四价流感病毒鸡胚尿囊液纯化工艺、四价流感病毒裂解疫苗及其制备

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011613220.3

(22)申请日 2020.12.29

(71)申请人 深圳康泰生物制品股份有限公司

地址 518000 广东省深圳市南山区科技工

业园科发路6号

(72)发明人 刘鹏　钟礼军　贾维　胡文超　

罗丹　喻浠明　

(74)专利代理机构 深圳市行一知识产权代理事

务所(特殊普通合伙) 44453

代理人 杨贤

(51)Int.Cl.

A61K 39/145(2006.01)

A61K 39/295(2006.01)

A61P 31/16(2006.01)

C07K 14/11(2006.01)

C07K 1/34(2006.01)

(54)发明名称

四价流感病毒鸡胚尿囊液纯化工艺、

四价流感病毒裂解疫苗及其制备方法

(57)摘要

本发明实施例提供了一种四价流感病毒裂

解疫苗鸡胚尿囊液纯化工艺、四价流感病毒裂解

疫苗制备方法及相关产品。所述纯化工艺包括如

下步骤：1)40μm滤芯过滤澄清；2)碟式离心机离

心；3)超滤浓缩；4)区带离心；5)超滤除糖；6)层

析纯化；7)病毒裂解灭活；8)超滤纯化(除裂解剂

与灭活剂)；9)除菌过滤得到单价原液。实施本发

明，可具有更高的抗原回收率和更高纯度的血凝

素抗原，更低的卵清蛋白含量，更低的杂蛋白含

量，

提高了鸡胚流感疫苗产率和有效率。权利要求书1页 说明书4页CN 112704733 A 2021.04.27

C N 112704733

A

1.一种四价流感病毒鸡胚尿囊液纯化工艺，其特征在于，包括如下步骤：

过滤澄清：收获鸡胚尿囊液，加入终浓度为0.125mol/L的柠檬酸钠溶液充分混匀后，经过40μm滤芯过滤；

碟式离心：对过滤后的鸡胚尿囊液经过蝶式离心机进行连续流离心，收集上清液；对所述上清液进行超滤浓缩、区带离心、超滤除糖、层析纯化，得到纯化液；

病毒裂解灭活：在所述纯化液中加入病毒裂解剂裂解后，加入灭活剂进行灭活；

超滤纯化：对灭活液进行超滤洗滤，去除灭活剂和裂解剂，除菌过滤后，即得到单价原液。

2.如权利要求1所述的四价流感病毒鸡胚尿囊液纯化工艺，其特征在于在所述碟式离心步骤中，碟式离心机转速控制在8500～9000rpm，上样速度控制在70～150L/h。

3.如权利要求2所述的四价流感病毒裂解疫苗鸡胚尿囊液纯化工艺，

其特征在于，所述区带离心具体包括：

先采用蔗糖密度梯度离心法，在2000rpm时以50ml/min的流速从边孔依次泵入100ml pH7.4磷酸盐缓冲液、600ml超滤浓缩液、500ml 30％蔗糖溶液、470ml 55％蔗糖溶液，上样完成后30000rpm，4℃离心180min，然后从边孔进58％蔗糖溶液，期间通过监测紫外波长和蔗糖浓度来收取离心纯化液。

4.如权利要求3所述的四价流感病毒鸡胚尿囊液纯化工艺，其特征在于，所述超滤除糖具体包括：

采用300KD超滤膜包超滤除糖后，0～3倍浓缩后用pH7.4磷酸盐缓冲液8～10倍体积洗滤；控制蛋白质含量在3000～4000μg/ml。

5.如权利要求3所述的四价流感病毒鸡胚尿囊液纯化工艺，其特征在于，所述层析纯化具体包括：

以4FF凝胶为介质，pH7.4磷酸盐缓冲液平衡后，上样流速48～55cm/h，上样2个柱体积，继续用pH7.4磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱速度48～55cm/h，收集UV280洗脱峰，得到层析纯化液。

6.如权利要求3所述的四价流感病毒鸡胚尿囊液纯化工艺，其特征在于，所述超滤浓缩具体包括：

上清液采用300KD超滤膜包进行30～50倍超滤浓缩，然后10倍体积洗滤。

7.如权利要求3所述的四价流感病毒鸡胚尿囊液纯化工艺，其特征在于，所述超滤纯化具体包括：

灭活液采用30KD超滤膜包进行6～10倍超滤洗滤，去除裂解剂与灭活剂。

8.如权利要求3所述的四价流感病毒鸡胚尿囊液纯化工艺，其特征在于，所述病毒裂解灭活步骤中：

所述裂解剂为终浓度为0.5％的Triton X ‑100，裂解条件为置于2～8℃摇床中裂解1小时；

所述灭活剂为终浓度200μg的甲醛，灭活条件为室温下灭活60～72小时。

9.一种四价流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于，采用如权利要求1‑9中任一项所述的四价流感病毒鸡胚尿囊液纯化工艺。

10.一种四价流感病毒裂解疫苗，其特征在于，通过如权利要求9所述的方法制备得到。

权　利　要　求　书1/1页CN 112704733 A

及其制备方法

技术领域

[0001]本发明涉及流感疫苗技术领域，尤其涉及一种四价流感病毒裂解疫苗鸡胚尿囊液纯化工艺、四价流感病毒裂解疫苗及其制备方法。

背景技术

[0002]四价流感病毒裂解疫苗基本都是通过鸡胚增殖培养制备。在鸡胚中增殖培养病毒，收获鸡胚尿囊液后，对其进行纯化，获得单价原液，混配得到四价流感病毒裂解疫苗。现有技术中，四价流感病毒鸡皮尿囊液的纯化工艺通常包括澄清、灭活、超滤浓缩、裂解、离心纯化和层析纯化、过滤除菌步骤。采用现有的四价流感病毒鸡胚尿囊液纯化工艺，可得到基本符合药典要求的四价流感病毒裂解疫苗的单价原液。

发明内容

[0003]本发明所要解决的技术问题是，提供一种四价流感病毒裂解疫苗鸡胚尿囊液纯化工艺、以实现具有更高的抗原回收率和更高纯度的血凝素抗原，更低的卵清蛋白含量,更低的杂蛋白含量，提高鸡胚流感疫苗产率和有效率。

[0004]为解决上述技术问题，本发明公开了以下技术方案：

[0005]一种四价流感病毒裂解疫苗鸡胚尿囊液纯化工艺，其特征在于，包括如下步骤：[0006]过滤澄清：收获鸡胚尿囊液，加入终浓度为0.125mol/L的柠檬酸钠溶液充分混匀后，经过40μm滤芯过滤；

[0007]碟式离心：对过滤后的鸡胚尿囊液经过蝶式离心机进行连续流离心，收集上清液；[0008]对所述上清液进行超滤浓缩、区带离心、超滤除糖、层析纯化，得到纯化液；[0009]病毒裂解灭活：在所述纯化液中加入病毒裂解剂裂解后，加入灭活剂进行灭活；[0010]超滤纯化：对灭活液进行超滤洗滤，去除灭活剂和裂解剂，除菌过滤后，即得到单价原液。

[0011]作为一些可能的实施方式，在所述碟式离心步骤中，碟式离心机转速控制8500～9000rpm，上样速度控制在70～150L/h。

[0012]作为一些可能的实施方式，所述区带离心具体包括：

[0013]先采用蔗糖密度梯度离心法，在2000rpm时以50ml/min的流速从边孔依次泵入100ml pH7.4磷酸盐缓冲液、600ml超滤浓缩液、500ml 30％蔗糖溶液、470ml 55％蔗糖溶液，上样完成后30000rpm，4℃离心180min，然后从边孔进58％蔗糖溶液，期间通过监测紫外波长和蔗糖浓度来收取离心纯化液。

[0014]作为一些可能的实施方式，所述超滤除糖具体包括：

[0015]采用300KD超滤膜包超滤除糖后，0～3倍浓缩后用pH7.4磷酸盐缓冲液8～10倍体积洗滤；控制蛋白质含量在3000～4000μg/ml。

[0016]作为一些可能的实施方式，所述层析纯化具体包括：[0017]以4FF凝胶为介质，pH7.4磷酸盐缓冲液平衡后，上样流速48～55cm/h，上样2个柱体积，继续用pH7.4磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱速度48～55cm/h，收集UV280洗脱峰，得到层析纯化液。

[0018]作为一些可能的实施方式，所述超滤浓缩具体包括：

[0019]上清液采用300KD超滤膜包进行30～50倍超滤浓缩,然后10倍体积洗滤。[0020]作为一些可能的实施方式，所述超滤纯化具体包括：

[0021]灭活液采用30KD超滤膜包进行6～10倍超滤洗滤，去除裂解剂与灭活剂。[0022]作为一些可能的实施方式，所述病毒裂解灭活步骤中：

[0023]所述裂解剂为终浓度为0.5％的Triton X‑100，裂解条件为置于2～8℃摇床中裂解1小时；

[0024]所述灭活剂为终浓度200μg的甲醛，灭活条件为室温下灭活60～72小时。[0025]相应地，本发明还公开了一种四价流感病毒裂解疫苗的制备方法，采用如上所述的四价流感病毒裂解疫苗鸡胚尿囊液纯化工艺。

[0026]相应地，本发明还公开了一种四价流感病毒疫苗，通过上述方法制备得到。[0027]本发明的有益效果是：

[0028]本发明实施例通过采用1)40μm滤芯过滤澄清；2)碟式离心机离心；3)超滤浓缩；4)区带离心；5)超滤除糖；6)层析纯化；7)病毒裂解灭活；8)超滤纯化(除裂解剂与灭活剂)；9)除菌过滤得到单价原液的技术方案，利用了一步层析两步离心三步超滤工艺制备四价流感病毒裂解疫苗的单价原液，从而达到了具有更高的抗原回收率和更高纯度的血凝素抗原，更低的卵清蛋白含量,更低的杂蛋白含量，提高了鸡胚流感疫苗产率和有效率的技术效果。

具体实施方式

[0029]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合具体的实施例对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

[0030]本发明提供的四价流感病毒鸡胚尿囊液纯化方法一个实施例包括如下步骤：[0031]过滤澄清：收获鸡胚尿囊液，加入终浓度为0.125mol/L的柠檬酸钠溶液充分混匀后，经过40μm滤芯过滤；

[0032]碟式离心：对过滤后的鸡胚尿囊液经过蝶式离心机进行连续流离心，收集上清液；[0033]对所述上清液进行超滤浓缩、区带离心、超滤除糖、层析纯化，得到纯化液；[0034]病毒裂解灭活：在所述纯化液中加入病毒裂解剂裂解后，加入灭活剂进行灭活；[0035]超滤纯化：对灭活液进行超滤洗滤，去除灭活剂和裂解剂，除菌过滤后，即得到单价原液。

[0036]作为一些可能的实施方式，在所述碟式离心步骤中，碟式离心机转速控制8500～9000rpm，上样速度控制在70～150L/h。

[0037]作为一些可能的实施方式，所述区带离心具体包括：

[0038]先采用蔗糖密度梯度离心法，在2000rpm时以50ml/min的流速从边孔依次泵入100ml pH7.4磷酸盐缓冲液、600ml超滤浓缩液、500ml 30％蔗糖溶液、470ml 55％蔗糖溶液，上样完成后30000rpm，4℃离心180min，然后从边孔进58％蔗糖溶液，期间通过监测紫外波长和蔗糖浓度来收取离心纯化液。

[0039]作为一些可能的实施方式，所述超滤除糖具体包括：

[0040]采用300KD超滤膜包超滤除糖后，0～3倍浓缩后用pH7.4磷酸盐缓冲液8～10倍体积洗滤；控制蛋白质含量在3000～4000μg/ml。

[0041]作为一些可能的实施方式，所述层析纯化具体包括：

[0042]以4FF凝胶为介质，pH7.4磷酸盐缓冲液平衡后，上样流速48～55cm/h，上样2个柱体积，继续用pH7.4磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱速度48～55cm/h，收集UV280洗脱峰，得到层析纯化液。

[0043]作为一些可能的实施方式，所述超滤浓缩具体包括：

[0044]上清液采用300KD超滤膜包进行30～50倍超滤浓缩,然后10倍体积洗滤。[0045]作为一些可能的实施方式，所述超滤纯化具体包括：

[0046]灭活液采用30KD超滤膜包进行6～10倍超滤洗滤，去除裂解剂与灭活剂。[0047]作为一些可能的实施方式，所述病毒裂解灭活步骤中：

[0048]所述裂解剂为终浓度为0.5％的Triton X‑100，裂解条件为置于2～8℃摇床中裂解1小时；

[0049]所述灭活剂为终浓度200μg的甲醛，灭活条件为室温下灭活60～72小时。[0050]本发明实施例提供的四价流感病毒裂解疫苗的制备方法，其鸡胚尿囊液纯化工艺可其采用如前述实施例所述的四价流感病毒裂解疫苗鸡胚尿囊液纯化工艺，其余工艺可与现有技术基本相同。

[0051]本发明实施例提供的四价流感病毒裂解疫苗，可通过前述实施例所述的制备方法制备得到。

[0052]为了更进一步阐释本实施例为达成预定发明目的所采取的的技术手段和效果，对本实施例的四价流感病毒裂解疫苗鸡胚尿囊液纯化工艺的具体步骤，通过实例数据详细说明如下。

[0053]实施例

[0054]过滤澄清：收获鸡胚尿囊液，加入终浓度为0.125mol/L柠檬酸钠溶液充分混匀后，经过40μm滤芯过滤；

[0055]碟式离心机离心：碟式离心机转速8500～9000rpm，上样速度70～150L/h，连续流离心，根据实际情况进行排渣，收集上清液；

[0056]超滤浓缩：上清液采用300KD超滤膜包进行30～50倍超滤浓缩,然后10倍体积洗滤；

[0057]区带离心：先采用蔗糖密度梯度离心法，在2000rpm时以50ml/min的流速从边孔依次泵入100ml pH7.4磷酸盐缓冲液、600ml超滤浓缩液、500ml 30％蔗糖溶液、470ml 55％蔗糖溶液，上样完成后30000rpm，4℃离心180min，然后从边孔进58％蔗糖溶液，期间通过监测紫外波长和蔗糖浓度来收取离心纯化液；

[0058]超滤除糖：采用300KD超滤膜包超滤除糖后，0～3倍浓缩后用pH7.4磷酸盐缓冲液8～10倍体积洗滤；超滤除糖液取样进行蛋白质含量检测，控制蛋白质含量在3000～4000μg/ ml；层析纯化：介质为4FF凝胶，pH7.4磷酸盐缓冲液平衡后，上样流速48～55cm/h，上样2个柱体积，继续用pH7.4磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱速度48～55cm/h，收集UV280洗脱峰，得到层析纯化液；

[0059]病毒裂解灭活：病毒纯化液加入裂解剂Triton X‑100进行病毒裂解,添加终浓度为0.5％Triton X‑100，置于2～8℃摇床中裂解1小时；添加终浓度200μg甲醛，室温下灭活60～72h，取样做灭活试验，同时制备电镜样品进行电镜检测；

[0060]超滤纯化(除裂解剂与灭活剂)：灭活液采用30KD超滤膜包进行6～10倍超滤洗滤，去除裂解剂与灭活剂。

[0061]除菌过滤：超滤纯化液经过0.2μm除菌滤器过滤后得到单价原液。

[0062]表1、血凝滴度/血凝素回收率

[0063]

[00]

[0065]表2、杂蛋白去除率

[0066]工艺步骤批次1批次2批次3

澄清N/A36.09％35.14％

超滤浓缩51.70％41.10％58.48％

离心除糖98.10％98.80％97.26％

层析纯化21.10％45.10％56.00％

[0067]表3、卵清蛋白去除率

[0068]工艺步骤批次1批次2批次3

超滤浓缩N/A99.90％N/A

离心除糖99.90％95.50％100.00％

层析纯化93.60％96.60％98.91％

总去除率93.51％92.16％98.91％

[0069]本发明利用经过一步层析两步离心三步超滤工艺制备的四价流感病毒裂解疫苗单价原液具有更高的抗原回收率和更高纯度的血凝素抗原，更低的卵清蛋白含量,更低的杂蛋白含量，提高了鸡胚流感疫苗产率和有效率。

[0070]以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。