实验一 腐乳产蛋白酶菌株的筛选1

一、实验目的与要求

了解涂布分离和平板划线法从食物中分离食源性微生物的原理和方法，并熟练掌握该操作方法。

二、实验原理

微生物是蛋白酶的最佳来源，与动物和植物相比，微生物作为蛋白酶的来源具有更多生理生化上的优越性。微生物来源的蛋白酶都是胞外酶，易于分离纯化，更重要的是微生物易于培养和发酵，有广泛的生物化学多样性和遗传操作的感受性。

通过稀释涂布法或划线分离法在选择性平板上可以对产蛋白酶菌株进行分离。稀释涂布平板法是一种将菌体按比例制备成若干个稀释度，再分别经涂棒涂布培养而进行微生物分离纯化的方法；平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的“纯种”。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。

根据透明圈的大小来筛选目的菌株，透明圈越大的菌具有较强的产酶能力。对分离到的菌株进行纯化，得到高产蛋白酶菌株。

三、试验材料

1、材料与试剂

豆腐乳：市购豆腐乳

2、主要仪器与设备

无菌操作箱、恒温水浴锅、生化培养箱、高压灭菌锅、振荡培养箱

四、实验步骤与方法

1、培养基的制备

可溶性淀粉1%、酵母膏0.5%、酪蛋白1%、KH2PO40.1%、MgSO40.02%、琼脂2.0%，pH值为中性

配制方法：称取酪蛋白1.0g，先用少量2%NaOH润湿，玻棒搅动，再加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热并搅拌，至完全溶解，补足水量至100mL，加入其他成分，调整pH，灭菌备用。

2、菌株纯化分离（涂布法和划线法每组选一种方法进行操作）

（1）稀释法分离：采用无菌水，10倍梯度稀释豆腐乳的菌悬液到10-8，吸取10-6到10-8梯度（按照这三个梯度涂布，前两个组基本都没有菌生长，是否后面的实验考虑用较高浓度的梯度涂布？）的菌悬液各1mL，注入初筛培养基平板中，每个梯度做2个平行平板，涂布均匀。将涂布后的平板置于28℃的恒温培养箱中培养48h。

（2）划线分离：对豆腐乳菌悬液（取1mL豆腐乳汁加入10mL无菌水制成）划线分离，制作两个划线分离平板，将平板置于28℃的恒温培养箱中培养48h。

五、思考题

1平板培养时为什么要把培养皿要倒置？

2划线分离时，为什么每次都需将接种环上剩余物烧掉？

实验二 蛋白酶菌株的纯化

一、实验目的与要求

通过对分离后的菌株进行斜面接种培养，掌握微生物斜面接种技术方法，并对产蛋白酶菌株实现一定的纯化目标。

二、实验原理

   微生物能够在合适的培养基上生长。斜面接种法就是用灼烧、灭菌后的接种环，从菌种管中挑取少许菌苔，以无菌操作转移至新鲜斜面培养基上，自斜面底部开始向上做“Z”状致密平行划线的 操作过程。

三、实验材料

1、材料与试剂

平板分离所得的菌株

2、主要仪器与设备

无菌操作箱、恒温水浴锅、生化培养箱、高压灭菌锅，接种环，酒精灯。

四、实验步骤与方法

 1、培养基的制备

牛肉膏蛋白胨斜面培养基：牛肉膏0.3g蛋白胨1g氯化钠0.5g琼脂2g加水至100mlpH7.0-7.2  

2、菌种纯化

挑选透明圈小而沉淀圈大的1—3株菌株，接入牛肉膏蛋白胨斜面培养基,分别编号, 在温度28℃下培养48h。

五、思考题

接种环从平板移至待接种斜面过程中，需要注意哪些事项？

实验三 蛋白酶菌株的初筛

一、实验目的与要求

了解初筛的原理和方法，通过初筛除去斜面培养后不符合要求的大部分菌株，保留符合要求的生产性状的菌株和优良菌株。

二、实验原理

筛选的手段必需配合不同筛选阶段的要求，对于初筛，要力求快速、简便。一般是在固体培养基平板上通过观察菌株的生理效应范围（透明圈、变色圈、生长圈和抑制圈）进行初筛测定的。

透明圈法：在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就会形成透明圈，透明圈的大小反映了菌落利用此物质的能力。 在培养基中掺入可溶性淀粉、酪素或CaCO3可以分别用于检测菌株产淀粉酶、产蛋白酶或产酸能力的大小。

三、实验材料

1、材料与试剂

斜面培养所得的菌株

2、主要仪器与设备

无菌操作箱、恒温水浴锅、生化培养箱、高压灭菌锅，接种环，酒精灯

四、实验步骤与方法

 1、培养基的制备

牛肉膏豆粕浸汁培养基：牛肉膏0.5%、豆粕汁（称取100g豆粕粉煮沸经4层纱布过滤）、NaCl 0.5%、琼脂2.0%、pH值7.2

2、初筛：将斜面菌种接种于牛肉膏豆粕浸汁固体培养基中，在温度28℃下培养48h。对分离到的菌株进行简单的鉴定，通过革兰氏染色法和显微镜镜检描述细胞形态，并对菌落进行记录。挑选透明圈大而沉淀圈小的菌株，并测量透明圈的直径，作为筛选菌株。

五、思考题

1、透明圈法筛选产蛋白酶菌株的依据是什么？

2、如果初筛的透明圈不明显或者透明圈太小，可能的原因是什么？

实验四 蛋白酶菌株的复筛

一、实验目的与要求

学习和掌握微生物菌株复筛的原理和液体发酵技术

二、实验原理

不同类型的蛋白酶都能在含有蛋白质基质的平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体中的相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是蛋白酶的高产菌株。复筛是指将初筛得到的较优菌株再进行多次摇瓶实验验证其效价和传代稳定性，并从中得到一两个或少数几个最优的菌株。复筛不仅要将初筛得到的菌种进行再次发酵验证，还需要进行传代验证，就是传很多代，每代或隔代进行发酵验证，看其稳定性。

三、实验材料

1、材料与试剂

初筛培养基上所得的菌株

2、主要仪器与设备

无菌操作箱、恒温水浴锅、振荡培养箱、高压灭菌锅，接种环，酒精灯

四、实验步骤与方法

1、培养基的制备

液体种子培养基：牛肉膏0.3%、蛋白胨1.%、NaCl0.5%、葡萄糖1%、pH值7.2

2、复筛

将筛选出来的产蛋白酶活力最高的1—2株菌种接种于100mL种子培养基在温度28℃下培养12h。

实验五 蛋白酶菌株的摇瓶发酵

一、实验目的与要求

掌握酶的发酵生产方式之一微生物发酵产酶。

学习和掌握微生物的摇瓶发酵技术。

二、实验原理

微生物发酵法是实际生产中制取酶制剂的主要方法。在进行大规模液体深层发酵生产酶制剂之前，必须首先在实验室对保藏的菌株进行活化和扩大培养，制得生产种子，摇瓶发酵是发酵菌种小试以及扩培的一种方式。扩大培养多采用摇瓶培养，即在锥形瓶中加入一定量的液体培养基，在摇床上以一定转速摇动进行恒温培养。

三、实验材料

1、材料与试剂

复筛培养基上所得的菌株

2、主要仪器与设备

无菌操作箱、恒温水浴锅、振荡培养箱、高压灭菌锅，接种环，酒精灯

四、实验步骤与方法

1、培养基的制备

液体发酵培养基：蔗糖1%、大豆浓缩蛋白4%、NaCl0.5%、pH值为自然

2、摇瓶发酵

把种子培养液按4%的接种量即4mL接种于复筛发酵培养基（250ml的三角瓶每瓶装100mL培养基）中摇瓶发酵24h，测其蛋白酶活力。

实验六 蛋白酶活力的测定

蛋白酶能水解蛋白质为氨基酸。其制剂广泛应用于发酵食品、皮革脱毛、丝绸脱胶、医药生产中。蛋白酶按其作用pH值不同分为碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶等。其活力测定方法基本相同，区别仅在于作用的pH不同。

一、实验目的与要求

掌握蛋白酶活力测定的原理和方法，了解发酵液的评价指标。

二、实验原理

蛋白酶活力检测(紫外分光光度测定法)  蛋白质或多肽在275nm波段处具有最大吸收值，利用蛋白酶同酪蛋白底物反应前后在三氯乙酸中可溶物的紫外吸收增值，可表示蛋白酶活力高低。

三、实验材料

1、材料与试剂

摇瓶发酵所得的菌株

2、实验仪器与设备

紫外分光光度计、水浴锅

试剂：

1、0.05mol／l硼酸缓冲液(pH8.0)(释释发酵液用)：

0.05mol／L硼砂(Na2B4O7·10H2O)溶液：硼砂1.907g，蒸馏水100mL。    

0.2硼酸(H3BO3)溶液：硼酸1.237g，蒸馏水100mL。

3mL 0.05mol／L硼砂溶液与7mL 0.2mol／L硼酸溶液混匀，即为硼酸缓冲液。

2、0.4mol／L三氯乙酸溶液（称取三氯醋酸6.54g，定容至100ml）、

3、0.6％酪蛋白溶液：称取酪蛋白0.6g，先用少量2%NaOH润湿，玻棒搅动，再加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热并搅拌，至完全溶解，用0.05mol／L硼酸缓冲液定容至100ml。

4、标准酪氨酸溶液（100µg/ml）：准确称取0.1克DL-酪氨酸，加入少量0.2mol/L盐酸溶液（取1.7ml浓盐酸用水稀释至100ml），加热溶解，用水定容至1000ml。每毫升含DL-酪氨酸100微克。

四、实验步骤

1、酪氨酸标准曲线的绘制

按表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液

2、蛋白酶活力测定

粗酶液制备：用2 层纱布过滤摇瓶发酵液，4500 rpm 离心15 min，取上清液（粗酶液）测蛋白酶活力。

a．取5mL用pH 8.0硼酸缓冲液制备的0.6％酪蛋白溶液于试管中，40℃预热2min后加以pH8硼酸缓冲液稀释的酶液(即取l mL蛋白酶摇瓶发酵液，加19mL缓冲液) l mL，40℃准确反应10min后，立即加5mL0.4mol／L三氯乙酸以终止反应，沉淀残余底物，40℃保温20min，使沉淀完全，用漏斗加滤纸过滤，滤液用紫外分光光度计测定275nm的光密度。

b．另以先加三氯乙酸使酶失活、后加酪蛋白的试管，按上述同样步骤测定光密度，作为空白对照。    

   3、酶活力定义：以lmin内由酪蛋白释出的三氯乙酸可溶物在275nm的光密度与1μg  酪氨酸相当时，其所需要的酶量为1个单位。

    酶活力(U／mL)＝O.D(酶)×n／10×O.D(酪)

式中：10＝反应时间10min；O.D(酪)=lμg／mL的光密度；n=酶液稀释倍数。

五、思考题

实验中的酶活力检测是否出现负结果?如有，请分析原因?