circle

72℃延伸1min，

72℃充分延伸7min

4℃ 2h  

30circle

结果与分析：PCR是根据DNA双螺旋结构和其半保留复制的性质产生的：

94℃下变性，AT、GC之间的氢键断裂，目的基因的双螺旋DNA解链成两条单链。

55℃下复性，3’和5’端的引物通过碱基互补配对，结合到单链DNA上。

72℃下延伸，Taq酶在72℃下活性最高，它结合到引物末端，开始利用dNTP合成双链DNA。

因此PCR之后，模板DNA扩增了2^n（循环数）倍，我们得到的是大量扩增的目的基因。

注意：1变性温度一般为94~95度，改变得比较少

     2 复性温度失根据模板DNA的序列而定的，可以通过改变复性温度，提高PCR的准确度。复性温度一般用GC含量估算，但最准确是要用模板的dG（自由能）来算出。

     3 延伸温度是由所用酶的最适温度决定的，Taq酶为72度。

     4 最后一个循环，72度延伸时间要足够长，使DNA充分延伸。

双酶切目的基因与纯化

体系：Nsp V              1ul

      Xho I               1ul

      M buffer（10×）　　5ul

      质粒DNA           10ul （200ng/ul）

      蒸馏水             33ul

反应条件：37℃,2-3h

结果与分析：

ATGTCGTACTACCATCACCATCACCATCACGAAGGAGTTCGAACCATGGCTCGCTTCGCTCTGACTGTTGTCCGGCATGGAGAAACAAGATTTAACAAGGAGAAAATAATCCAAGGACAAGGAGTAGATGAACCTCTTTCAGAAACTGGATTTAAACAAGCAGCAGCTGCTGGTATATTTCTGAATAATGTGAAGTTTACTCATGCTTTCTCCAGTGATCTCATGAGGACAAAGCAGACCATGCATGGAATTTTGGAGAGAAGCAAATTTTGCAAAGATATGACGGTAAAGTATGACTCAAGACTTCGGGAAAGGAAATACGGGGTTGTAGAAGGCAAAGCGCTAAGTGAGCTGAGGGCCATGGCCAAAGCAGCCAGGGAAGAGTGCCCTGTGTTTACACCGCCCGGAGGAGAGACGCTGGACCAGGTGAAAATGCGTGGAATAGACTTTTTTGAATTTCTTTGTCAACTAATCCTGAAAGAAGCGGATCAAAAAGAACAGTTTTCCCAAGGATCTCCAAGCAACTGTCTGGAAACTTCTTTGGCAGAGATATTTCCTTTAGGAAAAAATCACAGCTCTAAAGTTAATTCAGACAGCGGTATTCCAGGATTAGCAGCCAGTGTCTTAGTTGTGAGTCACGGTGCTTACATGAGAAGTCTGTTTGATTATTTTCTGACTGACCTTAAGTGTTCCTTACCAGCCACTCTGAGCAGATCTGAACTTATGTCAGTCACTCCCAATACAGGGATGAGTCTCTTTATCATAAACTTTGAGGAAGGAAGAGAAGTTAAACCAACGGTTCAGTGTATTTGTATGAACCTACAGGATCATCTAAATGGACTGACTGAAACTCGCTAGCTCGAG

两种内切酶：Nsp V，Xho I

以上为目的基因的碱基序列，其中黑体处TCGAA是Nsp V识别的序列，CTCGAG是Xho I识别的序列。

酶切之后，我们得到了带有粘性末端的目的基因，可以与载体进行连接，组成重组质粒，倒入大肠杆菌。

双酶切的优势：双酶切可以防止连接步骤的载体自连，也可以增加目的基因与载体连接成功的几率，也就是能增加连接后，重组载体的数量（浓度），保证转化成功。

琼脂糖电泳

原理：琼脂糖凝胶中，有一定孔径的多孔通道。DNA分子由于带有磷酸基团，因此在电场的作用下依靠稳定的无反应活性的介质（琼脂糖凝胶）和缓冲液（TAE），在电场中能以一定的迁移率从负极移向正极。凝胶包含复杂的孔道网络，DNA分子必须通过这些孔道才能够到达阳极。对于线性DNA，小的DNA分子，在凝胶中迁移的更快。 琼脂糖凝胶的分辨力在0.2～50Kb之间。

溴化乙锭（EB）能够与DNA结合，在300nm的紫外光下，能产生荧光。

步骤：制胶，点样，电泳，染色，观察。

制胶：使用琼脂糖浓度为1%的凝胶，取0.25g琼脂糖，加入25ml TAE配制成。制胶时，把琼脂糖粉和TAE一起加热至固体完全溶解，溶液呈均一透明状。溶液冷却至50℃左右，可以缓慢把溶液倒到制胶盒上，制胶盒上要插着相应大小的梳子。（温度过高倒胶，损坏制胶盒；温度过低，溶液会凝聚，需要重新加热溶解）倒胶过程中不能产生气泡，自然冷却到室温，凝聚成凝胶状。

TAE：工作液 1×

40mM Tris－乙酸

1mM EDTA

点样：先把凝胶放置在电泳槽中，有孔的一段靠近负极；其次向电泳槽中倒入TAE缓冲液至液面浸没凝胶2mm；再把DNA样品和loading buffer按比例混合。（实验中酶切体系中已经加有loading buffer，不必重复添加）用移液向孔加样和marker，加样过程中操作要迅速准确，防止时间过长，DNA在凝胶中扩散。

电泳：120v恒压，电泳30min，至最前DNA超过凝胶的五分之四位置。

染色：把凝胶放置在EB中，染色5-10min。

观察：在300nm的紫外中观察亮带。

结果与分析：

如图上，正方形框内的亮条带是我们酶切后的目的基因

1.对照maker，大小在700~900bp，而我们的目的基因是800bp，因此可以初步判断，亮条带为我们所要的目的基因。

2.而观察亮条带的上下方，都没有其他亮的杂带，证明PCR操作比较成功，没有产生其他非特异性DNA。

3.目的基因条带亮度大，证明DNA的量比较足够；条带清晰，成直线，证明加样操作正确。

凝胶回收

切胶：在300nm紫外下，把所需目的基因的亮条带切下，放入预先称重过的离心管。切胶尽可能小，主要是把亮带切完全就可以了。

凝胶回收按试剂盒说明书的操作进行。

结果：把所需DNA与非特异性DNA、凝胶等分离。获得带有粘性末端的目的基因的溶液。

连接过夜

体系：10×连接buffer      2.5ul

       DNA片段           2ul

      酶切载体           2ul

      T4连接酶           1ul

      蒸馏水             18.5ul

反应条件：16℃ 过夜

结果与分析：用相同的酶进行酶切的载体和目的基因，在T4连接酶的作用下形成重组质粒。载体上有复制子，可以使重组质粒在大肠杆菌内产生大的拷贝数，；有启动子和终止子，控制目的基因的转录；有抗氨苄青霉素的抗性基因，用于筛选；有操纵子，用于诱导目的基因产生蛋白质。

制作感受态

操作：

1．从冻存管取大肠杆菌BL21划LB平板，37℃过夜培养。

2．挑取形态饱满单菌落，接种3ml LB液体培养基，250rpm，37℃ 过夜培养。

3．1:100转接至100ml LB液体培养基，37℃ ，250rpm培养2～3h，测OD600＝0.35～0.4（培养2.5小时后开始取液测OD，每10min测一次，直至OD＝0.4，立即停止培养）.

4．冰上预冷1个2ml EP管，取菌至EP管，每管取1.5ml菌液，冰上放置10min。

5．4000rpm， 4℃，离心10min。

6．小心倒掉上清，将管倒置纸巾上1min流尽残液。

7．每管加入500μl预冷的0.1M  CaCl2-MgCl2重悬细胞沉淀，转移到一个冰预冷的2ml离心管中，冰浴10min。

8．离心，4℃ 4000rpm 5min，小心倒掉上清，将管倒置纸巾上1min流尽残液。

9．每管加100μl 冰预冷的0.1M CaCL2重悬菌体。

结果与分析：

1.感受态细胞是指经过适当处理后容易接受外来DNA进入的细胞。如大肠杆菌经CaCl2处理，就成为容易受质粒DNA转化的细胞。

2.通过钙离子和低温低渗条件处理：细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来。大肠杆菌的细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物，成为感受态细胞。

转化

1．向制备好的100ul感受态大肠杆菌中加入连接产物10ul，轻轻吹打以混合内容物，冰上放置30分钟。

2．将管放入42℃水浴中，恰好90s.（准确计时）

3．快速将管转移到冰浴中，冷却2 min。

4．每管加入200μl LB培养基，（预先加热培养基至37℃），然后将管转移到摇床上100rpm轻柔摇动，45min。

5．将菌液用移液器轻轻吹打均匀. 将适当体积（一个平板150μl，一个250ul）已转化的细胞转移到含有 氨苄青霉素的LB培养基 平板上，注意平行实验设对照平板一块。

6．将平板置于室温直至液体被吸收。

7．倒置平板，37℃培养过夜，观察菌落。

注意事项：

1.热击时间要准确计时，时间过短转化不成功，时间过长，细菌会死亡。

2.涂布平板时要均匀，是细菌充分分散。要保证无菌操作，防止引入杂菌；涂布时，玻璃棒要先冷却，防止高温杀死转化细菌。

结果与分析：

150ul的得到如下菌落。

加入氨苄青霉素的平板，起到初步筛选的作用。转化没有成功的细菌，没有抗性，在抗生素的作用下不能生长，因此在平板上生长的理论上都是转化成功的细菌。生长的菌落有大有小，大的单菌落证明生长繁殖能力强，也一定程度反映了重组质粒在该细菌中拷贝数较大，抗性较大。

挑菌

操作：用干净的头在所要挑取的单菌落上，轻轻一划，转接到又LB培养基的离心中和PCR中，用于扩大培养和作为PCR模板。

注意：挑取大的，与其他菌落相对较远的大肠杆菌。如上图用红圈内的单菌落。

菌落pcr

结果与分析：结果如上图。菌落PCR中，所用的引物和酶和前面的一样。按照pcr的原理，如果有目的基因的模板，应该能扩增出目的基因。而结果红色框内有出现800bp左右的条带，而且亮度大，基本没有其他杂带；正好目的基因也是800bp左右，因此可以证明挑取的单菌落就是转化成功，带有目的基因和重组质粒的细菌。条带的亮度，一定程度反应细菌中质粒的数量，我们可以选取亮度大的单菌落进行扩大培养和诱导蛋白产物。

扩大培养

把单菌落接种到有LB培养液的离心管中，37℃培养。

分析：把质粒数较多的细菌扩大培养，为后续的诱导蛋白质和菌种保藏奠定基础。

包涵体蛋白的诱导表达

培养条件：向2个装有30mlLB培养基的锥形瓶中分别3ul 50mg/ml的氨苄青霉、150μl菌液，做好标记（诱导、未诱导）放上摇床，250rpm，37℃培养4小时，再向标有诱导的锥形瓶中加入IPTG液，放上摇床，250rpm，37℃培养6小时后2瓶菌液分别取ml离心，去上清液待用

结果：在加入卡那霉素素的培养基中，菌体能够正常生长。证明菌体含有氨苄青霉素抗性基因，即是导入了重组质粒的重组子。

目的基因的鉴定（提取质粒进行琼脂糖凝胶电泳电泳） 

双酶切体系：Nsp V              1ul

             Xho I               1ul

             M buffer（10×）　　5ul

             质粒DNA            10ul （200ng/ul）

             蒸馏水              33ul     

结果：

此为从破壁菌体中提取到得质粒（酶切前）及经过双酶切处理的质粒，以及marker（含长度为1kb、2kb、3kb等的DNA片段）的琼脂糖凝胶电泳在紫外光下显现的条带。

将marker的条带与标准条带对照可以找到marker中1kb长度的DNA片段的位置，而实验所导入的目的基因长度为858bp，因此应该比1kb的样品跑得稍快，即应当出现在图中的B区域附近。而实际结果中，B区域附近看不到条带，造成这个结果的原因可能有：①双酶切时加入的酶太少或者添加其他试剂的量有误，使得目的基因未能被切下来；②电泳不充分，目的基因的条带与RNA的条带（即图中的A区域）混在一起了，导致观察不到目的基因的条带；③破壁提取质粒时质粒被破或者是在PCR时出现问题（如引物加错等），目的基因未得到扩增。

目标蛋白表达的检测（蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）（周五）

操作：用10000rpm的离心将细胞中全蛋白离心出来，再点样。

结果与分析：

  此为从未加IPTG液诱导的菌液、加入IPTG液诱导的菌液中提取到的全蛋白样品，以及他们稀释3倍后得到的样品、以及marker经考马斯亮蓝染色后经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后产生的条带。

  经过IPTG液诱导的菌液应当会大量表达相应的蛋白（大小为285Aa）。而由图中经过诱导（稀释3倍）的样品的条带中，A区域明显亮于其他区域，并且其位置亦与marker中B区域的条带相对应。说明了经IPTG液诱导的菌体中目标蛋白得到较好的表达。而未诱导的菌体的条带应当不存在与A对应的条带，或是条带很浅。但实际结果未诱导（稀释3倍）的条带颜色整体比较深，这有可能是由于在稀释未诱导与诱导的样品时，在吸取原浓度样品前未将其摇匀，以至于造成2者浓度差异较大。

实验总结操作与结果得失，改进建议

通过10月28日到11月2日整整一周的时间，我们基本上完成了一个完整的基因工程实验。虽然这一周都没睡好，实验所需的时间也比较长，但每当看到自己实验出结果的时候，心里还是挺高兴的。

这是一个构建基因工程菌的综合实验，每一个小的步骤都会直接或间接影响到最终的结果。你可能是连接不成功，酶切可能没切好，或者酶切后跑电泳时因为莫名问题而看不到预期结果。尤其是在制备感受态细胞的时候，更要特别注意把握每一步操作，因为你一丁点的失误都将导致后面转化的失败。加强无菌操作意识，杜绝一切可能导致染菌的违规操作。另一方面，为了避免一失足成千古恨，我们最好在关键的步骤“备份”一下，以防后面步骤出问题了，实验失败需重头开始。

以严谨，认真的科研精神去对待实验的每一步。同时加强自己对实验的思考也是不容忽视的，我们要弄清每个实验的目的及原理是什么，对于每一步所加的试剂作用是什么。因为只有知道全部后，我们才会懂得实验中自己要做什么，要怎么做，为什么这样做，有没有别的方法，才能真正培养我们对于实验的兴趣，学习到实验的方法达到教学实验的目的。