RT-PCR实验指导

RT-PCR，反转录聚合酶链式反应，是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增相结合的技术。提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo dT或随机引物经过反转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。

RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。

实验前准备

在开始实验前，需准备好实验所用的试剂，如0.1%DEPC溶液，Trizol，氯仿，异丙醇，DEPC水配制的75%乙醇，无RNase-free的纯水，反转录试剂盒、dNTP mix, Taq酶, buffer、凝胶电泳缓冲液等。

本次实验所涉及到的仪器和耗材有：Thermo Scientific 全波长扫描式多功能读数仪，Thermo Scientific Arktik PCR仪以及F1系列单道移液器和QSP盒装吸头。冷冻离心机，水平电泳槽，电泳仪，离心管，PCR管。

首先提取正常小鼠和肝癌小鼠模型的肝脏总RNA，检测其浓度后进行反转录获得cDNA。再以cDNA为模板，通过PCR反应扩增获得大量的p53基因。

引物设计

本实验使用Oligo 6软件设计p53引物。首先登陆NCBI，输入p53的登陆号M13874，获得其CDS等详细信息。复制序列，保存为.seq格式。打开Oligo6软件，打开刚保存的文件，出现Tm、Frq和ΔG窗口。点击Search，选择Primers and Probes，出现Search for Primers and Probes窗口。在该窗口内点击Search Ranges，设置引物搜索范围，上游引物：1-53bp；下游引物：1200-1302bp，产物长度为1000-1200bp，点击ok。点击Parameters，进行更多参数的设置，无特殊需要，可默认，确定完成，开始搜索。在新出现的Search Status窗口点击ok 可见搜索结果。点击任意一对引物，可在PCR窗口中查看引物的信息。根据GC 含量和Tm值，确定比较适合的引物，并保存序列。

总RNA提取

在装有新鲜动物肝脏组织匀浆中加入相应体积的预冷Trizol，每50-100ng

样品加1ml Trizol，充分混匀。静置10min，12000rpm，4°C离心15min。

再加入1/5 Trizol体积的氯仿，用力颠倒混匀，室温放置3min，可见分层，如此重复几次使液体充分分层。12000 ×g，4°C离心15 min。离心后，溶液分为有机相和水相，中间有一层蛋白质层，RNA在上层水相层。

小心地吸取上清，移入新的离心管中。

加入1/2 Trizol体积的预冷的异丙醇，混匀后室温静置10 min。12000×g，4°C 离心10 min后，可见沉淀。

小心地彻底弃上清。将离心管置于离心机中离心数秒，再用移液器小心吸去残留液体。加入1倍Trizol体积的75%乙醇，来回颠倒混匀，使沉淀悬浮，以确保洗涤干净。7500×g，4°C离心5min。小心地弃上清。若沉淀量较大可洗涤两次。将离心管置于离心机中离心数秒，再小心地用移液器吸取残留液体。若看不见沉淀，则不要用移液器吸。

室温静置5-15 min以干燥RNA沉淀。用无RNA酶的纯水溶解RNA沉淀。

DNA浓度监测

本实验通过Thermo Scientific 全波长扫描式多功能读数仪进行RNA的纯度和浓度检测。

在定量模块中点上2μl的空白对照和实验获得的RNA样品，设置两组重复对照。将定量模块放进读数仪的机仓中，打开软件，点击ok进入，选择New Session，创建新文件。进入Plate Layout界面，点击Wizard编辑样品孔。设置1个空白对照和2个待测样品，两组重复。点击Protocol，设置测定波长230、260和280nm 的光密度值。点击Result，将结果显示设置为260/280和260/230的值。设置完毕后，点击保存。点击连接，运行。结果输出后，可下拉菜单查看230、260、280的OD值。点击Purity_260_280，查看260比280的值。点击Purity_260_230，查看260比230的值。点击出仓，取出定量模块。

反转录反应

先配置NTC对照，加入10μl水、1μl oligo dT引物、2μl随机六聚体引物。

接下来是1号和2号管的配置，依次加入1μl总调整好浓度的RNA、1μl oligo dT引物、2μl随机六聚体引物、最后加9μl水补充至总体积13μl。

设置好反转录程序，先在PCR仪中65°C，反应5min，可有效减少RNA的二级结构。加热后迅速置于冰上。

反应后，在上述的mix中分别加入5×Reverse transcriptase buffer 4 μl，dNTP mix 2μl，40 U/μl的RNase Inhibitor 0.5μl，20 U/μl的Reverse transcriptase 0.5μl。小心混合反应mix。切勿涡旋混匀！混匀后于瞬时离心机上短暂离心，使样品和反应液落至离心管底部。

将离心管放入Thermo Scientific Arktik PCR仪中，25℃反应10min，55℃反应30min。反应完毕后，于85℃下加热5min灭活反转录酶，再置于冰上停止反应，直接进入PCR反应。

PCR扩增

先进行PCR反应体系的配制，在PCR管中加入10× Taq buffer 2μl，l2.5U/μ的Taq 酶0.3 μl，25mM MgCl2 1.2 μl，10mM dNTP 0.2 μl，l10 p m/μl的上游和下游引物各0.3 μl，cDNA模板1-10μl，最后用无RNase-free纯水调整至20 μl。

混匀后离心5s，将PCR管放入Thermo Scientific Arktik多功能PCR仪进行扩增。

调用PCR程序，95°C预变性5 min ，94°C变性30s，55°C退火40s ，72°C 延伸30s，28-36 Cycles，72°C 7 min, 12 °C保存。扩增结束后，取出PCR管，可进行电泳检测。

凝胶电泳检测

制备1%的琼脂糖凝胶，在锥形瓶中加入0.3g琼脂糖和30ml TAE缓冲液，盖上保鲜膜，微波炉加热至琼脂糖全部融化。待混合物冷却至50-60°C时，将其倒入胶槽中。

凝胶凝固后，轻轻拔去梳子，将胶放入电泳槽中，并倒入适量的TAE缓冲液。将样品和Loading Buffer混匀后，加到上样孔中，并点上2μl的Marker。90V 恒压电泳，指示剂迁移至凝胶的2/3处，即可停止电泳。

取出凝胶，置于EB中浸泡20min后凝胶扫描仪下查看电泳结果。

结果分析

Total RNA 样品质量良好，条带清晰，无蛋白、DNA、有机溶剂、盐离子的污染，OD260/280的值在1.8至2.1 范围内。

NTC中没有cDNA模板，扩增无产物。p53在正常小鼠和肝癌小鼠模型中均有表达，且表达量不一。可通过测序进行后续分析。

疑问解答

实验结束了，现在进入疑难解答时间

Doctor A，为什么RNA总是容易被降解呢？

单链的RNA本身就不稳定，易于降解，而RNA酶几乎无处不在，且特别稳定，故在提取RNA时关键因素是最大程度的避免外源RNA酶的污染和抑制内源RNA酶的活力。因此，创造一个无RNA酶的环境，严格防止RNA酶污染是成功提取RNA的关键。所有实验过程中，要使用无RNA酶的试剂耗材，避免在人多的地方进行实验。戴口罩戴帽子，每一个步骤都要对手套进行消毒。

对于刚接触RT PCR的新手，该怎么样来判断RNA的质量？

RNA样品电泳后，可见28S、18S和5S的小分子条带，则说明RNA完整性较好，否则可能被降解。28S和18S比值约为2.1，表明RNA无降解。如比值逆rpm，表明RNA降解。此外，可通过RNA定量来检测。RNA在260nm波长有最大的吸收峰，可通过公式计算浓度。RNA纯品的OD260比OD280的比值为2.0，可根据该值估计RNA纯度。若比值较低，说明有残余的蛋白质存在。比值过高，则提示RNA有降解。