大肠杆菌原核表达载体pSBET_His的构建

陈正斌1,2,谭仲夏13,秦西云1　(1.云南省烟草科学研究所,云南玉溪653100;2.云南农业大学植物保护学院,云南昆明650201)摘要　为了构建原核表达载体pS BET2H is。pS BET a质粒经Xba I和Bam H I性内切酶双酶切,获得原核表达载体的骨架。以pET28a (+)为模板,通过高保真PCR法应用T7prom oter引物和T7term inator引物对pET28a(+)载体T7表达区域进行扩增,PCR产物电泳纯化后经双酶切和纯化获得138bp含H is2T ag序列的片段。将pS BET原核表达载体骨架和含有H is2T ag序列的片段进行连接后转入DH5α感受态细胞中,经菌落PCR及酶切筛选构建pS BET2H is。成功构建了pS BET2H is原核表达载体。应用该载体表达的蛋白质,可采用镍离子亲和层析法进行纯化。该研究为应用pS BET2H is载体进行烟草丛顶病毒ORF4的原核表达研究奠定了基础。

关键词　原核表达载体;pS BET2H is;构建

中图分类号　Q936　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2007)27-08443-01

Study on the Construction of P rok aryotic E xpression V ector pSBET2H is in E.coli

CHEN Zheng2bin et al　(Y unnan Institute of T obacco Science,Y uxi,Y unnan653100)

Abstract　T he aim of the research was to construct prokary otic ex pression vector pS BET2H is.D ouble restriction2enzym e digestion was conducted on pS BE2 T a plasm id by restriction end onucleases Xba I and Bam H I to obtain the fram ew ork of the prokary otic ex pression vector.W ith pET28a(+)as tem plate, T7ex pression region of pET28a(+)vector was am plified w ith T7prom oter prim er and T7term inator prem ier by high fidelity PCR.D ouble restriction2en2 zym e digestion and purification of PCR products were conducted to obtain the fragm ent of138bp that contained H is2T ag sequence after electroph oresis pu2 rification of PCR products.T he fram ew ork of prokary otic ex pression vector pS BET and the fragm ent that contained H is2T ag sequence were ligated and trans form ed into DH5αcom petent cell,and pS BET2H is was obtained through colony PCR and enzym e2digestion screening.Prokary otic ex pression vector was constructed success fully.T he proteins ex pressed by this vector could be purified by Ni ion affinity chrom atography m eth od.T he research laid the foundation for studying prokary otic ex pression of tobacco bushy top virus ORF4w ith pS BET2H is vector.

K ey w ords　Prokary otic ex pression vector;pS BET2H is;C onstruction

　　通过大肠杆菌原核表达制备植物病毒的蛋白,从而制备抗血清用于植物病毒的诊断和植物病毒的蛋白功能的研究,近年来取得了广泛的进展[1-2]。pET系列原核表达载体具有表达效率高、表达蛋白便于检测和纯化等优点,得到了广泛的应用。在许多真核生物以及植物病毒的蛋白基因序列中,编码精氨酸的密码子AG A和AGG使用频率很高,但是在大肠杆菌中这两种精氨酸密码子的使用频率最低。原核表达包含两个以上连续的AGG或AG A密码子,常导致产生截短的表达蛋白产物。为了解决上述问题,S chenk等构建了pS2 BET系列载体,该载体包含一个arg U基因和pET3系列原核表达载体的多克隆位点,可使许多植物病毒基因得到高效表达[3-4]。在研究烟草丛顶病毒基因组编码蛋白的原核表达过程中,笔者结合pET28a(+)和pS BET表达载体的优点,改造pS BET载体,构建了pS BET2H is原核表达载体。

1　材料与方法

1.1　表达载体及菌株　pS BET a载体由德国马普研究所

H ans2H enning S teinbiss博士惠赠;pET28a(+)载体购自N o2 vagen;核酸纯化、质粒提取试剂盒购自Qiagen;性内切酶和其他工具酶及连接试剂盒购自T akaRa;实验所用引物由T akaRa公司合成;E.coli DH5α由实验室保存。

1.2　pSBET原核表达载体骨架的制备　pS BET a质粒经过Xba I和Bam H I性内切酶双酶切,酶切产物经过1%琼脂糖凝胶电泳后应用Qiaquick gel extraction kit纯化质粒的大片段骨架。

1.3　含有H is2T ag序列片段的制备　以pET28a(+)为模版,应用T7prom oter引物和T7term inator引物利用高保真PCR方法扩增pET28a(+)载体的T7表达区域。PCR产物电

基金项目　云南省烟草公司科技项目(04A18)。

作者简介　陈正斌(1978-),男,山东德州人,在读硕士,助理研究员,从事植物病毒学研究。3通讯作者,E2m ail:tanzhx@gm ail.com。收稿日期　2007205231泳纯化后经Xba I和Bam H I性内切酶双酶切,产物经电泳纯化获取138bp的片段,即为含H is2T ag

序列的片段。

图1　pSBET2H is原核表达载体构建流程

1.4　pSBET2H is原核表达载体的构建　将双酶切产生的pS2 BET原核表达载体骨架和来自pET28a(+)原核表达载体的含有H is2T ag序列的片段以DNA试剂盒进行连接,连接产物转入DH5α感受态细胞中,产生的菌落通过菌落PCR进行筛

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安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.Sci.2007,35(27):8443,8446　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　孙红忠　责任校对　李菲菲

动物的致病性和毒力[13]。

该实验对PC V 22ZZ 毒株ORF2基因进行了序列分析比较,对于圆环病毒的流行病学和疫苗研究以及其抗原的变异

都有重要的参考价值。

图5　PCV 分离毒株ORF 2基因核苷酸的系统发育进化树

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(上接第8443页)

选。阳性菌落接种于LB (含K anamycin )培养基中培养,应用

Qiaprep m iniprep kit 提取质粒并进行性内切酶消化验证。2　结果与分析

2.1　PSBET 2H is 原核表达载体的构建　pS BET a 质粒经过

Xba I 和Bam H I 性内切酶双酶切,获得了pS BET 载体的

骨架。应用高保真PCR 法扩增了pET 28a (+)的T 7表达区域。经过Xba I 和Bam H I 性内切酶双酶切获得了138

bp 的含有H is 2T ag 序列的插入片段。将上述两个片段连接

后,转化大肠杆菌,经过菌落PCR 及酶切筛选获得了改造的

pS BET 载体,命名为pS BET 2H is (图1)。

2.2　pSBET 2H is 原核表达载体的应用前景　一些真核生物

以及植物病毒的蛋白质在大肠杆菌中原核表达时常出现表达量不足的情况,pS BET 载体被广泛应用于植物病毒基因组编码蛋白的原核表达和制备,获得了很好的效果[3-4]。但是

pS BET 载体也存在表达产物纯化不方便,纯化产物纯度不高

的缺点。pET 28a (+)载体中有编码H is 2T ag 的序列,可表达出与H is 2T ag 标签融合的蛋白。H is 2T ag 不改变融合蛋白的结构和功能,融合有H is 2T ag 标签的蛋白在变性和非变性条件下

都可方便地应用镍离子亲和层析的方法进行纯化。笔者用

pET 28a (+)载体上Xba I 和Bam H I 酶切位点之间含有H is 2T ag 序列的片段置换pS BET a 载体的相应部位,成功构建了pS BET 2H is 原核表达载体。pS BET 2H is 载体保留了pS BET 载

体的优点,又增加了新的特性,即拥有H is 2T ag 序列,从而使应用该载体表达的蛋白质可采用目前成熟的镍离子亲和层析的方法方便地进行纯化。pS BET 2H is 载体可以在表达一些用其他的原核表达载体时产量较低的真核生物和植物病毒基因组编码的蛋白质时作为候选载体使用。笔者应用pS BET 2H is 载体,对烟草丛顶病毒的ORF4进行了原核表达研究。参考文献

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