兰花生物工程研究进展

第一作者简介:丁兰(19—

),女,四川德阳人,讲师,硕士.主要研究方向为细胞生物学及植物组织培养.

・科研综述・

兰花生物工程研究进展

丁　兰1,付庭治2

(1.西北师范大学生物系,甘肃兰州　730070; 2.南京大学生物系,南京　210093)

摘　要:对兰花组织培养的历史和进展作了扼要综述.着重阐述了外植体取材、培养基、激素等因素对外植体培养、原球茎增殖及芽分化的影响,并介绍了兰花种子离体萌发技术、兰花原生质体培养、原生质体融合及基因工程的研究进展情况.

关键词:组织培养;外植体;原球茎;培养基;离体萌发;基因工程

中图分类号:Q 819;S 682131　　　文献标识码:A 　　　文章编号:10012988Ⅹ(2000)0320111206兰科是显花植物中最大的科之一,大约有500多个属,20000多个种,分布于世界各地.大多数种类分布于东南亚、澳大利亚、中南美洲、非洲和马达加斯加.

兰花是珍贵的观赏花卉,此外还有作为药用的天麻、白芨、红门兰等和作为香料的香籽兰等,有极高的经济价值.由于兰科植物在自然状态下繁殖困难,种子萌发率极低,故传统栽培靠分株繁殖,因而繁殖周期长,繁殖率低,育种进程缓慢.另外,由于长期无性繁殖,造成带病毒的植株日益增多,使兰花的优良品质下降.因此,兰花的生物工程技术格外引人注目.

生物工程技术可用于兰花的快繁、品种复壮、优良品种的培育等,在加快育种进程、挽救珍稀濒危的种类等方面具有重要作用.利用这些技术进行大规模的兰花工业化生产取得了巨大的经济效益,目前已在世界范围内形成了高效益、大规模的兰花工业.

1　兰花的组织培养技术

兰花的组织培养始于20世纪60年代.M orel 采用大花蕙兰的茎尖,在含有细胞素的K C 培养基上进行培养,茎尖分生组织膨大形成原球茎,并分化出根和叶,首次获得兰花无病毒小植株[1]

.Wimber 对M orel 的方法进行了改进,采用液体振荡培养的方法,大大加

快了原球茎增殖的速度,短期内可获得大量再生植株[2].此后,组织培养技术在兰花生产

上得到了广泛应用,目前大约已有60余属数百种兰花可以用组织培养的方法进行繁殖.111　兰花组织培养程序

外植体(茎尖、侧芽、花梗、叶片等)→诱导形成原球茎→原球茎大量增殖→芽诱导及丛芽大量增殖→育苗培养→温室移栽.

112　不同外植体的培养

茎尖是最早用于兰花快速繁殖的外植体.国际上最具商业价值的几个大属的兰花,如大花蕙兰(Cymbidium )、卡德丽亚兰(Cattleya )、石斛兰(Dendrobim )、蝴蝶兰(Phalaeanopsis )、111　第36卷2000年第3期　　　　　西北师范大学学报(自然科学版)

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文心兰(Oncidium )等首先在茎尖培养中取得成功.侧芽应用也相当广泛.学者们对茎尖及侧芽的取材季节、最适取材部位、大小等进行了深入研究,一般认为带1～2个叶原基的茎园

锥成活率高[3],中间部位侧芽成活率及生长率较高.但兜兰(Paphiopedium )的培养极为困

难,至今有关报道极少.

特别值得一提的是中国兰的芽端组织培养.中国兰指蕙兰属的部分地生兰种,其栽培历史已有千年,有许多名贵珍稀品种.近10年来,我国学者在中国兰的培养中取得了一些成就,先后在建兰、春兰、墨兰等几十个品种的芽端培养中获得成功.吴汉珠等对素心兰等

20个品种进行培养,有11个品种建立了快速无性繁殖系[4].据吴汉珠等3年的统计,国兰

诱导启动后,褐化死亡几乎占3/4.因此,解决褐化问题是中国兰组织培养的关键所在.

尽管顶芽和侧芽是极好的高质量外植体,但芽的来源有限.尤其是蝴蝶兰、万代兰(Vanda )、仙人指甲兰(Aerides )等80多个属的兰花只生一茎,摘取茎尖就有可能丧失母株,这对于珍稀品种来说损失很大.因此,人们倾向于在更大范围寻找外植体.

用叶片作为外植体可以减轻或避免对母株的伤害,而且叶片数量多,取材又不受季节的影响,是较理想的外植体.大多数以叶片为外植体的成功报道是取试管苗的幼叶为培养材

料,从成熟植株上取幼叶为外植体培养成功的报道不多.Vij [5]和王怀宇[6]曾相继报道,啄

蕊兰(Rhynchostylis retusa )、蝴蝶兰试管苗幼叶原球茎发生率可达30%,而成熟幼叶对诱导反应极弱.C om pto 和Preece 指出,成熟植物组织向培养基中释放高浓度的抑制生长的物质,

严重影响兰花组织的存活[7].尽管如此,肾药兰成熟植株最上面3片幼叶在培养中却显示

出明显的增殖能力,在10～12周内基部分化出芽,但不产生原球茎.Seeni 和Latha 采取单

叶片不切割,基部向下插入培养基内的方法,减小了创伤面,较大程度减弱了褐化[8].

在过去的一个世纪,植物学家们认为根顶端分生区是由高度决定的细胞构成,按照Peters on 的芽根形成观点,根分生组织转化为芽体的可能性极小.Stewart 和Buttor 用树兰等材料进行培养,首次成功地获得原球茎[9]

.虽然仅从愈伤组织分化出一个植株,但此后这

一领域得到许多学者的关注,根培养相继在不同兰花中获得成功[10～14].

大部分兰花具有总状花序,花梗上的花芽较多,取材方便,不伤母株.目前报道最多的是花梗培养,以花瓣、萼片、子房为外植体的报道较少.幼嫩花梗腋芽可直接诱导丛生芽(王怀宇)[6],也可用花梗薄切片(林其金)[3]从切口处诱导原球茎,诱导率因花梗取材部位不同而有差异.除蝴蝶兰外,花梗培养已在万代兰[15]、树兰[16]、石斛兰[16]、文心兰[17]等属中获得成功.花梗培养已成为目前兰花繁殖的主要手段.

113　培养基与激素

用于兰花组织培养的培养基种类繁多,所含成分有无机盐类、维生素类、激素、氨基酸、核苷酸以及复合添加物.具体含量根据需要不尽相同.常用基本培养基有:K C 、MS 、VW 、BM 及其改良型.

激素浓度、种类及不同组合对外植体的诱导和原球茎的增殖及分化起着主导作用.K T

和NAA (或I AA )配合使用对啄蕊兰叶片诱导效果极好[5].Mroginiski 等在Arachis 杂种幼叶

培养中用同样的激素组合得出了相同的结论[18].Seeni 和Latha 提出,BA 在兰花组织培养中

对叶诱导与芽增殖起着重要作用[8].谷祝平报道,较高浓度的BA 能促进大花蕙兰原球茎的

增殖,较低浓度BA 促进原球茎分化[19].据有关资料,洋兰的组织诱导、原球茎增殖及分化

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一般需用较高浓度细胞素与低浓度生长素的配合.但在中国兰芽端诱导培养中,生长素使用浓度范围较大(110～510mg/L ),生长素浓度一般高于细胞素,NAA 诱导效果好于2,42D 和I BA.吴汉珠等用MS 附加015mg/L BA 和110mg/L NAA 对素心兰等20个品种诱导成功,在根状茎诱导芽分化时需提高BA 浓度(012mg/L ),降低生长素浓度(NAA 012mg/L )[4],这与洋兰诱导启动及芽分化时激素浓度使用相反.

生长素在根培养中是必需的.K erbauy 在卡德丽亚兰杂种根尖培养中进一步强调了生长

素参与的重要性,并指出2,42D 对愈伤组织的产生起着主导作用[20],单独使用NAA 及I AA

时,仅对根尖的延长生长有促进作用.这与Oncidium varicosum 的根尖培养反应一致[12].

2　兰花种子离体萌发技术

211　共生萌发法

　　兰科植物的种子极小,但荚果产生的种子数量极多,约104～106粒.兰科植物种子从结构上可分为两个主要类型:少数种类的种子的胚初步分化,具有一个发育不全的子叶,这类种子比较容易萌发;绝大多数种类的种子不具子叶和胚乳,在自然条件下极难萌发.因此,人们对兰花种子萌发经历了一个较长的认识过程.

19世纪前,兰花种子萌发还不为人知,有人甚至认为兰花种子是不能萌发的

[21].Link 早在1824年观察到,自然条件下的兰花种子萌发总伴随着真菌感染现象[22],但并未引起足

够重视.Noel Bernared 在19年首次认识到真菌的真正作用及重要性.他认为真菌的浸染可能对兰花种子萌发是必需的.后来他用从相关种类纯化的真菌感染种子,种子萌发良好,幼苗发育正常,由此创立了共生萌发法.他指出,自然条件下兰科植物的种子萌发需要适宜的真菌的感染,真菌与种子之间建立了一种共生关系,种子从感染的真菌得到了萌发所需的养分[23]

.许多学者进一步发展了这一实用技术,并在生产中大量应用,同时从理论上进行了多方面研究和探索,取得了可喜的成就.徐锦堂从天麻原球茎中分离出紫萁小菇(Mycana

osmudicola ),用天麻种子伴该菌播种后,萌发率可达20%以上[24,25],大大促进了天麻的人工

载培.郭顺星等对白芨种子的共生萌发进行了研究,伴菌后的种子萌发率、原球茎和营养器

官生长速率显著高于对照,并且成苗整齐,植株健壮[26].由于共生萌发需先分离出相应的

真菌,分离程序繁杂,目前已很少使用,替而代之的是非共生萌发法.

212　非共生萌发法

Bernard 以Ophrys L 1的块茎配制培养基,使卡德丽亚兰与蕾丽亚兰杂交种子成功萌发,

开创了非共生萌发的先例[27].随后,其他研究者用非共生萌发法也使不同种类的兰花种子

萌发,并得到了正常的种苗,其中有齿瓣兰、蝴蝶兰、石斛兰、文心兰等[28].随着兰花工

业的发展,兰花属间和种间杂种大量出现.研究者们尝试改进K nuds on 的培养基,以适合不同属种的兰花的需要,进一步提高萌发率及促进种苗的生长发育,因此设计了上百种种子及种苗培养基.无菌萌发简化了萌发及育苗技术,有很大的实用价值,极大地推动了兰花工业的发展.

兰花种子成熟较慢,一般在受粉后几个月方能成熟.有关资料显示,某些种类的未成熟或接近成熟的种子就可收获播种培养,甚至比成熟种子更容易萌发[29].一般认为,这些种类的种子一旦成熟就可能进入休眠期,或随着种子的成熟成活率降低.仙人指甲兰、白拉索

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兰、布鲁通氏兰、卡德丽亚兰、厚杯兰、树兰、文心兰、蝴蝶兰、肾药兰和万代兰等10个属的19个种和15个杂交种的萌发实验证明,未成熟种子的确能很好萌发,最短接种时间为授粉后40～85d.但如果种子胚珠发育不全就不能萌发生长[30].

许多实验证实,播种前对种子进行适当的预处理可以提高种子萌发率.这种方法主要是针对萌发难度较大的地生兰种类,对于那些比较容易萌发的附生兰或半附生兰,预处理意义不大,而且不适当的处理会损伤种子,还会影响到种苗的生长发育.预处理方法多种多样,可以用物理方法,即用剪刀剪破种皮和用超生波处理种子;或用化学方法,即用不同种类及不同浓度的溶液浸泡种子,时间不等.田梅生等用剪刀将四季兰种子种皮剪破后再进行无菌培养,结果萌发率大大提高[31].段金玉等对兰属10种植物种子离体萌发进行研究,发现用

011m ol/L NaOH 溶液处理多花兰、朵朵香、双飞燕、豆瓣绿、寒兰、套叶兰等,时间为10～30min ,效果很好,萌发率可提高10倍以上[32].也有人用蔗糖溶液、H 2O 2等处理种子.

一般认为,兰科植物种子难以萌发,一方面是由于胚发育不全或无胚乳,另一方面是由于种皮阻碍了空气和水的透入,并且种子中很有可能存在ABA 等阻碍萌发的化学物质.预处理在一定程度上消除了这些障碍,但其机理还有待进一步研究.

目前看来,大部分兰花种子可以通过无菌萌发的方式进行萌发,只是萌发率各有所不同.气生兰及杂交后代萌发力较强,这类种子无菌萌发技术已基本成熟.地生兰种子的萌发率普遍较低,包括中国兰在内,仍待进一步研究.由于目前兰花优良品种的获得主要还是用传统的遗传育种的方法,即通过有性繁殖的方式获得种苗,因此,种子离体萌发技术的研究显得尤为重要.

213　兰花原生质体培养,原生质体融合与基因工程

兰花原生质体培养及融合不仅给细胞壁及细胞膜相关的基础性课题提供了良好的材料,开辟了新的研究途径,而且倍受日益发达的兰花产业的关注.因为通过这种技术能够培养远缘杂交产生的新品种,尤其是利用基因工程技术得到转基因兰花,不论对植物生物工程研究还是对兰花产业的发展都有不可估量的价值.

事实上,作为单子叶植物的兰花,原生质体培养和融合与双子叶植物相比所取得的成功非常有限.目前,已从卡德丽亚兰、石斛兰、蕙兰、蝴蝶兰等十几种兰花分离得到原生质体.外植体的来源有根、叶、原球茎、花瓣等,不同的外植体难度各有不同.

兰花原生质体的融合比原生质体的分离培养难度更大,成功报道很少.Neuman 先后用蝴蝶兰、石斛兰、肾药万代兰为材料,得到3%～5%的融合原生质体.的Chen W H 等从几种蝴蝶兰的根、叶、花瓣、原球茎得到了大量的原生质体

[33].试验证实,从试管苗幼叶能得到高质量的原生质体,存活率约90%,通过电融合,融合率达10%.研究者们还从酶液、培养方式及培养基的选择等方面进行了有益的探索.

兰花基因工程起步晚,进展缓慢,主要是因为兰科植物对根癌农杆菌或发根农杆菌不敏感,缺乏合适的载体,而一些直接转移的方法如PEG 介导和电激法成功率又不高.但Y ang H H 等从一种石斛兰分离出了色素合成基因,并且得到了高度表达.他们还成功地克隆了蕙兰花叶病毒外壳蛋白基因,用电子轰击法将这一基因导入兰花的原球茎和愈伤组织,得到较高的转化表达[34],给兰花基因工程带来了希望.

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DI NGLan 1,FU T ing 2zhi 2

(1.Department of Biology ,N orthwest N ormal University ,Lanzhou 730070,China ;

2.Department of Biology ,Nanjing University ,Nanjing 210093,China )

Abstract :The history and development of study on tissue culture of orchid are summerized.E ffects of explants ,media ,growth regulators on culture of explant ,multiplication of P LBs ,differentiation of shoots and the seed germination of orchid in vitro ,and the progress on orchid protoplast culture ,protoplast fusion ,orchid genetic engineering are introduced.

K ey w ords :tissue culture ;explant ;P LB ;medium ;germination in vitro ;genetic engineering

(责任编辑　孙晓玲)　

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